一种小菜蛾提取物及其应用

摘要

本发明一种小菜蛾提取物及其应用，属于中药制剂发明及其制备方法技术领域。小菜蛾提取物是通过下述方法制备所得：(1)用带菌的小针斜刺小菜蛾幼虫的腹腔，刺激诱导抗菌肽的产生，刺伤后继续饲养24小时；(2)将小菜蛾用昆虫生理盐水提取，匀质机充分捣碎匀浆，匀浆液加入乙酸铵缓冲液，离心，搜集上清液；(3)将步骤(2)所得上清液粗滤，粗滤液精滤，滤液冷冻干燥，得到抗菌肽含量为1.5%～1.8%的小菜蛾提取物。本发明从小菜蛾中提取得到的含抗菌肽的原料药，通过非胃肠道和胃肠道途径给药，用于抗菌及抗肿瘤治疗，具有提取工艺简单、成本低、疗效好的特点。

权利要求

1.一种小菜蛾提取物，其特征在于，所述小菜蛾提取物是通过下述方法制备：(1)、用带菌的小针斜刺小菜蛾幼虫的腹腔，刺激诱导抗菌肽的产生，刺伤后继续饲养

24-48小时；

(2)、将小菜蛾用昆虫生理盐水提取，匀质机充分捣碎匀浆，匀浆液加入乙酸铵缓冲液，离心，搜集上清液；所述昆虫生理盐水中各物质的浓度为苯甲基磺酰氟10μg/ml、NaCl130mM、KCl5mM和CaCl21mM；

(3)、将步骤(2)所得上清液粗滤，粗滤液精滤，滤液冷冻干燥，得到抗菌肽含量为

1.5%～1.8%的小菜蛾提取物。

2.根据权利要求1所述的小菜蛾提取物，其特征在于：带菌小针所带菌种为大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。

3.根据权利要求1所述的小菜蛾提取物，其特征在于，小菜蛾用昆虫生理盐水提取的具体步骤为：将小菜蛾加入昆虫生理盐水，其中小菜蛾与昆虫生理盐水之间的重量与体积比为lg:(3-5)ml。

说明书

一种小菜蛾提取物及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于中药制剂及其制备方法技术领域。具体涉及小菜蛾提取物及其应用。

背景技术

[0002] 外伤感染是由病原微生物、寄生虫感染局部创伤所致的常见疾病。引起感染的因素种类繁多，外伤感染治疗周期普遍较长，给患者带来了诸多不便。目前治疗外伤感染的药物主要集中在抗生素类药物，治疗过程中往往伴随着副作用，比如药物的毒性反应、过敏反应、二重感染以及细菌耐药性的产生。抗菌肽在治疗这类疾病方面，具有非常明显的优势。

[0003] 肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肝癌两种，人们日常说的肝癌指的多是原发性肝癌。原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，根据最新统计，全世界每年新发肝癌患者约六十万，居恶性肿瘤的第五位。原发性肝癌按细胞分型可分为肝细胞型肝癌、胆管细胞型肝癌及混合型肝癌。按肿瘤的形态可分为结节型、巨块型和弥漫型。原发性肝癌在我国属于高发病，一般男性多于女性。我国是乙肝大国，我国的肝癌多数是在乙肝肝硬化的基础上发展而来，丙肝病人也在逐渐增加，乙肝后期也会发展为肝癌。目前我国发病人数约占全球的半数以上，占全球肝癌病人的55%，已经成为严重威胁我国人民生命健康的一大杀手，其危险性不容小视。目前肝癌治疗方式主要为手术治疗，射频消融、微波消融、高强度聚焦超声、动脉化疗栓塞、酒精注射、冷冻治疗、放疗、分子靶向治疗、免疫治疗和中医药治疗等，治疗成本高昂，给患者及家庭带来沉重的经济负担，而且目前尚无一种疗效确切的治疗办法，总体患病人数还会呈现上升趋势，肝癌仍将是危害人民健康的疾病之一。

