一种多孔单细胞观测板及其应用

摘要

本发明提供一种多孔单细胞观测板，包括多个小孔单元，每个小孔单元包括一个小孔、多个重复的细胞培养室和扩散通道，每个细胞培养室通过扩散通道与小孔连接。本发明提出的多孔单细胞观测板主要应用的方向为细胞生物学、高通量基因表型筛选等。本发明的提出的装置采用小孔与细胞微培养腔室结合的方式，针对研究高通量的不同的酵母细胞菌群，采用小孔和为酵母细胞单层生长观测的特定高度的培养腔室，使细胞单层生长，有利于观测研究；设计与排枪和液体自动点样仪匹配的孔间距，使得系统真正能实现高通化与自动化；覆盖该多孔单细胞观测板，可以只用10μl的液体，进行时间长达5-10小时左右的观测。

权利要求

1.一种应用多孔单细胞观测板研究细胞的方法，其特征在于，

所述多孔单细胞观测板的制备方法为：

1）用L-Edit制作掩模版a和掩模版b的绘图，掩膜版a的小孔直径为3mm，孔间距为

4.5mm，该孔间距与排枪相适配；掩膜版b为细胞培养室和扩散道图层，细胞培养室为直径为250微米的小圆，高度为8μm，通过一段40微米宽、40微米高，60微米长的扩散道与小孔相连；重复的小孔单元为12×4个；

2)采用光刻胶SU-8 3005，通过甩胶机在硅片上涂布上7微米的光刻胶，转速2000rpm，时间为30s，经过65摄氏度烘烤1分钟，95摄氏度烘烤5分钟前烘后，放于曝光机下曝光，2

采用的掩模为所设计掩模版b图形的阴版，曝光时间为50秒，光强为20mW/cm ；曝光后样品放于65摄氏度1分钟，95摄氏度后烘5分钟；经过显影液显影后，获得掩模版b的模具，再通过利用SU-8 3025,步骤同上，前烘条件为65摄氏度1分钟，95摄氏度10分钟，采用相2

应的掩模，曝光时间为90秒，光强20mW/cm，后烘条件为65摄氏度1分钟，95摄氏度10分钟，套刻掩膜版a的图层，制得模具；

3）用液态的PDMS预塑体倒在模具上，所述PDMS中预聚体A和固化剂B的比例A：B=8：

1；PDMS的高度为1-2mm，在75度烘箱中1h使得PDMS固化，切下后在相应的小孔处采用3mm直径的打孔器打孔后，用70%酒精超声清洁干净，待用； 所述应用为：制备的多孔单细胞观测板通过Harrick公司，PDC-002等离子处理机，一分钟等离子处理后，图形面向下放于干净的玻片上，采用排枪在不同的小孔内加入相同的7

尺度大小为4-5μm的芽殖酵母菌群1μl溶液，菌群密度3×10 个/ml，等待1分钟，细胞溶液可被吸入整个细胞腔室；采用排枪吸出小孔中的细胞溶液，用新鲜的培养液洗两次小孔，每次10μl，然后将小孔替换为希望细胞所处 的YPDA培养液环境后，用同样大小的玻片盖在PDMS多孔单细胞观测板的上方； 将该装置放于带有自动平移台和自动对焦的显微镜系统上，对不同的细胞类型进行时序的单细胞记录；覆盖该多孔单细胞观测板，可进行时间长达10小时的观测。

说明书

一种多孔单细胞观测板及其应用

技术领域

[0001] 微流控芯片（Microfluidic chip）技术是近几年飞速发展的领域,其特征主要是其容纳流体的有效结构（通道、反应室和其它某些功能部件）至少在一个纬度上为微米级尺度。微流控芯片把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块厘米尺度的芯片上，由于它可实现高通量的细胞阵列，精确的控制细胞培养环境，快速的进行分析，大量的减少试剂的消耗，而成为现在做细胞分析的最有力的工具。但之前的大多数研究工作都需要借助自动注射泵系统，例如Luo等人（C.Luo,X.Zhu,T.Yu,et al.，A fast cell loading and high-throughput microfluidic system for long-term cell culture in zero-flow environments，Biotechnology and Bioengineering,2008，101,190-195.） 和 Wang 等 人（L.Wang,X.Ni,C.Luo,et al.，Self-loading and cell culture in one layer microfluidic devices,Biomedical Microdevices,2009，
11,679-684.）的研究，其与现行的排枪或者自动点液系统不能兼容，难以做到真正意义上的高通量（48个不同样品及以上），而现有的商用多孔板并不适合做实时的酵母单细胞跟踪。

