一种HSA-GCSF突变体及其制备方法

摘要

本发明涉及一种无糖基化的重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体，通过对重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子基因的潜在糖基化位点进行突变，剔除了重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子的潜在糖基化位点，然后转化到毕赤酵母或者酿酒酵母中，发酵纯化，最后得到无糖基化的重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体，该突变体克服了原先重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子融合蛋白由于糖基化修饰带来的影响药代动力学和免疫反应问题，更适合于用于人体临床研究或治疗应用。

权利要求

1.一种重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体（rmHSA-GCSF），所述突变体中的人血清白蛋白的C末端可以直接或通过一柔性的连接肽序列与人粒细胞集落刺激因子的N端相连，或者人粒细胞集落刺激因子的C末端直接或通过一柔性的连接肽序列与人血清白蛋白的N端相连，所述人粒细胞集落刺激因子上第133位的Thr突变成Gly、Ala或Met。

2.根据权利要求1所述的重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体

（rmHSA-GCSF），其特征在于：所述的人粒细胞集落刺激因子可以是天然G-CSF或天然G-CSF的功能类似物，所述的G-CSF功能类似物是在天然G-CSF的N端添加甲硫氨酸（Met），相应的将第134位的Thr突变成Gly、Ala或Met。

3.根据权利要求1所述的重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体

（rmHSA-GCSF），其特征在于：所述的柔性连接肽序列通式为GlyGlyGlyGlySer。

4.一种重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体（rmHSA-GCSF），其氨基酸序列与Seq ID No.1-Seq ID No.12任意一项所示序列相同。

5.编码权利要求4所述重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体

（rmHSA-GCSF）氨基酸序列的DNA序列。

6.携带编码权利要求5所述DNA序列的重组表达载体。

7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其为pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815或pPSC3K质粒。

8.含有权利要求6所述重组表达载体的宿主细胞，其为细菌、酵母、动物细胞或植物细胞。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于：所述酵母细胞为毕赤酵母。

10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于：所述酵母细胞为毕赤酵母GS115。

11.根据权利要求8-10任一项所述的宿主细胞，其特征在于：所述的重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体（rmHSA-GCSF）融合蛋白在宿主细胞内为分泌表达。

12.权利要求1所述的重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体的纯化生产方法，其特征在于：将含有重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体的发酵液上清通过亲和柱层析、疏水柱层析、离子交换柱层析和凝胶柱层析顺序组合纯化，制备得到纯度大于95%的重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体。

13.根据权利要求12所述的纯化生产方法，其特征在于：所述亲和层析柱填料为以Cibacron Blue为结合基团的各种颜料亲和层析介质，选自Blue-Sepharose6Fast Flow、Blue sepharose CL-6B、Affi-Gel Blue Gel或Blue-Sepharose6Fast Flow。

14.根据权利要求13所述的纯化生产方法，其特征在于：Blue亲和层析选用10-150mM Tris-HCl或磷酸缓冲液为流动相A，pH的范围6.0-8.0，加入1.0M以上的NaCl或其他高盐溶液作为洗脱流动相B。

15.根据权利要求12所述的纯化生产方法，其特征在于：疏水柱选用以Butyl-、Phenyl-、Octyl-为结合基团的Sepharose、Macro-Prep、Poros填料或SOURCE PHE、ISO、ETH疏水填料。

16.根据权利要求15所述的纯化生产方法，其特征在于：疏水层析流动相选用20-50mM Tris-HCl、Gly-NaOH或磷酸缓冲液，pH范围在4.0-10.0，加入0.5-1.6mol/L硫酸铵或

0.5-1.6mol/L硫酸钠的缓冲液为流动相A，以不含硫酸铵或硫酸钠的缓冲液为流动相B。

17.根据权利要求12所述的纯化生产方法，其特征在于：离子交换柱为Q或DEAE阴离子交换柱。

18.根据权利要求17所述的纯化生产方法，其特征在于：离子交换层析流动相为

20-50mM Tris-HCl、Gly-NaOH或磷酸缓冲液，pH在6.0-9.0之间。

19.根据权利要求12所述的纯化生产方法，其特征在于：凝胶层析柱为Sephacryl、Superdex或Sephadex。

20.根据权利要求19所述的纯化生产方法，其特征在于：凝胶层析流动相为5-10mM的磷酸缓冲液。

21.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求1所述的重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体（rmHSA–GCSF）和药用稀释剂、佐剂或载体。