[0004] 小菜蛾大多寄生在甘蓝、紫甘蓝、青花菜、薹菜、芥菜、花椰菜、白菜、油菜、萝卜等食用植物上，对农作物的生长造成危害。近年来，有关昆虫抗菌肽的研究越来越广泛，一些学者发现抗菌肽具有良好的抗菌活性。

发明内容

[0005] 本发明旨在从对农作物有害的小菜蛾中提取抗菌肽，通过适宜的给药途径进行给药，用于外伤感染治疗，且具有一定的抗癌活性。本发明通过药效学研究，确定了小菜蛾的活性成分，进而优化提取工艺得到简单易行的一种小菜蛾提取物的制备方法。然而，抗菌肽属于肽类成分，直接口服易被生物体内的酶水解而失活，使其应用受到极大限制。建立肽类药物的有效吸收途径成为关键,不仅要保证抗菌肽的稳定性，还需要有效防止药物在体内降解，以更好地发挥药物疗效。

[0006] 为了解决现有技术所存在的问题，本发明的一个目的在于公开了一种小菜蛾提取物。

[0007] 本发明的另一个目的在于公开了小菜蛾提取物的应用。

[0008] 本发明的技术方案如下：

[0009] 一种小菜蛾提取物，其中，所述小菜蛾提取物是通过下述方法制备：

[0010] (1)、用带菌的小针斜刺小菜蛾幼虫的腹腔，刺激诱导抗菌肽的产生，刺伤后继续饲养24-48小时；

[0011] (2)、将小菜蛾用昆虫生理盐水提取，匀质机充分捣碎匀浆，匀浆液加入乙酸铵缓冲液，离心，搜集上清液；

[0012] (3)、将步骤(2)所得上清液粗滤，粗滤液精滤，滤液冷冻干燥，得到抗菌肽含量为1.5%～1.8%的小菜蛾提取物。

[0013] 上述技术方案中所述的小菜蛾提取物，其中，带菌小针所带菌种为大肠杆菌或金黄色葡萄杆菌。

[0014] 上述技术方案中所述的小菜蛾提取物，其中，小菜蛾用昆虫生理盐水提取的具体步骤为：将小菜蛾加入昆虫生理盐水，其中小菜蛾与昆虫生理盐水之间的重量与体积比为lg:(3-5)ml，所述昆虫生理盐水中各物质的浓度为苯甲基磺酰氟10μg/ml、NaCl130mM、KCl5mM和CaCl2 1mM。

[0015] 上述技术方案中所述的小菜蛾提取物在制备治疗外伤感染药物中的应用。

[0016] 上述技术方案中所述的小菜蛾提取物在制备治疗外伤感染药物中的应用，其中，所述药物为医学上可接受的肠溶口服制剂或非胃肠道给药剂型，其中所述的肠溶口服制剂为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或滴丸；所述的非胃肠道给药剂型为注射剂、鼻喷剂、栓剂或口含片。

[0017] 上述技术方案中所述的小菜蛾提取物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

[0018] 上述技术方案中所述的小菜蛾提取物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其中，所述的肿瘤为肝癌。

[0019] 上述技术方案中所述的小菜蛾提取物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其中，所述药物为医学上可接受的肠溶口服制剂或非胃肠道给药剂型，其中所述的肠溶口服制剂为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或滴丸；所述的非胃肠道给药剂型为注射剂、鼻喷剂、栓剂或口含片。

[0020] 作为对本发明技术的延伸，本发明小菜蛾提取物原料药可以制成以下药物制剂：

[0021] 所说的药物制剂是肠溶口服制剂或非胃肠道给药剂型，其中所述的肠溶口服制剂包括片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂当中的任何一种；所述的非胃肠道给药剂型选自于注射剂、鼻喷剂、栓剂、或口含片当中的任何一种。

[0022] 抗菌肽属于肽类成分，为防止抗菌肽直接口服被生物体内的酶水解而失活，提高药物的稳定性，可考虑将抗菌肽制备成非胃肠道给药剂型，或采用肠溶材料制备成肠溶药物。

