微量蛋白检测方法

摘要

一种微量蛋白检测方法，包括：配置抗血清处理液、配置反应缓冲液;采用抗血清处理液将抗血清稀释到1-2mg/ml，室温放置后，放置4℃温度环境保存；在反应器皿中加入反应缓冲液，然后加入检测样本，并加入抗血清处理方法处理后的抗血清形成反应溶液；对反应溶液进行测试，读取检测样本的反应幅度；利用不同浓度的校准液定出标准曲线并进行非线性拟合；上述的微量蛋白的检测方法，将处理后的抗血清，采用放置在室温中以使抗血清处理液中的各种组分与抗血清中的抗体充分作用，室温的条件对于抗体来说条件相对温和，有利于抗体与抗血清处理液中各种组分的充分作用；同时经抗血清处理液及处理方法处理后的抗血清稳定性良好，4℃储存条件下放置一年，活性不会降低。

权利要求

1.一种微量蛋白检测方法，其特征在于，包括：

配置缓冲液:配置抗血清处理液、配置反应缓冲液；所述抗血清处理液：20mM，PH7.0-7.8的磷酸盐缓冲液+150mM的NaCl溶液+40mM的Gly；所述反应缓冲液：20mM，PH7.0-7.8的磷酸盐缓冲液+30-100mM的NaCl溶液+0.01-0.5质量百分比的鱼明胶；

抗血清处理：采用抗血清处理液将抗血清稀释到1-2mg/ml，室温放置12-24小时后，放置2-8℃温度环境进行保存；

反应操作：在反应器皿中加入反应缓冲液，然后加入检测样本，并加入抗血清处理方法处理后的抗血清形成反应溶液；

反应分析：通过蛋白分析仪对反应溶液进行测试，读取检测样本的反应幅度；

标准曲线拟合：利用不同浓度的校准液定出标准曲线，并对标准曲线进行非线性拟合。

2.根据权利要求1所述的微量蛋白检测方法，其特征在于：所述抗血清处理过程中，采用抗血清处理液将抗血清稀释到1-2mg/ml后，室温放置12-24小时后，然后放置4℃冰箱环境进行保存。

3.根据权利要求1所述的微量蛋白检测方法，其特征在于：反应操作中，进一步为：在反应器皿中加入反应缓冲液，然后加入检测样本，将加入检测样本的反应器皿放置到蛋白分析仪的反应孔的对应位置，并加入处理后的抗血清。

4.根据权利要求3所述的微量蛋白检测方法，其特征在于：所述反应操作中，加入的反应缓冲液、检测样本、处理后的抗血清的体积比为400：20：40；反应分析进一步为：蛋白分析仪感应到处理后的抗血清从反应孔中加入到反应器皿后，自动进行测试，读取测试样本的反应幅度。

5.根据权利要求1至4任意一项所述的微量蛋白检测方法，其特征在于：所述反应操作中，空白时间为6-8秒，反应时间为122-124秒。

6.根据权利要求1至4任意一项所述的微量蛋白检测方法，其特征在于：所述蛋白分析仪采用检测波长为650-690nm，蛋白分析仪根据空白时间读取空白值、根据反应时间读出反应幅度。

7.根据权利要求1至4任意一项所述的微量蛋白检测方法，其特征在于： 所述对标准曲线进行非线性拟合进一步包括：利用不同浓度的RANDOX的mALB校准液，定出标准曲线，对标准曲线进行非线性、多次、分段拟合。

8.根据权利要求1至4任意一项所述的微量蛋白检测方法，其特征在于： 所述对标准曲线进行非线性拟合进一步包括：检测陡升线段或曲线，进行平滑曲线修正。

说明书

微量蛋白检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及临床检测技术，特别是涉及一种微量蛋白的检测方法。

背景技术

[0002] 正常人尿液中存在着白蛋白，但含量很低，一般小于30mg/24h尿液。当肾脏发生可逆性损伤时，尿液中的白蛋白会增高，一般在30-300mg/24h尿液，此时称为微量白蛋白尿，其测定对人体的早期肾损伤具有重要意义。

[0003] 由于目前市场上所用的mALB（尿微量白蛋白）的检测方法所检出的浓度范围在10-220mg/L左右，检出的范围偏窄；现有抗血清的处理方式导致抗血清的特异性不够强,检测结果受样本中mALB的浓度影响大；临床的尿液标本，尤其是肾病患者的标本，容易导致前带现象，形成结果的误判；另现有的标准曲线一般采用直线拟合，这种拟合方式不科学，导致某一段的检测值不准确。