[0002] 最近，有报道（G.Yang,Quan,Y.,Wang,W.,et al.,Dynamic equilibrium between cancer stem cells and non-stem cancer cells in human SW620 and MCF-7 cancer cell populations，BRITISH JOURNAL OF CANCER,2012,106,1512-1519.）利用小孔和微流道结合的方式，利用聚合物PDMS材料的特殊吸气性质，在去气后导入癌细胞，而后更替小孔中的癌细胞溶液为培养液，此操作杜绝了传统多孔板换液操作对细胞的影响，适合用以作癌细胞的染色和实时观测。该技术对于高通量的酵母细胞研究仍不适用。

发明内容

[0003] 针对研究细胞领域的不足之处，本发明提出一种多孔单细胞观测板。

[0004] 本发明另一目的是提出应用所述多孔单细胞观测板的方法。

[0005] 实现本发明上述目的的具体技术方案为：

[0006] 一种多孔单细胞观测板，包括多个小孔单元，每个小孔单元包括一个小孔、多个重复的细胞培养室和扩散通道，每个细胞培养室通过扩散通道与小孔连接。

[0007] 其中，小孔单元的数目为1-1000个，小孔的直径为2-4mm，小孔的孔间距为4-10mm且孔间距均相等。孔间距均等，使得该多孔单细胞观测板可以与本领域常用的排枪和自动点样仪所适配。

[0008] 所述扩散通道的高度、宽度或直径均大于细胞的特征尺寸。通道的尺寸大于细胞的直径，可以让细胞或细菌通过。例如，芽殖酵母细胞对于不同的突变株一般大小范围为3-7μm，裂殖酵母直径为3.5μm，杆菌尺度1-3μm。

[0009] 其中，细胞培养室的高度为细胞最小特征尺寸的1-2倍。细胞培养室的高度不超过所研究的细胞最小特征尺寸的两倍，细胞在培养室为单层生长。

[0010] 所述的多孔单细胞观测板是用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成。

[0011] 一种制备本发明提出的多孔单细胞观测板的方法，是使用软光刻和打孔的方法制备所述多孔单细胞观测板。

[0012] 应用本发明提出的多孔单细胞观测板观测细胞的方法，包括步骤：

[0013] 1）等离子处理所述多孔单细胞观测板，然后把所述多孔单细胞观测板置于一平面上；

[0014] 2）将含有细胞的溶液均匀加入所述多个小孔中；

[0015] 3）当所述小孔、细胞培养室、扩散通道均被含有细胞的溶液充满后，去除小孔内的残留的含有细胞的溶液。

[0016] 由于PDMS在等离子体处理后对液体的浸润性和对气体吸收的特性，细胞溶液自动被吸收入细胞（微生物）培养室，当细胞培养室被液体填充完成，细胞培养室内液体流速降为零。由于细胞培养腔室吸满后为死区，更替小孔内溶液时，细胞培养室液体不会流动，只通过扩散交换营养。

[0017] 其中，所述步骤3）中，去除小孔内的残留的含有细胞的溶液后，还包括用不含细胞的溶液充满小孔的步骤。通过排枪或者液体点样机更替小孔内的液体实现去除小孔内的细胞溶液并实现对细胞培养室内细胞（微生物）的环境更替。所述不含细胞的溶液优选使用细胞培养液。

[0018] 其中，所述步骤3）中，还包括覆盖所述多孔单细胞观测板的步骤。这样可防止液体蒸发。

[0019] 所述含有细胞的溶液可以是多种细胞溶液，例如，将不同的突变细菌菌株采用排枪或者点样仪分别加入不同的小孔中。

[0020] 本发明的有益效果在于：

[0021] 本发明提出的多孔单细胞观测板主要应用的方向为细胞生物学、高通量基因表型筛选等。本发明的装置采用小孔与细胞培养室结合的方式，可针对不同的酵母细胞菌群进行高通量的研究，1）采用小孔和为酵母细胞单层生长观测的特定高度的培养腔室，即培养腔室高度小于酵母细胞的2倍（优化值为1.5倍），使细胞单层生长，有利于观测研究；2）设计与排枪和液体自动点样仪匹配的孔间距，使得系统真正能实现高通化与自动化，更加适用于针对酵母相关基因功能的研究工作；3）覆盖该多孔单细胞观测板，可以只用10μl的液体，进行时间长达5-10小时左右的观测。通过细胞培养腔室和扩散通道的不同尺度的设计，还可以对多种微生物进行高通量研究。

附图说明

[0022] 图1是本发明实施例1计算机辅助绘制的掩膜版a。

[0023] 图2是本发明实施例1中计算机辅助绘制的掩膜版b。

[0024] 图3为本发明实施例1中多孔单细胞观测板的俯视图。

[0025] 图4是一个小孔单元的俯视图。

[0026] 图5是图4中圆圈部分的局部放大图。

[0027] 图中，1为小孔，2为细胞培养室，3为扩散通道。

具体实施方式

[0028] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0029] 其中PDMS预塑体购自GE公司，型号为RTV615。