[0023] 本发明具有以下有益效果：

[0024] 1、本发明小菜蛾提取物与抗生素类药物相比具有用量少、毒副作用小、不易产生细菌耐药性等特点。

[0025] 2、本发明小菜蛾提取物采用现代提取工艺从昆虫体内直接提取，具有工艺简单、成本低、疗效好的优点。

[0026] 3、本发明在治疗外伤感染和抗肝癌所采用的提取物来源于对农作物有害的小菜蛾，其来源丰富，因此有效降低了药物的生产成本，降低了药物的价格，且具有与同类药物相近的临床治疗效果，减轻了患者及家庭的经济负担，而且将有害的资源变为对人类有益的药物，具有一定的社会和经济效益。

[0027] 4、本发明小菜蛾提取物及其制备方法，具有提取工艺简单、质量稳定可控、处方用量少、疗效高，给药方便，可有效预防和治疗外伤感染和肝癌。

[0028] 附图说明：

[0029] 1、图1为抗菌肽对照品(Cecropin)的高效液相色谱图；

[0030] 2、图2为本发明小菜蛾提取物的高效液相色谱图。具体实施方式：

[0031] 为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明作进一步的说明。

[0032] 实施例1：小菜蛾提取物的制备：

[0033] (1)、用带大肠杆菌的小针斜刺小菜蛾幼虫的腹腔，刺激诱导抗菌肽的产生，刺伤后继续饲养24小时；

[0034] (2)、将小菜蛾按重量与体积比为lg:3ml加入的昆虫生理盐水，所述昆虫生理盐水中各物质的浓度为苯甲基磺酰氟10μg/ml、NaCl 130mM、KCl 5mM和CaCl2 1mM，匀质机充分捣碎匀浆，匀浆液加入乙酸铵缓冲液在15000r/min，4℃离心20min，搜集上清液；

[0035] (3)、将步骤(2)所得上清液过滤，初滤液回滤，滤液冷冻干燥，即得小菜蛾提取物。

[0036] 实施例2：小菜蛾提取物的制备：

[0037] 本实施例与实施例1步骤相同，区别在于：用带金黄色葡萄球菌的小针斜刺小菜蛾幼虫的腹腔，继续饲养36h，将小菜蛾按重量与体积比lg:4ml加入昆虫生理盐水提取，匀浆，离心，过滤，冷冻干燥，即得小菜蛾提取物。

[0038] 实施例3：小菜蛾提取物的制备：

[0039] 本实施例与实施例1步骤相同，区别在于：用无菌小针斜刺小菜蛾幼虫的腹腔，继续饲养48h，将小菜蛾按重量与体积比lg:5ml加入昆虫生理盐水提取，匀浆，离心，过滤，冷冻干燥，即得小菜蛾提取物。

[0040] 实施例4：小菜蛾提取物鼻喷剂的制备：

[0041] (1)、取尼泊金乙酯0.5g溶解于100ml水中，加热至40～50℃使之全部溶解；加入丙二醇5ml，搅拌溶解，高压湿热灭菌，制成辅料溶液备用；

[0042] (2)、将实施例1～3中的小菜蛾提取物加入辅料溶液中，加水至全量，混匀，密封分装于定量喷雾器。

[0043] 实施例5：小菜蛾提取物鼻喷剂的制备：

[0044] 本实施例与实施例4步骤相同，区别在于：取尼泊金乙酯和尼泊金丁酯各0.25g溶解于100ml水中，加热溶解，加入聚乙二醇400 5ml,制成辅料溶液，加入小菜蛾提取物原料药，混匀，密封分装于定量喷雾器。

[0045] 实施例6：小菜蛾提取物注射用冻干粉针的制备：

[0046] 称取实施例1～3中的小菜蛾提取物，分装于安瓿瓶中，制成1mg/瓶的规格，封装，轧盖，注射前用生理盐水溶解、摇匀。

[0047] 实施例7：小菜蛾提取物肠溶胶囊剂的制备：

[0048] 在室温(25℃±1℃)下,取氯化钙溶液在磁力搅拌器上搅拌,用注射器逐滴滴入含实施例1～3中小菜蛾提取物的海藻酸钠溶液,即可得到白色凝胶状固体,继续在溶液中孵育(室温)15min左右,将微囊用纯水洗涤后过滤分离,冷冻干燥，过7号筛，装于肠溶胶囊壳中，共制成1000粒。