22.权利要求1所述的重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体（rmHSA–GCSF）在制备用于治疗因放疗、化疗引起的中性粒细胞减少症的药物中的应用。

23.一种人粒细胞集落刺激因子突变体，其特征在于：将天然人粒细胞集落刺激因子上第133位的Thr突变成Gly、Ala或Met或N-端添加Met的天然人粒细胞集落刺激因子上第134位的Thr突变成Gly、Ala或Met。

24.一种检测权利要求1所述的重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体（rmHSA-GCSF）有无糖基化的方法，其特征在于：将rmHSA–GCSF蛋白溶液流经con A(凝集素)柱，如果rmHSA–GCSF无糖基化，那么将在流出峰中将检出rmHSA–GCSF，洗脱峰中检测不到rmHSA–GCSF；如果rmHSA–GCSF有糖基化，那么rmHSA–GCSF蛋白将吸附在con A(凝集素)柱，在流出峰中则检测不到rmHSA–GCSF，在洗脱峰中检测到rmHSA–GCSF。

说明书

一种HSA-GCSF突变体及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种无糖基化的重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体融合蛋白的构建及其制备方法。

[0002] 发明背景

[0003] 大多数的蛋白药物只能采用皮下注射或静脉注射等方式给药，这类蛋白药物因蛋白酶的作用和肾小球的滤过，在人体内的半衰期比较短，体内清除率高，往往只有几分钟至几小时的半衰期，造成给药频繁，给患者造成诸多困难和不便。此外，其稳定性等也是影响其在体内发挥其功效的因素。因此，如何消除或降低此类蛋白类药物的抗原性、延长其体内半衰期及增加稳定性是生物制药领域的一个热门课题。

[0004] 天然的人粒细胞集落因子(hG-CSF)具有174个氨基酸，若是通过大肠杆菌表达的重组人粒细胞集落因子(rhG-CSF)因为需要在N-端添加甲硫氨酸而具有175个氨基酸。已上市的重组人粒细胞集落因子注射液药物多为经大肠杆菌表达的175位氨基酸的rhG-CSF，其在肿瘤放疗、化疗引起的粒细胞减少症、再生障碍性贫血、放射病等血液病的治疗及骨髓移植方面具有重要作用，现已应用于临床，是每年销售额最大的几个生物制品药物之一。但是hG-CSF血浆中衰期短，为了达到体内效果一个周期内需要多次给药，这既增加了病人的痛苦，又增加医疗费用，还会引起一些副反应并增加了感染的风险。

[0005] 人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是人体血清中的主要成分，对维持体内渗透压和血浆体积起着至关重要的作用。人血清白蛋白具有585个氨基酸，是分子量为65kD的非糖基化蛋白，肾清除率非常低，体内半衰期为14～20d。它也是体内因子和药物转运的天然载体。研究表明将治疗性蛋白基因与人血清白蛋白基因融合所表达的融合蛋白可明显降低体内药物的清除速率，延长生物半衰期。Yeh等发现，克鲁维氏酵母表达的HSA-CD4融合蛋白在以家兔为动物模型的实验中半衰期比单独的CD4延长了140倍。而克鲁维氏酵母表达的HSA-IFNα的融合蛋白(albuferon)在猕猴体内的半衰期比单独的IFNα延长了大约18倍(Blaire L.等，TheJournal of Pharmacology And Experimental Therapeutics.2002，303：540-548)。

[0006] 人血清白蛋白是血液循环中的一个非常重要的天然蛋白，在体液循环中可存在20天以上。研究表明将人粒细胞集落因子与人血清白蛋白基因融合所表达的融合蛋白可明显降低体内药物的清除速率，延长生物半衰期。与人血清白蛋白融合表达的人粒细胞集落因子，即rHSA-hG-CSF有比普通hG-CSF更长的半衰期，从而可以大大减少hG-CSF治疗的给药次数。已有相当多的文献报导了rHSA-hG-CSF融合蛋白的构建，例如中国专利申请01124114.4、02142881.6、200710020034.7和200810024988.X，美国专利5876969，wo01/79480，以及非专利文献(W endy Halpern r等，AlbugraninTM，a Recombinant Human Granulocyte Colony Stimulating Factor(G-CSF)Genetically Fused to Recombinant Human Albumin Induces ProlongedMyelopoietic，Pharmaceutical Research，Vol.19，No.11，November2002)。

