刺参缓释型复方免疫增强剂的制备方法

摘要

一种刺参缓释型复方免疫增强剂的制备方法，药物按重量份数取黄芪、党参、防风、白术、金银花、连翘、酸枣仁、维生素C、松针粉、蚯蚓粉、葎草、辣蓼，以斜发沸石粉和面粉为缓释及粘结材料，药物呈微颗粒粉末状。每日按刺参饲料2%的重量比例添加，混匀投喂。优点是配伍合理，充分发挥了药物之间的协同互补作用，明显增强刺参的免疫力，大大降低刺参常见疾病的发生；无毒副作用，无抗药性，无污染；兼具营养价值且诱食性好，能提高刺参采食量，增进组织细胞分裂，有促生长作用；缓释剂型可使药物下沉快，水中溶失少，减少药物浪费，节约成本，不败坏水质；本发明对刺参疾病的有效预防，对提高无公害苗种生产水平、保证食品安全、维护生态环境、促进刺参养殖产业健康可持续发展具积极意义。

权利要求

1.一种用于刺参的缓释型复方免疫增强剂，其特征在于，a、药物按重量份数取黄芪 25～27；党参25～27；防风 13；白术10～15；金银花2～

8；连翘2～8；酸枣仁1～5；维生素C 1～5；松针粉1～3；蚯蚓粉0.5～2；葎草0.5～

2；辣蓼0.5～2，混合粉碎至100目；粉碎后加入上述药物重量5倍的水浸泡2h，煎煮1h；

b、将活化好的天然斜发沸石粉碎至80目作为缓释载体，按药物总重量的10%加入到刚刚煎煮完的药液中，搅拌均匀，吸附2h；

c、再加入上述药物总重量5%的普通面粉搅拌，封闭沸石孔隙, 制得的粘稠物质；

d、 把上述制得的粘稠物质在平面器皿上摊薄，80℃烘干，最后粉碎过60目筛，即为最终产品。

说明书

刺参缓释型复方免疫增强剂的制备方法

技术领域

[0001] 本发明为一种可提高刺参抗病能力，利用效率高的刺参缓释型复方免疫增强剂的制备方法。

背景技术

[0002] 刺参（Apostichopus japonicus）属于棘皮动物门，海参纲，刺参科。自然分布在我国渤海、黄海等水域。由于刺参具有极高的药用及营养价值，市场需求空间大，因此带动了刺参养殖业的发展。

[0003] 伴随着刺参集约化养殖规模的迅速扩大，病害问题也日趋严重。刺参病害以原发和继发的细菌感染性疾病为主，特别是刺参越冬保苗期和成参养殖期的腐皮综合征病尤为严重。针对腐皮综合征的防治药物仍以消毒剂、抗生素及其它化学药剂为主。抗生素易产生残留，严重影响到产品质量安全，同时由于耐药菌株的出现，使病害越来越不好控制。滥用消毒剂会污染环境并对刺参造成应激。水产动物大多个体小，在水中发病不易及时发现，发病后，患病个体不爱摄食，口服治疗药物效果不明显，所以应以预防为主。预防措施之一就是利用动物免疫学原理，具体就是疫苗和免疫增强剂。一般认为象刺参这类无脊椎动物缺乏特异性免疫机制，加之病害可由环境中的多种条件致病菌引发，而疫苗具有专一性，一般情况，一种疫苗只能针对一种病原引发的疾病有效，因此疫苗并不适宜刺参疾病的预防。

[0004] 免疫增强剂是指单独或同时与抗原使用均能增强机体免疫应答的物质。非特异性免疫增强剂主要通过增强非特异性免疫应答而发挥作用，如促进补体、溶菌酶、天然溶血素、凝集素、巨噬细胞活化因子和干扰素等的合成，活化巨噬细胞、嗜中性粒细胞、非特异性细胞毒性细胞的吞噬杀菌功能等。免疫增强剂具有广谱性，对所用疾病都有一定程度的预防效果，以不变应万变，所以开发免疫增强剂，通过提高非特异性免疫机能来增强刺参的抗病能力无疑具有重大的意义。