[0049] 实施例8：小菜蛾提取物口含片的制备：

[0050] 称取实施例1～3中小菜蛾提取物的原料药25g，甘露醇10g，糊精5g，羧甲基纤维素钠10g，蔗糖20g，加入70%乙醇适量制软材，制粒，干燥，整粒，再加入微粉硅胶5g，硬脂酸镁10g，薄荷脑10g，香精5g，混合均匀，压成100片。

[0051] 实施例9：小菜蛾提取物的复合胶束的制备：

[0052] (1)、将豆磷脂16.67g加入100ml石油醚中制成标准液，氮气吹干大部分溶剂，再放入真空干燥箱，常温条件下放置过夜，以除去微量的有机溶剂，制成脂膜；

[0053] (2)、将牛黄胆酸钠2g溶于100ml的PBS缓冲液（pH=6.5的磷酸盐缓冲液）中，制成所需的PBS溶液；

[0054] (3)、将脂膜与PBS溶液在45℃水浴中超声混合45min,即得空白磷脂/胆盐胶束溶液；

[0055] (4)、将5g小菜蛾提取物的干燥粉末加入到空白磷脂/胆盐胶束溶液中，充氮密封，置恒温磁力搅拌器上，均匀搅拌24h，得载药胶束，即小菜蛾提取物的复合胶束。

[0056] 实施例10：小菜蛾提取物口腔薄膜的制备

[0057] (1)将5g羟丙甲基纤维素，5g微晶纤维素，10ml丙二醇溶液加入100ml蒸馏水中，均匀搅拌1小时，得溶液1；

[0058] (2)、将10g小菜蛾提取物，2g薄荷醇，2g预糊化淀粉，10g羧甲基纤维素钠钠和5g聚乙二醇400在搅拌状态下加入100ml蒸馏水中，得溶液2；

[0059] (3)、将溶液1和2混合并搅拌1小时，放置除去气泡，涂布于平板玻璃上制膜，70℃干燥1小时，脱膜，剪成适当大小，封装于适宜包装材料中，即得。

[0060] 小菜蛾提取物中活性成分定量分析采用HPLC法

[0061] 色谱条件:

[0062] 色谱柱：Agilent Alltima C18（250mm×4.6mm,5μm）；

[0063] 流动相：0.05%三氟乙酸（TFA）溶液-甲醇-乙腈（95:2.5:2.5）；

[0064] 流速：1.0ml/min；

[0065] 柱温：25℃；

[0066] 检测波长：275nm。

[0067] 色谱图见图1和图2所示，其中图1为抗菌肽对照品，图2为供试品小菜蛾提取物，图1和图2中的1号峰为活性峰。

[0068] 以下通过本发明制备的小菜蛾提取物的药效学试验来进一步阐述本发明产物小菜蛾提取物在治疗外伤感染和肝癌中所具有的有益效果：

[0069] 试验例一、考察小菜蛾提取物对体外肝癌细胞的抑制作用：

[0070] 细胞株：人肝癌细胞HepGⅡ，由北京协和细胞库提供。

[0071] 药品及试剂：MTT（SIGMA,USA），DMSO（SIGMA,USA），胰蛋白酶（SIGMA,USA），RPMI1640(GIBCO，Invitragen co.，USA)，特级胎牛血清Fetal Bovine Serum（Hyclone）。

[0072] 仪器：超低温冰箱（Bio-Tek Instruments，Inooski，VT，USA）,pH计（Thermo orion，USA），超净工作台（FLC-哈尔滨东联仪器厂）。