[0007] 上述文献报道的rHSA-hG-CSF通常利用酵母系统表达，例如毕氏酵母。毕赤酵母是作为外源基因表达系统，具有许多明显优点，其诱导分泌表达的启动子AOX1可用甲醇严格调控，表达产物分泌到上清，不需复杂的破菌手段。而且表达上清的杂蛋白含量很低，有利于进一步的分离纯化。但是毕赤酵母系统会对目标蛋进行糖基化修饰，这种糖基化修饰同哺乳动物的糖基化存在着一些差异，例如毕赤酵母高甘露糖型修饰可能导致药物蛋白代谢动力学性质不良和产生免疫反应，这是限制该类蛋白作为治疗性药物的一个因素。

[0008] 因此，对现有rHSA-hG-CSF融合蛋白进行改造和突变，获得无糖基化位点的rmHSA-hG-CSF，就具有重大的意义。

发明内容

[0009] 本发明的一个目的是提供一种无糖基化的重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体。

[0010] 通过蛋白质糖基化位点预测模拟网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)，本申请发明人发现，人血清白蛋白(HSA)蛋白序列中上没有糖基化位点，但是在人粒细胞刺激因子上有一个0-糖基化位点，这个0糖基化位点是位于G-CSF第133位的苏氨酸(Thr)。

[0011] 针对该发现，发明人通过大量实验对G-CSF第133位的苏氨酸进行点突变，以期能消除蛋白糖基化问题。最后意外发现，把人粒细胞集落刺激因子上的Thr-133突变成Gly、Ala和Met，经过鉴定，最后得到无糖基化的重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体(rmHSA-GCSF)，且突变蛋白的生物学活性基本不变。

[0012] 因此，本发明首先提供了一种重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体(rmHSA-GCSF)，所述突变体中的人血清白蛋白的C末端可以直接或通过一柔性的连接肽序列与人粒细胞集落刺激因子的N端相连，或者人粒细胞集落刺激因子的C末端直接或通过一柔性的连接肽序列与人血清白蛋白的N端相连，所述人粒细胞集落刺激因子上第133位的Thr突变成Gly、Ala或Met。

[0013] 上述的重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体(rmHSA-GCSF)中，所述的人粒细胞集落刺激因子可以是天然G-CSF或天然G-CSF的功能类似物，所述的功能类似物为经过个别氨基酸残基的取代、缺失或增加得到的G-CSF多肽，生物学活性与天然G-CSF基本相同。优选的功能类似物是在天然G-CSF的N端添加甲硫氨酸(Met)，相应的将第134位的Thr突变成Gly、Ala或Met。

[0014] 上述的重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体(rmHSA-GCSF)中，柔性连接肽序列通式为[GlyGlyGlyGlySer]n，n为1-10的整数，优选的是n为1-3的整数，最优选n为1。

[0015] 优选的，上述的重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体(rmHSA-GCSF)的蛋白序列分别如Seq ID No.1-Seq ID No.12所示。

[0016] 本发明的另一目的是提供编码重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体(rmHSA-GCSF)的DNA序列，优选的是编码分别如Seq ID No.1-SeqID No.12所示蛋白序列的DNA序列。

[0017] 通过常规分子生物学实验技术，可将上述的DNA序列连接到合适的表达载体上，得到携带编码本发明融合蛋白的DNA序列的重组表达载体。本发明的重组表达载体包括pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K质粒等。