[0005] 中药含有的免疫活性物质主要是多糖、甙类、有机酸、生物碱、萜类、醇类抗菌肽等成分。但每一种有效成分对机体免疫系统的调节方式各不相同。多糖类具有刺激网状内皮系统，诱导增加机体的免疫因子数量和活力，诱导产生干扰素等；甙类能够有效地促进水产动物吞噬细胞的吞噬功能、淋巴细胞的转化及抗体与干扰素的产生；生物碱能增强体液和细胞免疫功能，刺激巨噬细胞吞噬功能；有机酸类能增强巨噬细胞的吞噬功能，增强机体免疫机能等，同时，很多成分具有对微生物病原的直接抑制或杀灭作用，且不易产生抗药性。除抗病外兼具促生长、改善生物品质等多种生理功能。尤其是根据中医药配伍基本理论，中药组合使用，可以充分发挥不同中药之间的互补协同作用，提高疗效，使药物效应最大化。
中药免疫增强剂及抗微生物药物能够克服化学药物、抗生素及疫苗等种种弊端的优势将越来越明显，可以成为控制水产动物病害的有效途径。已检索到的刺参免疫增强剂专利有：申请号200910187415.3“刺参幼参用复方免疫增强剂”；申请号200910219791.6“刺参苗免疫中草药添加剂”；申请号201010292746.6“一种海参用复方免疫增强剂及其制备方法”。
我国的中药种类繁多，药性多变。结合中医药配伍理论，广泛的加以筛选利用，可以使丰富的药用资源得到充分利用，增加刺参抗病药物的品种。

[0006] 刺参底栖性生活，口小，摄食缓慢温和，饵料要求粒径小。目前在刺参养殖上口服使用的中草药大都是简单粉碎然后混在常规饲料中投喂，缺点是药物比重轻，水中下沉慢，由于刺参摄食缓慢，到达底部，被刺参吃掉还要一段时间，加之小颗粒比表面积大，这期间药物成分大部分溶失在水中，使刺参吃不到足够的药物剂量，浪费了药物，败坏了水质，影响到实际效果。现有的一些缓释材料往往具有造价高，工艺复杂，一般养殖户不易操作的缺陷。选用性价比高的缓释材料，工艺操作简便，是刺参抗病药物剂型上应着重解决的问题。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于克服以上所诉存在的问题，提供一种高效的提高抗病能力的刺参缓释型复方免疫增强剂的制备方法。

[0008] 本发明是这样实现的：1、药物按重量份数取黄芪 25～27；党参25～27；防风13；白术10～15；金银花2～8；连翘2～8；酸枣仁1～5；维生素C 1～5；松针粉1～
3；蚯蚓粉0.5～2；葎草0.5～2；辣蓼0.5～2，混合粉碎至100目；粉碎后加入上述药物总重量5倍的水浸泡2h，煎煮1h。