发明内容

[0004] 基于此，有必要提供一种可较长时间保持抗血清活性的微量蛋白检测方法。

[0005] 一种微量蛋白检测方法，其特征在于，包括：

[0006] 配置缓冲液:配置抗血清处理液、配置反应缓冲液;

[0007] 抗血清处理：采用抗血清处理液将抗血清稀释到1-2mg/ml，室温放置后，放置2-8℃温度环境进行保存；

[0008] 反应操作：在反应器皿中加入反应缓冲液，然后加入检测样本，并加入抗血清处理方法处理后的抗血清形成反应溶液；

[0009] 反应分析：通过蛋白分析仪对反应溶液进行测试，读取检测样本的反应幅度；

[0010] 标准曲线拟合：利用不同浓度的校准液定出标准曲线，并进行非线性拟合。

[0011] 在优选的实施例中，所述抗血清处理过程中，采用抗血清处理液将抗血清稀释到1-2mg/ml后，室温放置12-24小时后，然后放置4℃冰箱环境进行保存。

[0012] 在优选的实施例中，反应操作中，进一步为：在反应器皿中加入反应缓冲液，然后加入检测样本，将加入检测样本的反应器皿放置到蛋白分析仪的反应孔的对应位置，并加入处理后的抗血清。

[0013] 在优选的实施例中，所述反应操作中，加入的反应缓冲液、检测样本、处理后的抗血清的体积比为400：20：40；反应分析进一步为：蛋白分析仪感应到处理后的抗血清从反应孔中加入到反应器皿后，自动进行测试，读取测试样本的反应幅度。

[0014] 在优选的实施例中，所述反应操作中，空白时间为6-8秒，反应时间为122-124秒。

[0015] 在优选的实施例中，所述蛋白分析仪采用检测波长为650-690nm，蛋白分析仪根据空白时间读取空白值、根据反应时间读出反应幅度。

[0016] 在优选的实施例中，所述标准曲线拟合进一步包括：利用不同浓度的RANDOX的mALB校准液，定出标准曲线，对标准曲线进行非线性、多次、分段拟合。

[0017] 在优选的实施例中，所述标准曲线拟合进一步包括：检测陡升线段或曲线，进行平滑曲线修正。

[0018] 在优选的实施例中，所述抗血清处理液：20mM，PH7.0-7.8的磷酸盐缓冲液+150mM的NaCl溶液+40mM的Gly。

[0019] 在优选的实施例中，所述配置的反应缓冲液：20mM，PH7.0-7.8的磷酸盐缓冲液+30-100mM的NaCl溶液+0.01-0.5质量百分比的鱼明胶。

[0020] 上述的微量蛋白的检测方法，采用抗血清处理液处理后的抗血清，采用放置在室温中处理，使抗血清处理液中的各种组分与抗血清中的抗体充分作用，因为室温的条件对于抗体来说条件相对比较温和，对于抗血清处理液的各种组分来说温度不至于太低，从而有利于抗体与抗血清处理液中各种组分的充分作用；由于抗体与抗血清处理液中各种组分的充分作用，以使抗血清稳定性良好，2-8℃储存条件下放置一年，活性不会降低。

附图说明

[0021] 图1是本发明一实施例的线性范围图；

[0022] 图2是本发明中表6的灵敏度测试中的数据误差线。

具体实施方式

[0023] 本发明一实施例的微量蛋白检测方法，包括如下步骤：

[0024] 配置缓冲液:配置抗血清处理液、配置反应缓冲液;

[0025] 抗血清处理：采用抗血清处理液将抗血清稀释到1-2mg/ml，室温放置12-24小时后，以使抗血清处理液中的各种组分与抗血清中的抗体充分作用，然后放置2℃－8℃温度环境进行保存。进一步优选的，保存环境为4℃的温度环境。

[0026] 反应操作：在反应器皿中加入反应缓冲液，然后加入检测样本，并加入抗血清处理反应后的抗血清；

[0027] 反应分析：通过蛋白分析仪进行测试读取反应幅度；

[0028] 确定标准曲线：利用不同浓度的校准液确定标准曲线，并对标准曲线进行非线性拟合。

[0029] 优选的，采用抗血清处理液将抗血清稀释到1-2mg/ml，室温放置12-24小时后，放置4℃的冰箱中进行保存。抗血清处理液将抗血清稀释到1-2mg/ml，采用室温放置处理以使抗血清处理液中的各种组分与抗血清中的抗体充分作用，因为室温的条件对于抗体来说条件相对比较温和，对于抗血清处理液的各种组分来说温度不至于太低，从而有利于抗体与抗血清处理液中各种组分的充分作用。