[0018] 本发明的再一个目的是提供表达本发明融合蛋白编码基因的宿主。本发明的宿主可以是被重组表达载体或重组表达载体的一部分转化，含有本发明融合蛋白编码基因的细菌、酵母、动物细胞或植物细胞；其中优选的是酵母，更优选的是毕赤酵母，最优选的是毕赤酵母GS115。融合蛋白可以存在于宿主细胞内，也可以是从宿主中分泌出来，优选的，是从宿主中分泌出来。分泌所用的信号肽，优选的是天然的人血清白蛋白的信号肽，或酵母MFα信号肽，或这两种信号肽的类似物。更优选的用天然的人血清白蛋白的信号肽，用该信号肽时融合蛋白表达水平较高。融合蛋白或多肽也可以不用信号肽，而在酵母中以胞内可溶形式表达。编码融合蛋白的核酸，可以插入至宿主染色体，或以游离质粒形式存在。转化所需核酸至宿主细胞中去可用通常的方法，如：电穿孔，制备感受态的原生质球等。成功转化的细胞，即含有本发明DNA构建体的细胞，可通过人们熟知的技术加以鉴定，如细胞经收集并裂解，提取DNA，然后PCR方法鉴定。

[0019] 编码HSA的多聚核苷酸和编码hG-CSF的多聚核苷酸可以用本领域周知的方法，如PCR(Saiki等Science.239：487-491，1988)、RT-PCR方法、人工合成的方法和构建筛选cDNA文库的方法等获得。hG-CSF的突变体还可以用人工合成的方法获得，人工合成时可选用宿主偏爱的密码子，这样往往可以提高产物的表达。编码HSA和编码hG-CSF的多聚核苷酸的融合，在保持各自阅读框架不变的前提下，可以用本领域周知的各种方法，如通过PCR的方法，在编码序列的两侧引入限制性内切酶识别位点，通过酶切产生粘性末端，编码HSA和编码hG-CSF的多聚核苷酸的粘性末端用DNA连接酶连接，从而获得编码融合蛋白的基因。如果需要可在本发明的编码融合蛋白基因的两侧引入多聚核苷酸如信号肽或连接肽等，引入的多聚核苷酸可有限制性内切酶识别位点。可用本领域公知的方法将含编码融合蛋白序列的核酸克隆到各种表达载体中去。所用标准的分子克隆过程见J.萨姆布鲁克等(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995.)的叙述。

[0020] 本发明还提供了另外一种重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体的构建方法，其包括如下步骤：通过定点PCR突变技术或人工合成方法，把人粒细胞集落刺激因子上的Thr-133突变为除Thr外的其它19种人体天然氨基酸之一；将得到的rmHSA-GCSF基因序列克隆到合适的载体上转化酵母受体菌，经发酵和纯化后得到重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体蛋白。经过筛选发现将人粒细胞集落刺激因子上第133位的Thr突变成Gly、Ala或Met可消除重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子融合蛋白在酵母中表达引起的糖基化问题。

[0021] 上述方法中，酵母优选是毕赤酵母，更优选是毕赤酵母GS115菌株。将克隆有rmHSA-GCSF基因序列的载体转化毕赤酵母后，挑取重组体单菌落进行扩大培养，诱导表达，离心后得到表达上清。

[0022] 本发明的另一目的是提供了一种重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体的纯化生产方法，将含有重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体的发酵液上清通过亲和柱层析、疏水柱层析、离子交换柱层析和凝胶柱层析顺序组合纯化，制备得到纯度大于95％的重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体。通过上述纯化手段可有效去除杂蛋白、内毒素、糖类等杂质，最终得到高纯度蛋白。

[0023] 柱层析纯化首先采用Blue颜料亲和层析，所述亲和层析柱填料为以Cibacron Blue为结合基团的各种颜料亲和层析介质，例如Blue-Sepharose6 Fast Flow、Blue sepharose CL-6B、Affi-Gel Blue Gel或Blue-Sepharose6 Fast Flow。因为表达上清的成分较杂，使用Blue亲和层析收集表达上清中的rmHSA-GCSF具有较高的特异性，可以去除大部分的色素、热原质、核酸片段等非蛋白类杂质和杂蛋白。Blue亲和层析可选用10-150mMTris-HCl或磷酸缓冲液为流动相A，pH的范围6.0-8.0，加入1.0M以上的NaCl或其他高盐溶液作为洗脱流动相B。