[0009] 2、将活化好的天然斜发沸石粉碎至80目作为缓释载体，按上述药物总重量的10%加入到刚刚煎煮完的上述药液中，搅拌均匀，吸附2h。

[0010] 3、再加入中草药干粉重量5%的普通面粉（也可用次粉代替）搅拌，封闭沸石孔隙，制得粘稠物质。

[0011] 4、把上述制得的粘稠物质在平面器皿上摊薄，80℃烘干，最后粉碎过60目筛，即为最终产品。

[0012] 使用方法：将上诉粉末状药剂掺入刺参常规饲料中混匀，在刺参疾病频发的季节投喂。

[0013] 使用阶段：幼参及成参。

[0014] 使用剂量：按饲料2%的重量将缓释型复方免疫增强剂混匀在常规饲料中。

[0015] 使用周期：连续使用14～21d。

[0016] 本发明特点：

[0017] （1）明显增强刺参的免疫力，同时有直接抑菌活性，大大降低刺参常见疾病的发生。

[0018] （2）药物成分为生物源，无毒副作用，无抗药性，无污染。

[0019] （3）本发明复方中草药配伍合理，充分发挥了药物之间的协同互补作用,显著优于单方。

[0020] （4）兼具营养价值且诱食性好，能提高刺参采食量，增进组织细胞分裂，有一定的促生长作用。

[0021] （5）采用沸石及面粉做为缓释及粘结材料，制作工艺简单，成本低廉，同时兼具沸石和面粉的营养免疫功能；药物下沉快，水中溶失少；缓释剂型的应用可减少药物浪费，节约成本，不败坏水质。

[0022] （6）原料易得、价格低，可减少抗生素及消毒剂的使用，对刺参疾病的有效预防，对提高无公害苗种生产水平、保证食品安全、维护生态环境、促进刺参养殖产业健康可持续发展具积极意义。

具体实施方式

[0023] 一、药物成分选择及制备

[0024] 按照中医药配伍理论及现代药理学实验成果,结合本地中药资源情况,精心组方, 充分发挥了药物之间的协同互补作用,显著优于单方；各成分的药理作用如下:

[0025] (1)黄芪 黄芪具有补气固表，利尿排毒，排脓，敛疮生肌的功效,对动物的特异性及非特异性免疫系统均有促进作用，具体表现在能显著增加血液中的白细胞总数，促进中性粒细胞及巨噬细胞的吞噬功能和杀菌能力、抗溃疡等，其主要药理成分为黄芪多糖。

[0026] (2)党参 具有补中益气，健脾益肺之功效。现代研究，党参含多种糖类、酚类、甾醇、挥发油、黄芩素葡萄糖甙、皂甙及微量生物碱，具有增强免疫力、扩张血管、降压、改善微循环、增强造血功能等作用。

[0027] (3)防风 祛风解表，胜湿止痛，止痉定搐；现代药理认为具抗菌、消炎、解热、镇痛、镇静等作用。

[0028] (4)白术 健脾益气，燥湿利水，止汗，安胎。现代药理研究证实有强壮、抗凝血、抗菌、促进蛋白质合成等功能。

[0029] (5)金银花 金银花自古被誉为清热解毒的良药。它性甘寒气芳香，甘寒清热而不伤胃，芳香透达又可祛邪。金银花既能宣散风热，还善清解血毒。具有抗微生物、增强免疫力、抗内毒素等药理作用。

[0030] (6)连翘 清热解毒，消肿散结。具抗菌、强心、利尿、镇吐等药理作用。

[0031] (7)酸枣仁 养肝，宁心，安神，敛汗。具有镇静、抗惊厥作用。 [0032] (8)松针粉 是将从松树上修剪下来的幼嫩枝条和针叶收集起来，经过干燥、粉碎而成的。松针粉色绿、幽香，有较好的诱食性，不但含有丰富的粗蛋白质、脂肪、微量元素和维生素，还含有黄酮、植物激素、植物杀菌素、未知生长因子（UGF）萜类化合物等生物活性物质。松针粉用作饲料添加剂或直接饲喂，不仅能节省饲料，降低成本，而且对动物生长发育、增强抗病力和提高生殖功能等均有明显的促进作用。

[0033] (9)葎草 葎草为多年生缠绕草本。具有清热、利尿、消淤、解毒等作用。近年的研究表明, 葎草具有广泛的药理作用, 如抗炎、抗氧化、消除自由基、抗微生物、促进消化、增强免疫等功能。在北方各地野生资源丰富，可以大大降低成本。