[0030] 本发明提出的微流控芯片可用于人体细胞、植物细胞、动物细胞、细菌的研究，其-4 -6细胞线度为10 -10 m。

[0031] 实施例1：制备多孔单细胞观测板

[0032] 1）用L-Edit绘图，如图1和图2的掩模版a和掩模版b，掩膜版a的小孔直径为3mm，孔间距为4.5mm，该孔间距与排枪(DragonMed,DR27506 0.5μl-10μl 8通道排枪)相适配。掩膜版b为细胞培养室和扩散道图层，根据研究的微生物不同，扩散通道的横截面积可设计为细胞培养室面积的2-80%。本实施例中，细胞培养室为直径为250微米的小圆，高度为8μm，通过一段40微米宽、40微米高，60微米长的扩散道与小孔相连。重复小孔单元可为4×2个至36×16个。本实施例中，重复的小孔单元为12×4个。

[0033] 2)采用光刻胶SU83005，通过甩胶机在硅片上涂布上7微米的光刻胶（转速2000rpm，时间为30s），经过65摄氏度烘烤1分钟，95摄氏度烘烤5分钟前烘后，放于曝光
2
机下曝光，采用的掩模为所设计图2图形的阴版，曝光时间为50秒，光强为20mW/cm ；曝光后样品放于65摄氏度1分钟，95摄氏度后烘5分钟；经过显影液显影后，获得如图2的模具。再通过利用SU83025,步骤同上，前烘条件为65摄氏度1分钟，95摄氏度10分钟，采用
2
相应的掩模，曝光时间为90秒，光强20mW/cm，后烘条件为65摄氏度1分钟，95摄氏度10分钟。套刻图1的图层，制得如图3的模具。

[0034] 3）用液态的PDMS预塑体（A：B=8：1）倒在模具上，PDMS的高度大约为1-2mm，在75度烘箱中1h使得PDMS固化。切下后在相应的小孔处采用3mm直径的打孔器打孔后，用70%酒精超声清洁干净，待用。

[0035] 实施例2：应用实施例1的多孔单细胞观测板研究细胞

[0036] 实施例1制备的多孔单细胞观测板通过等离子处理后（等离子处理机，Harrick公司，PDC-002，处理一分钟）图形面向下放于干净的玻片上，采用排枪在不同的小孔内加入相7
同的尺度大小为4-5μm的芽殖酵母菌群1μl溶液（菌群密度3×10 个/ml）等待1分钟，细胞溶液可被吸入整个细胞腔室。采用排枪吸出小孔中的细胞溶液，用新鲜的培养液洗两次小孔（每次10μl），然后将小孔替换为希望细胞所处的溶液（YPDA培养液）环境后，用同样大小的玻片盖在PDMS多孔单细胞观测板的上方。

[0037] 将该装置放于带有自动平移台和自动对焦的显微镜系统上，即可对不同的细胞/细菌类型进行时序的单细胞记录。覆盖该多孔单细胞观测板，可进行时间长达10小时的观测。

[0038] 实施例3：用4×2的多孔单细胞观测板研究细胞

[0039] 共有4×2个小孔单元的多孔单细胞观测板通过等离子处理后图形面向下放于干净的玻片上，采用自动点样仪（beckman公司，biomek FX）在不同的小孔加入4种不同的芽7 7 7 7
殖酵母菌群1μl溶液（菌群密度2×10 个/ml、3×10 个/ml、4×10 个/ml、5×10 个/ml），等待2-3分钟，细胞溶液可吸满整个细胞腔室。采用自动点样仪吸出小孔中的细胞溶液，用新鲜的培养液洗两次小孔（每次10ul），然后将小孔替换为YPDA培养液环境后，用同样大小的玻片盖在PDMS多孔单细胞观测板的上方。

[0040] 将该装置放于带有自动平移台和自动对焦的显微镜系统上，即可对不同的细胞/细菌类型进行时序的单细胞记录。覆盖该多孔单细胞观测板，可进行时间长达10小时的观测。

[0041] 实施例4

[0042] 共有4×2个小孔单元的多孔单细胞观测板的小孔为400μm边长的正方形,其它同实施例1。

[0043] 实施例5

[0044] 多孔单细胞观测板用于裂殖酵母或大肠杆菌的实验。本实施例中，所研究大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）细胞最小特征尺寸为1μm（杆状，直径为1μm，长度为3-8μm）。所使用的多孔单细胞观测板共36×16个重复的小孔单元。细胞培养室高度为
1.5μm。扩散通道高和宽均为4μm。

[0045] 实施例6

[0046] 4×2的多孔单细胞观测板用于不同菌株在不同环境下的并行比较，例如各种突变株，营养，抗生素等。本实施例中，使用芽殖酵母的突变株，共四种，分别加入到不同小孔单元中，进行并行比较。

[0047] 以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。