[0024] 疏水柱选用以Butyl-、Phenyl-、Octyl-为结合基团的Sepharose、Macro-Prep、Poros填料或SOURCE PHE、ISO、ETH疏水填料。可选用20-50mMTris-HCl、Gly-NaOH或磷酸缓冲液，pH范围在4.0-10.0，加入0.5-1.6mol/L(NH-4)2SO4或0.5-1.6mol/L Na2SO4的缓冲液为流动相A，以不含(NH-4)2SO4或Na2SO4的缓冲液为流动相B。将Blue柱目标峰上样于疏水柱，然后以流动相A冲洗柱子，再以流动相B梯度进一步洗脱，收集目标峰。通过疏水层析可进一步去除可能存在的寡聚体、降解蛋白、色素等杂质。

[0025] 疏水层析后的样品可经Q或DEAE等阴离子交换柱进一步纯化。通过与疏水层析不同的分离机理，离子交换层析可使目标蛋白得到进一步的纯化。可以选用pH在6.0-9.0之间的20-50mM Tris-HCl、Gly-NaOH或磷酸缓冲液过Q或DEAE柱。疏水层析后过离子交换柱这一步是可选的，因为疏水之后的样品通常可以达到95％以上的纯度，为了获得更高的纯度，可以选择使用离子交换层析。经过离子交换层析的样品通常可以达到97％以上的纯度。

[0026] 经疏水层析或离子交换层析后收集的目标峰，可直接上样于Sephacryl、Superdex或Sephadex等凝胶层析柱，进行脱盐。凝胶层析用先以5-10mM的磷酸缓冲液为流动相平衡，经此凝胶层析得到的目标蛋白rmHSA-GCSF，此流动相将前述疏水层析或离子交换层析条件下的体系改换为5-10mM磷酸盐可以直接用于制剂的配制，而无须采用透析等其他改换溶液体系的处理，减少处理步骤中可能的污染与损失。

[0027] 整个纯化过程中，发酵离心后的样品可以直接使用Blue亲和柱收集，收集的目标蛋白加硫酸铵即可上疏水柱，疏水柱的洗脱电导较低，而且样品得到高度浓缩，因此几倍稀释后即能满足离子交换的要求，经离子交换的样品浓度高而体积小，刚好适合于脱盐层析。因此整个纯化组合相对比较合理，易于工业放大，产品最终纯度在95％以上。最终获得含有重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体(rmHSA-GCSF)的生物制品，其含有至少95％以上的rmHSA-GCSF和至多5％的其他未知杂质，优选制品含有至少97％以上的rmHSA-GCSF和至多3％的其他未知杂质。

[0028] 本发明还提供了一种检测蛋白质糖基化的方法，con A(凝集素)能够识别α连接甘露糖及末端的葡萄糖基团。因此只要把rmHSA-GCSF蛋白溶液流经con A(凝集素)柱，如果rmHSA-GCSF无糖基化，那么将在流出峰中将检出rmHSA-GCSF，洗脱峰中检测不到rmHSA-GCSF。如果rmHSA-GCSF有糖基化，那么rmHSA-GCSF蛋白将吸附在con A(凝集素)柱，在流出峰中则检测不到rmHSA-GCSF，在洗脱峰中检测到rmHSA-GCSF。

[0029] 现有技术已经表明，异源蛋白在酵母中表达时可能引起糖基化问题。由于毕赤酵母高甘露糖型结构和哺乳动物中的复杂型糖链结构显著不同，而糖链结构能改变重组糖蛋白的结构和特点。毕赤酵母高甘露糖型在人体内可以和甘露糖受体结合，导致药物代谢动力学性质不良和产生免疫反应，如具有甘露糖末端结构的糖蛋白清除率高(Gary Walsh，Biopharmaceutical benchmarks，Nature Biotechnology 21，2003：865-870)。而本发明通过点突变筛选，可以得到无糖基化的重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子融合蛋白突变体，克服了原先重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子融合蛋白由于糖基化修饰带来的影响药代动力学和免疫反应问题，更适合于用于人体临床研究或治疗应用。

[0030] 本发明还提供了一种药用组合物，该药物组合物含有上述的有效量的重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体(rmHSA-GCSF)和药用稀释剂、佐剂或载体等，该药剂可用于治疗因放疗、化疗等引起的中性粒细胞减少症。由于半衰期延长，因此可实现每1-2周给药1次。一种较适合的处方为注射用水剂，所述药物制剂含有0.5-10mg/mL的重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体(rmHSA-GCSF)，1-5％的山梨醇(质量浓度，m/v)，0.001～0.1％(w/v)的吐温-80，10-100mmol/L的缓冲盐溶液，溶液pH为4.0-8.0。优选的缓冲液为磷酸盐缓冲液。根据需要，可将上述药物制剂制备为冻干粉针。