[0073] MTT试验法：将肝癌细胞株按照常规方法培养传代，收集对数生长期细胞，调节单5
细胞混悬液浓度为1×10 个/ml。将细胞混悬液加入96孔板中，每个孔加入200μl。置于
37℃恒温培养箱中培养24h后，实验组加入不同浓度小菜蛾提取物，每个浓度设4个复孔，并设置相应的空白对照组及无细胞调零孔。细胞加药后在37℃，5%CO2条件下继续培养48小时，每孔加入20μl新鲜配制的5mg/ml四甲基偶氮唑盐（MTT）溶液，并在37℃，5%CO2条件下继续培养4h；小心弃上清，每孔加入150μl DMSO，置摇床摇匀30min，用酶标仪在492nm波长处检测各孔的光密度值（OD值），按下列公式计算肝癌细胞的生长抑制率。试验重复3次，结果见下表1。

[0074]

[0075] 表1不同浓度的小菜蛾提取物对人肝癌细胞HepGⅡ的抑制率

[0076]

[0077] 上述结果表明，本发明提供的小菜蛾提取物对人肝癌细胞HepGⅡ具有很好的抑制效果，呈现出一定的量-效关系，HepGⅡ的抑制率随小菜蛾提取物浓度的升高而升高，低浓度下细胞抑制率达到47.62±0.83，高浓度下细胞抑制率达到86.24±1.77。

[0078] 试验例二、小菜蛾提取物抗外伤感染试验：

[0079] 1、皮肤感染模型的制备：

[0080] 实验取皮肤无损伤健康SD大白鼠，环境适应性饲养3天后无异常，将大鼠脊柱两侧躯干部位皮肤用脱毛剂硫化钠脱毛，面积约3cm×4cm，(约占体表的10%)。用25℃生理盐水洗净脱毛剂，归笼观察24h，挑选皮肤无损伤、红肿、皮疹等异常现象的动物进行试验。采用戊巴比妥钠0.8g/kg腹腔注射麻醉大鼠，用碘酒消毒皮肤后，用手术刀在脱毛处切开
10
约2～3cm长、深及肌层的切口，然后在切口处接种浓度为1×10 个/L的金黄色葡萄球菌液0.1mL，造成局部感染。无刺激性纱布封闭固定48h后,除去固定物。记录感染面积(用透明塑料片覆盖溃疡面，用笔划出溃疡边缘，沿边缘剪下塑料片，置分度值为0.1mg的电子
2
天平称重，并按1cm 塑料片的重量，将其重量换算成面积)。阴性对照组仅作脱毛处理。

[0081] 2、动物分组、给药：

[0082] 将24只大鼠随机分为4组，每组6只，即小菜蛾提取物高剂量组(实验1组，以下简称为高剂量组)；小菜蛾提取物中剂量组(实验2组，以下简称为中剂量组)；小菜蛾提取物低剂量组(实验3组，以下简称为低剂量组)；万古霉素阳性药对照组(实验4组，以下简称为阳性对照组)。造模后48h开始用药：1、2、3组在右侧背部感染面上均匀喷药液5ml，左侧背部不给药作为空白对照，4组在溃疡面上均匀涂一薄层约1g乳膏，每日给药3次，连续10d。给药前、给药后第3天、第14天记录感染面积，计算皮肤外伤面积缩小百分率。第11天处死动物，切取部分皮肤感染处组织，用10%中性福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋，制片，苏木素伊红(HE)染色，光镜观察。

[0083] 表2促进皮肤溃疡面积缩小的百分率（%）

[0084]

[0085] 经组织病理学检查：创面组织切片HE染色，空白对照组创面可见感染；阳性对照组、中、高剂量组感染面呈现不同程度的肉芽组织增生状态，表皮再生，增生并覆盖创面。治疗后第l4天，高剂量组创面基本愈合，皮肤结构完整、上皮化较厚；中剂量组和阳性对照组创面基本愈合，但皮肤结构不如高剂量组；低剂量组未完全愈合，皮肤结构不完整、上皮化较薄。在大鼠外伤感染试验中，低、中、高剂量小菜蛾提取物，与空白对照组和阳性对照组相比，对炎性渗出物的吸收、肉芽组织的形成，表皮的增生，均有促进作用，说明小菜蛾提取物具有良好的抗外伤感染活性。

[0086] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。