[0030] 优选的，本实施例中，抗血清处理液：20mM，PH7.0-7.8的磷酸盐缓冲液+150mM的NaCl溶液+40mM的Gly。

[0031] 优选的，本实施例中，反应缓冲液：20mM，PH7.0-7.8的磷酸盐缓冲液+30-100mM的NaCl溶液+0.01-0.5质量百分比的鱼明胶。

[0032] 进一步，反应操作中，反应缓冲液、检测样本、抗血清处理反应后的抗血清的体积比为400：20：40。

[0033] 本发明一优选实施例中的反应操作的具体操作如下：在反应器皿（如反应杯中）加入400微升反应缓冲液；在装有缓冲液的反应杯中加入20微升的检测样本（如尿液样本）；将加入检测样本的反应杯放到蛋白分析仪的反应孔中，并加入40微升的处理后的抗血清即抗血清处理步骤处理后的抗血清。

[0034] 进一步，反应操作中，空白时间优选的为6-8秒，反应时间优选的为122-124秒。

[0035] 反应分析中，当反应杯放置到蛋白分析仪的反应孔中，蛋白分析仪检测到40微升处理后的抗血清从反应孔中加入后，蛋白分析仪进行自动测试，读出测试样本的反应幅度。

[0036] 本实施例中，抗血清优选的为，印度ADVY公司生产的抗血清。

[0037] 进一步，蛋白分析仪采用的检测波长，优选的为与反应溶液中抗原、抗体反应结合形成的颗粒大小直径相同或相近。优选的，蛋白分析仪采用检测波长为650-690nm。

[0038] 进一步，蛋白分析仪根据设置的空白时间读取空白值、根据设置的反应时间读取测试样本的反应幅度。

[0039] 进一步，本实施例的标准曲线拟合包括：利用不同浓度的RANDOX的mALB校准液，定出标准曲线。由于整体反应趋势，是不成线性的，本实施例中，对标准曲线采用拟合软件进行非线性、多次、分段拟合。根据拟合后的标准曲线的检测的线性范围可以达到5-330mg/L。

[0040] 抗原与抗体的理想反应结合过程，是一个平滑的曲线，但是由于各种因素的影响，在实际的反应过程中，抗原与抗体反应的曲线偶尔会出现某一段陡然升高的现象，从而会影响检测结果。优选的，本实施例中对标准曲线进行非线性、多次、分段拟合过程进一步为：检测陡升线段或曲线，对该线段或曲线进行平滑过渡曲线修正。从而最大限度消除这种影响，使拟合的曲线更准确，检测结果也更可靠。

[0041] 优选实施例1：

[0042] 本发明优选实施例1的微量蛋白检测方法，包括如下步骤：

[0043] 配置缓冲液:配置抗血清处理液：20mM，PH7.0-7.8的磷酸盐缓冲液+150mM的NaCl溶液+40mM的Gly。

[0044] 配置反应缓冲液：20mM，PH7.0-7.8的磷酸盐缓冲液+30-100mM的NaCl溶液+0.01-0.5质量百分比的鱼明胶。

[0045] 抗血清处理：采用抗血清处理液将抗血清稀释到1mg/ml，室温放置12小时后，以使抗血清处理液中的各种组分与抗血清中的抗体充分作用，然后放置4℃温度的冰箱中进行保存。本实施例中，抗血清优选的为，印度ADVY公司生产的抗血清。

[0046] 反应时间设置：设置空白时间为6秒，反应时间为122秒。

[0047] 反应操作：在反应杯中加入400微升反应缓冲液，然后加入20微升的尿液样本，将加入的尿液样本的反应杯放到蛋白分析仪的反应孔中，并加入抗血清处理过程处理后的40微升反应后抗血清。

[0048] 反应分析：蛋白分析仪感应到处理后的抗血清加入后，自动进行测试，根据设置的空白时间读取空白值，及根据设置的反应时间读取反应幅度。

[0049] 本实施例中，蛋白分析仪优选的选用深圳市锦瑞电子有限公司制造的蛋白分析仪。优选的，蛋白分析仪选用波长为650nm的检测波。

[0050] 确定标准曲线：利用不同浓度RANDOX的mALB校准液定出标准曲线，采用标准曲线拟合软件并对标准曲线采用非线性、多次、分段拟合，以使检测线性范围可以达到5-330mg/L。