[0031] 以下实施例为对本发明进行进一步的详细阐述，但并不意味着作为一种限制。

附图说明

[0032] 图1携带重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体基因质粒的构建过程。

[0033] 图2con A(凝集素)检测rHSA-hG-CSF和rmHSA-hG-CSF的糖基化。A为糖基化的rHSA-hG-CSF；B为rmHSA-hG-CSF(133Thr-Gly)。

[0034] 图3SDS-PAGE方法检测rHSA-hG-CSF和rmHSA-hG-CSF(133Thr-Gly)的分子量，泳道1，为Marker，从上到下为96、67、43、31、21KDa，泳道2为rHSA-hG-CSF；泳道3为rmHSA-hG-CSF(133Thr-Gly)。

[0035] 图4体外法检测rHSA-hG-CSF和rmHSA-hG-CSF(133Thr-Gly)的活性，黑色线(正方形)为活性标准品，红色(斜方形点)为rHSA-hG-CSF，绿色(三角形点)为rmHSA-hG-CSF(133Thr-Gly)。

具体实施方式

[0036] 实施例1重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体的构建

[0037] 1.1基因扩增及突变体的构建表达菌株构建：

[0038] 1.1.1、HSA基因扩增

[0039] 以HSA1：(5’GCTTCGAAACCATGAAGTGGGTAACCTT TATTTCCCT3’)，和HSA2(5’TAGGATCCACCACCACCAAGGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC 3’)为引物从人胎肝文库(上海生工生物工程技术服务有限公司)中通过常规PCR方法扩增出HSA带信号肽基因片段。引物合成时在HSA基因5’端引入HSA自身的信号肽和HindIII5’位点，在基因3’端引入连接肽GGGGS和BamH I位点。

[0040] 1.1.2、hG-CSF基因

[0041] 全基因合成，其序列如下所示，其中第133位的氨基酸以X表示，意指将氨基酸第133位的T改为除Thr外的其他19种氨基酸之一。在合成时在基因两端设计有BamH I和EcoR I切点。

[0042] ACA CCA TTA GGC CCT GCC AGC TCC CTG CCC CAG AGC TTC

[0043] 1、T P L G P A S S L P Q S F

[0044] CTG CTC AAG TGC TTA GAG CAA GTG AGG AAG ATC CAG GGC GAT GGC GCA GCG CTC[0045] 14、L L K C L E Q V R K I Q G D G A A L[0046] CAG GAG AAG CTG TGT GCC ACC TAC AAG CTG TGC CAC CCC GAG GAG CTG GTG CTG[0047] 32、Q E K L C A T Y K L C H P E E L V L[0048] CTC GGA CAC TCT CTG GGC ATC CCC TGG GCT CCC CTG AGC AGC TGC CCC AGC CAG[0049] 50、L G H S L G I P W A P L S S C P S Q[0050] GCC CTG CAG CTG GCA GGC TGC TTG AGC CAA CTC CAT AGC GGC CTT TTC CTC TAC[0051] 68、A L Q L A G C L S Q L H S G L F L Y[0052] CAG GGG CTC CTG CAG GCC CTG GAA GGG ATC TCC CCC GAG TTG GGT CCC ACC TTG[0053] 86、Q G L L Q A L E G I S P E L G P T L[0054] GAC ACA CTG CAG CTG GAC GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC ATC TGG CAG CAG ATG[0055] --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---[0056] 104、D T L Q L D V A D F A T T I W Q Q M[0057] GAA GAA CTG GGA ATG GCC CCT GCC CTG CAG CCC CAG GGT GCC ATG CCG GCC[0058] 122、E E L G M A P A L Q P Q G A M P A[0059] TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGC CGG GCA GGA GGG GTC CTG GTT GCC TCC CAT CTG[0060] 140、F A S A F Q R R A G G V L V A S H L[0061] CAG AGC TTC CTG GAG GTG TCG TAC CGC GTT CTA CGC CAC CTT GCC CAG CCC TAA[0062] 158、Q S F L E V S Y R V L R H L A Q P *[0063] 1.1.3、表达菌株构建