[0034] (10)辣蓼 生于近水边，阴湿处。全国大部分地区均有分布，使用成本低。有清热解毒，散瘀止血的功效。现代药理研究具抗菌和增强动物免疫力的作用。

[0035] (11)维生素C（Vc）除了是生物体必要的营养成分之外，还具有多种生物功能：可以促进胶原蛋白的合成；抗坏血病；提高机体免疫力，如Vc可增强中性粒细胞的趋化性和变形能力，提高杀菌能力。促进淋巴母细胞的生成，提高机体对外来和恶变细胞的识别和杀灭。参与免疫球蛋白的合成。提高CI补体酯酶活性，增加补体CI的产生。促进干扰素的产生，干扰病毒mRNA的转录，抑制病毒的增生；提高机体的应激能力，动物体受到异常的刺激，如剧痛、寒冷、缺氧、会引发抵御异常刺激的紧张状态。该状态伴有一系列身体，包括交感神经兴奋、肾上腺髓质和皮质激素分泌增多。肾上腺髓质所分泌的肾上腺素和去甲肾上腺素是有酪氨酸转化而来，在此过程需要Vc的参与。

[0036] (12)蚯蚓粉 蚯蚓在中医上称为地龙, 具有很高的药用价值, 有抗菌, 抗肿瘤, 抗癌等功效, 已经在医药、保健上等方面广泛应用。蚯蚓不仅蛋白质与氨基酸含量高, 而且体内还含有抗菌肽、多糖等具有免疫调节功能的物质。蚯蚓具有很好的诱食性，在水产养殖及休闲渔业中是万能诱饵。

[0037] 天然沸石是由硅铝酸盐组成，含有丰富的矿物元素供动物直接利用，沸石具有巨大地比表面积，其结构内部含有大量的空穴和通道，具有优异的吸附、交换功能，其中的斜发沸石更是上乘的沸石种类，是理想的药物缓释剂材料。面粉或面粉加工厂形成的次粉是常规的能量饲料，在颗粒饲料的制备中通过高温糊化又起到粘合剂的作用，使饲料成型，减少饲料在水中的溶失。

[0038] 通过以下优选实施例说明制备过程：

[0039] 1. 按以下重量份数称取药物，黄芪 27，党参 27，防风 13，白术 13，金银花 5，连翘 5，酸枣仁3，维生素C 3，松针粉2，蚯蚓粉1，葎草1，辣蓼1，混合粉碎至100目，粉碎后加入上述中草药总重量5倍的水浸泡2h，煎煮1h。

[0040] 2.将活化好的天然斜发沸石粉碎至80目作为缓释载体，按上述药物总重量的10%加入到刚刚煎煮完的药液中，搅拌均匀，吸附2h。

[0041] 3.再加入上述上述药物总重量5%的普通面粉（也可用次粉代替）搅拌，封闭沸石孔隙，制得粘稠物质。

[0042] 4. 把上述制得的粘稠物质在平面器皿上摊薄，80℃烘干，最后粉碎过60目筛，即为最终产品。

[0043] 二、饲养试验

[0044] 1.试验刺参及日常管理

[0045] 健康刺参购于本地水产育苗场，体长(4.0±0.35)cm，个体重量 (3.0±0.45)g 。将刺参饲养于40L塑料水槽中，水温(17±1)℃，pH(8.1±0.2)，海水盐度为29±2，每箱饲养20头，每日换水30%，每日16:00投喂1次饲料。暂养1周后用于试验。

[0046] 2.试验设计

[0047] 试验分5个处理组，分别为对照组(A)，投喂基础饲料；1％( 重量百分比)复方中草药组(B)、2％复方中药组(C)、3％复方中药组(D)和4％复方中药组(E)，每组设3个平行，每个平行饲养刺参20头。投喂期间每天按时换水并测量温度、盐度、pH等各项水质指标，定时观察刺参生长及健康状况。分别于投喂后第7d、10d、14d、18d和24d测定刺参各种免疫指标包括ACP、AKP、NOS和SOD。25d开始做病原菌人工感染试验。

[0048] 三、免疫指标检测

[0049] 1、样品制备

[0050] 每次从各组中随机取出刺参3头，分别从刺参腹部靠近肛门约1cm处抽取体腔液合并，玻璃匀浆器研磨后离心(2000r／min，4℃，10min)，取上清液，4℃保存,当日测完。 [0051] 2、测定方法