[0051] 优选实施例2：

[0052] 本发明优选实施例2的微量蛋白检测方法，包括如下步骤：

[0053] 配置缓冲液:配置抗血清处理液：20mM，PH7.0-7.8的磷酸盐缓冲液+150mM的NaCl溶液+40mM的Gly。

[0054] 配置反应缓冲液：20mM，PH7.0-7.8的磷酸盐缓冲液+30-100mM的NaCl溶液+0.01-0.5质量百分比的鱼明胶。

[0055] 抗血清处理：采用抗血清处理液将抗血清稀释到2mg/ml，室温放置24小时后，以使抗血清处理液中的各种组分与抗血清中的抗体充分作用，然后放置4℃温度的冰箱中进行保存。本实施例中，抗血清优选的为，印度ADVY公司生产的抗血清。

[0056] 反应时间设置：设置空白时间为8秒，反应时间为124秒。

[0057] 反应操作：在反应杯中加入400微升反应缓冲液，然后加入20微升的尿液样本，将加入的尿液样本的反应杯放到蛋白分析仪的反应孔中，并加入抗血清处理过程处理后的40微升反应后抗血清。

[0058] 反应分析：蛋白分析仪感应到处理后的抗血清加入后，自动进行测试，根据设置的空白时间读取空白值，及根据设置的反应时间读取反应幅度。

[0059] 本实施例中，蛋白分析仪优选的选用深圳市锦瑞电子有限公司制造的蛋白分析仪。优选的，蛋白分析仪选用波长为690nm的检测波。

[0060] 确定标准曲线：利用不同浓度RANDOX的mALB校准液定出标准曲线，采用拟合软件或程序并对标准曲线采用非线性、多次、分段拟合，以使检测线性范围可以达到5-330mg/L。

[0061] 进一步，采用拟合软件或程序并对标准曲线采用非线性、多次、分段拟合具体为检测抗原与抗体反应过程中曲线上出现的陡升段，采用平滑过渡曲线进行自动修正。

[0062] 表1：检测的线性范围（抗血清优选的为印度ADVY公司生产）

[0063]

[0064] 本实施例中，对不同稀释浓度的抗血清的反应幅度做比较实验：

[0065] 表2：不同抗血清稀释浓度的反应幅度比较

[0066]

[0067] 对抗血清处理过程中，对稀释后的抗血清采用不同处理时间（室温放置时间）处理后的反应幅度比较：

[0068] 表3：抗血清不同处理时间反应幅度的比较

[0069]

[0070] 稳定性能测试：

[0071] 将处理后的抗血清在2℃－8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存12个月后，取到效期后的样本检测，分析与靶值的相对偏差情况。用RANDOX的mALB校准液对处理后的抗血清进行测试，重复检测10次，取平均数，然后计算与靶值的相对偏差。

[0072] 表格4-1：稳定性测试

[0073]

[0074] 表格4-2：稳定性

[0075]

[0076] 精密性测定：在重复性条件下，用RANDOX的mALB校准液对反应操作处理后的反应溶液进行测试，重复测定十次，然后计算不精密性和不准确度。

[0077] 表格5：不精密性以及不准确度数据表

[0078]

[0079] 灵敏度性能测试：用RANDOX的靶值为5mg/L的参考物质，对反应操作处理后的反应溶液进行测试，重复测定十次，计算方差。然后计算靶值加减两倍的方差的范围，且十次测定的所有值均在范围内。

[0080] 表格6：灵敏度

[0081]

[0082] 由表1、2、3、4-2、4-2、5、6以及图1和图2可以得出：

[0083] 本发明微量蛋白的检测方法，特别适合的尿微量白蛋白的检测，通过改进了抗体的处理方式、反应时间、反应缓冲液的组分、标准曲线的拟合方式，有效的减轻了前带现象，使mALB检测范围更宽可以达到5-330mg/L，检测的准确度大大提高，从而更有利于临床的诊断。

[0084] 同时，经本实施例抗血清处理液及处理方法处理后的抗血清稳定性良好，4℃储存条件下放置一年，活性不会降低。

[0085] 抗体各项性能指标突出：精密性：批内不精密性≤5%；批间不精密性≤6%；不准确度≤3%；灵敏度：可以检测出5mg/L的mALB浓度，且测出的浓度值都在±2SD内。

[0086] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。