[0064] 将两基因片段克隆到于pGEM-T(promega公司)载体中，经测序验证，基因的序列完整、正确，分别命名为PGEMT-HSA质粒和PGEMT-G-CSF质粒。然后分别抽提质粒，用HindIII和BamH I双酶切PGEMT-HSA质粒回收HSA基因；用BamH I和EcoR I双酶切PGEMT-G-CSF回收G-CSF突变体基因；用HindIII和EcoR I双酶切pPIC9(Invitrogen公司)，回收大片段，然后连接上述的三片断，得到重组酵母表达质粒pPIC9-HSA/G-CSF，测序验证阅读框架正确。如此重复操作(图1所示)，得到19种含重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体基因的重组酵母表达质粒pPIC9-HSA/G-CSF。

[0065] 1.2转化菌株以及筛选

[0066] 将19种重组酵母表达载体体外酶切线性化，以原生质体转化法转化毕氏酵母受体菌GS115菌株。转化子涂板MD培养基上，30℃培养48h后，MD培养基上长出的转化子。

[0067] 实施例2重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体的发酵和纯化[0068] 2.1诱导表达

[0069] 挑取重组体单菌落接种于BMGY培养基[pichia Expression Kit，AManualof Methods for Expression of Recombinant Proteins in pichiapastoris，Invitrogen公司]中，30℃震荡培养过夜，A600约为5.0。离心收集菌体，以BMMY培养基重悬菌体至A600为2.0后诱导表达，每隔24h补加甲醇至终浓度为2％，72h后离心收集上清。

[0070] 2.2表达产物的纯化制备

[0071] 表达产物依次使用蓝色颜料亲合层析、疏水层析和离子交换层析纯化，纯化产物使用Sephadex G-25柱脱盐，即得19种重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体蛋白。

[0072] 2.2.1、rmHSA-hG-CSF的亲和柱纯化

[0073] 在安玛西亚的BPG 100/500L柱中装入1L的Blue-Sepharose填料，以PBS为流动相A，2M NaCl为流动相B。用流动相A平衡反相Blue亲和柱后，以200ml/min流速将离心后的发酵液上清BLUE-Sepharose柱，上完样后先以流动相A平衡柱子，将所有未结合在柱上的组分冲干净，再用100％的流动相B洗脱目标峰。

[0074] 2.2.2、rmHSA-hG-CSF的疏水柱纯化

[0075] 在安玛西亚的BPG 100/500L柱中装入2L的SOURCE PHE疏水胶，流动相A为20mM pH 7.0加0.7mol/L(NH-4)2SO4，流动相B为20mM pH 7.0的PB缓冲液。先将亲和目标峰用流动相A稀释3倍，然后再直接加入4mol/L的(NH-4)2SO4溶液至(NH-4)2SO4浓度为0.7mol/L左右，接着以100ml/min的流速上样于用流动相A平衡好的SOURCE PHE疏水柱，上完样后用流动相A平衡2个柱体积(将未结合于柱上的杂质冲洗干净)，再用85％的流动相B洗脱，收集目标峰。

[0076] 2.2.3、rmHSA-hG-CSF的离子交换柱纯化

[0077] 在安玛西亚的BPG 100/500L柱中装入1L的SOURCE Q填料，流动相A为20mM PH7.0，流动相B为20mM PH 7.0的PB缓冲液加1M NaCl。先将疏水目标峰2用流动相A稀释5倍，接着以100ml/min的流速上样于用流动相A平衡好的SOURCE Q柱，上完样后用流动相A平衡2个柱体积，再用15％梯度洗脱可能的杂质，最后以25％的流动相B洗脱，收集目标峰。

[0078] 2.2.4、rmHSA-hG-CSF的凝胶柱脱盐

[0079] 在安玛西亚的XK 50/100L柱中装入2L的Sephadex G25Coarse胶，离子交换目标峰过Sephadex G25Coarse柱脱盐，以5mM的磷酸缓冲液为平衡液，洗脱收集目标峰，即为高纯度的rmHSA-hG-CSF，可直接用于制剂的制备，不用再进行透析等处理。经RP-HPLC分析，纯度大于95％。