[0052] ACP(酸性磷酸酶)、AKP(碱性磷酸酶)、NOS(一氧化氮合酶)和SOD(超氧化物歧化酶)各指标的测定均利用南京建成试剂盒进行。

[0053] 3、数据处理

[0054] 试验数据用SPSS13.0软件进行单素方差分析(One—way AN0VA)，结果以平均值±标准差±SD)表示，当P<0.05时认为差异显著。

[0055] 4、结果

[0056] 结合附图，针对本发明复方免疫增强剂不同的添加量对刺参免疫指标的影响做一说明：

[0057] （1）免疫增强剂对刺参ACP活性的影响

[0058] 各试验组在投喂后24d内ACP活性呈现的是先升高后降低。其中第14d，2%复方中草药试验组ACP活性达到最高值为6.94 U／100ml是对照组的6.15倍。表明2%复方中草药试验组效果最佳。经统计分析，2%复方中草药试验组与对照组之间差异显著(P<0.05)，其它组之间差异不显著(P>0.05)，见图1。

[0059] （2）免疫增强剂对刺参AKP活性的影响

[0060] 在口服后24 d 内AKP活性随时间延长先上升后降低，在第10d时明显增强，2%复方中草药试验组AKP活性最高，为3.05金氏单位／100ml， 是对照组的2.93倍；经统计分析，和4%复方中草药试验组均与对照组差异显著(P<0.05)；1%、2%和3%复方中草药试验组与对照组之间差异极显著(P<0.01) 试验组之间差异不显著(P>0.05) ，见图2。

[0061] （3）免疫增强剂对刺参NOS活性的影响

[0062] 试验组在投喂后24d内NOS活性呈现的是先升高后降低。口服后第18d，3%复方中草药试验组NOS活性为10.66 U／ml，是对照组的8.46倍。经统计分析2%复方中草药试验组与对照组之间差异显著(P<0.05)，其它组之间差异不显著(P>0.05)，见图3。 [0063] （4）免疫增强剂对刺参SOD活性的影响

[0064] 不同剂量复方免疫增强剂在投喂后24d内刺参体腔液中SOD活性均升高，活性随时间延长而先升高后降低。在口服第18d，以3%复方中草药试验组SOD活性最高，值为148.05U／ml，是对照组的2.43倍；2%和3%复方中草药试验组与对照组之间差异显著(P<0.05)，而其它组之间差异不显著(P>0.05)， 见图4。

[0065] 四、攻毒试验

[0066] 第25d开始基础饲料组和试验组各随机留下40头刺参，均投喂基础饲料，利用刺参及海水中能引起刺参腐皮综合征的常见致病菌黄海希瓦氏菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌做人工感染试验。将几种菌分别在平板上活化，制备菌悬液，最终形成等比例的混9
合菌液，总浓度为2.O×10CFU／mL，倒入到基础饲料组及试验组养殖水槽中，使水槽中的
6
细菌浓度达到5×10CFU／mL，换水后适当补充；另设1组不加菌液，也投基础饲料，作为对照。继续饲养20d，每天观察发病情况，结果见下表。由攻毒效果看，不同药物添加量的试验组均有提高抗病力的作用，以2%、3%、4%添加量较好，但差异不明显。

[0067] 表 混合菌株人工感染试验

[0068]

[0069] 注：Ⅰ为基础组；Ⅱ为1%复方组；Ⅲ为2%复方组；Ⅳ为3%复方组；Ⅴ为4%复方组；Ⅵ为对照组，不加菌液。

[0070] 另外，由日常观察看，试验组刺参摄食积极，排粪良好，体态伸展。由以上结果看出，复方免疫增强剂不同添加剂量均能提高刺参的免疫力，综合考虑，以添加量2%最佳，建议使用周期为14～21d。