[0080] 实施例3重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体的鉴定

[0081] 3.1、con A(凝集素)检测突变体蛋白糖基化的方法

[0082] 采用con A(凝集素)柱(GE Healthcare公司)，其是一类能与糖类专一结合的蛋白质或糖蛋白。上样缓冲液为0.5M NaCl，1.0mM Mn2+，1.0mMCa2+，20mM Tris-HCl，pH7.2；洗脱缓冲液为0.5M NaCl，0.2M a-甲基葡萄糖苷；再生缓冲液A：为0.5M NaCl，20mM NaAc-HAc pH4.5；再生缓冲液B：为0.5M NaCl，20mM Tris-HCl pH8.5；A和B反复冲洗3次。经过突变且未糖基化的重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体(rmHSA-hG-CSF)绝大部分挂不住，在流出峰中出来，说明为非糖基化；而未突变或突变后仍有糖基化的重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子(rHSA-hG-CSF)大部分将吸附在柱子上，在流出峰中检测不出来，在随后的洗脱峰中检测出来，说明为糖基化。

[0083] 经过筛选发现将人粒细胞集落刺激因子上第133位的Thr突变成Gly、Ala或Met可消除重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子融合蛋白在酵母中表达引起的糖基化问题，结果如附图2所示。

[0084] 根据参照上述的实验步骤，继续构建人血清白蛋白的C末端直接与人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)突变体的N端相连的重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体，所述的人粒细胞集落刺激因子上第133位的Thr突变成Gly、Ala或Met，经con A(凝集素)检测验证Gly、Ala或Met突变可消除重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子融合蛋白在酵母中表达引起的糖基化问题，上述的蛋白序列分别如Seq ID No.1-Seq ID No.6所示。

[0085] 根据上述的实验步骤，可以继续构建人血清白蛋白的C末端通过GGGGS连接肽或直接与N-端添加Met的重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)突变体的N端相连的重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体，所述的重组人粒细胞集落刺激因子上第134位的Thr突变成Gly、Ala或Met，经con A(凝集素)检测验证Gly、Ala或Met突变可消除重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子融合蛋白在酵母中表达引起的糖基化问题，上述蛋白序列分别如Seq ID No.7-Seq ID No.12所示。

[0086] 3.2、SDS-PAGE电泳法检测重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体[0087] 使用中国药典2010版的SDS-PAGE电泳的方法，采用10％的胶浓度。结果见附图3，从附图中可看出，带有连接肽的133位的Thr突变成Gly的重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体(rmHSA-hG-CSF)和重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子(rHSA-hG-CSF)的分子量在86.4KDa左右，Ala和Met突变的rmHSA-hG-CSF的分子量也在86.4KDa左右。而直接连接的133位Thr突变的重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体(rmHSA-hG-CSF)由于少了GGGGS连接肽，分子量在85.8KDa左右。

[0088] 3.2体外生物活性检测

[0089] 使用中国药典2010版规定的测活方法，应用依赖G-CSF生长的细胞株NFS-60作检测细胞株，MTT色素还原法，测定酵母表达的rHSA-hG-CSF的生物学活性并与对照品对比。从结果来看(见附图4)，重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子(rHSA-hG-CSF)的的8
活性为0.21*10IU/mg，133位的Thr突变成Gly的重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因
8
子突变体(rmHSA-hG-CSF)的活性为0.22*10IU/mg，两者差不多。

[0090] 用类似的方法测定，已制备出的其他11种非糖基化的rmHSA-hG-CSF的生物学活8 8
性类似，活性在0.22*10IU/mg-0.27*10IU/mg之间。

[0091]rmHSA-hG-CSF突变体 活性(108IU/mg)
133Thr-Gly(GGGGS连接) 0.22
133Thr-Ala(GGGGS连接) 0.25
133Thr-Met(GGGGS连接) 0.24
133Thr-Gly(直接连接) 0.22
133Thr-Ala(直接连接) 0.23
133Thr-Met(直接连接) 0.23
134Thr-Gly(GGGGS连接) 0.23
134Thr-Ala(GGGGS连接) 0.27
134Thr-Met(GGGGS连接) 0.24
134Thr-Gly(直接连接) 0.24
134Thr-Ala(直接连接) 0.22
134Thr-Met(直接连接) 0.25