生物法制备γ-氨基丁酸的方法

摘要

本发明公开了一种生物法制备γ-氨基丁酸的方法，包括菌体制备、生产γ-氨基丁酸、脱色、电渗析、制成γ-氨基丁酸粉剂产品或γ-氨基丁酸晶体产品等步骤。本发明利用游离乳酸菌细胞催化合成γ-氨基丁酸，并改进生产工艺，使γ-氨基丁酸产量提高，成本降低，而且还建立了制备高纯度γ-氨基丁酸的方法。本工艺中反应体系里不含有碳源、氮源等培养成分，相对于发酵液而言反应液成分简单，可大幅度提高产品纯度，同时具有后处理简单、生产周期短及环境污染小、成本低等优点。

权利要求

1.一种生物法制备γ-氨基丁酸的方法，其特征是：包括下列步骤：

（1）菌体制备：

在培养基中添加1-30g/L的谷氨酸钠作为诱导剂，进行诱导产酶，接入产胞内谷氨酸脱羧酶的菌株进行培养；培养条件为：培养温度25～35℃，发酵过程中通过补加碱液进行pH控制，使发酵液pH维持在4.5-7.0范围内，培养时间8～24小时；培养结束后得到菌液；

所使用的培养基的组成及以g/L计的含量为：

葡萄糖10-30，酵母膏 5-30，蛋白胨5-30，乙酸钠0.5-5，磷酸氢二钠或磷酸氢二钾

0.05-10，硫酸镁0.05-10，硫酸锰0.05-1，PPE聚醚消泡剂0.1-3；

（2）陶瓷膜过滤收集菌体：将步骤（1）得到的菌液经过陶瓷膜过滤收集菌体，膜孔径为

0.05-1μm，得到菌体；

（3）生产γ-氨基丁酸：

配制0.01-0.5mol/L pH3-7的缓冲液，加入10-100g/L菌体细胞，分批加入底物谷氨酸钠，添加浓度为25g/L，在反应温度为28-40℃的条件下，通过再次发酵来生产γ-氨基丁酸，发酵时间为10-50h；发酵结束后，通过离心收集清液；

（4）将步骤（3）得到的清液经金属微米膜过滤器进一步除去菌体细胞，得到清液；

（5）脱色：先将步骤（4）得到的清液pH调至7.0-8.0，然后通过颗粒活性炭柱进行脱色处理，收集清液；

（6）电渗析：采用电渗析去除杂质，控制料液pH为7.0-8.0，在电导率下降至≤1000μs/cm时，停止循环，收集γ-氨基丁酸清液；

（7）将步骤（6）得到的γ-氨基丁酸清液，制成γ-氨基丁酸粉剂产品或γ-氨基丁酸晶体产品；

所述制成γ-氨基丁酸粉剂产品的方法依次包括下列步骤：

（a）真空浓缩：采用三效板式蒸发器进行浓缩，待料液浓缩至γ-氨基丁酸含量为≥80g/L时，停止浓缩，收集浓缩液；

（b）喷雾干燥：在浓缩液中添加麦芽糊精或淀粉，调节固形物质量含量为5-50%，进行喷雾干燥，制得质量含量为20-50%的γ-氨基丁酸粉剂产品；

所述制成γ-氨基丁酸晶体产品的方法是：将步骤（6）得到的γ-氨基丁酸清液，经过离子交换树脂处理；然后将料液pH调至γ-氨基丁酸等电点，通过降温结晶，得到γ-氨基丁酸晶体产品；所述离子交换树脂先选用阴离子交换树脂，以去除残留的底物谷氨酸钠，再经过酸性阳离子交换树脂，对γ-氨基丁酸进行吸附、洗脱处理；所述阴离子交换树脂为D301、D296或201型强碱或弱碱性阴离子交换树脂；所述阳离子交换树脂是001或D113型强酸或弱酸性阳离子交换树脂；结晶采用等电点降温结晶法，将经离子交换树脂处理后得到的料液进行结晶或添加乙醇进行结晶，添加比例为乙醇：料液=1～10：1（V/V）；结晶时调节溶液pH值至γ-氨基丁酸的等电点7.2，温度降温范围为90～5℃，晶种的添加量为

0. 2-10g/L，搅拌速率为30-100r/min，降温速率为1-10℃/h。

说明书

生物法制备γ-氨基丁酸的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种制备γ-氨基丁酸的方法。

背景技术

[0002] γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA），又称氨酪酸，是一种天然存在的非蛋白质组成氨基酸，广泛分布于原核和真核生物中。γ-氨基丁酸是哺乳动物中枢神经系统的抑制性传递物质，具有镇静神经、促进睡眠、降低血压、健脑益智、延缓衰老、健肝利肾等重要的生理功能。

[0003] 至今为止，γ-氨基丁酸的制备方法主要有化学合成法和生物法两种。常见的化学合成方法是如以吡咯烷酮作为原料，经氢氧化钙、碳酸氢铵水解制得γ-氨基丁酸。化学合成法成本较高，得率较低，并且在生产工艺中使用危险溶剂，甚至是强腐蚀、有毒溶剂。因此，化学合成法制备的γ-氨基丁酸很难在食品工厂实现，制品也不能被认为是一种天然食品添加剂。生物法相比较来说是一种既安全、成本又低的方法。根据最新专利报道，生物法生产γ-氨基丁酸的菌种有（1）天然原始菌株，包括短乳杆菌（专利号 ZL200510049187.5）、曲霉（公开号 CN 101302480 B）、植物乳杆菌（公开号 CN 101928679 A）、乳酸菌（公开号 CN 1243101 C）或天然食材富集（公开号 CN 1840672 A）；（2）重组菌：大肠杆菌（公开号 CN 1298860 C）、谷氨酸棒杆菌（公开号 CN 101945997 A）（3）诱变菌株： 短乳杆菌（公开号 CN 102174449 A）。现有方法中，γ-氨基丁酸多产生于发酵液中，由于发酵液成分复杂，下游分离纯化过程繁琐，目标产物的浓度也较低，这些因素限制了国内工业化生产，而关于制备高纯度γ-氨基丁酸更是鲜有报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种方法简便、易操作，效果好的生物法制备γ-氨基丁酸的方法。

[0005] 本发明的技术解决方案是：

[0006] 一种生物法制备γ-氨基丁酸的方法，其特征是：包括下列步骤：

[0007] （1）菌体制备：

[0008] 在培养基中添加1-30g/L的谷氨酸钠作为诱导剂，进行诱导产酶，接入产胞内谷氨酸脱羧酶的菌株进行培养；培养条件为：培养温度25～35℃，发酵过程中通过补加碱液进行pH控制，使发酵液pH维持在4.5-7.0范围内，培养时间8～24小时；培养结束后得到菌液；

[0009] （2）陶瓷膜过滤收集菌体：将步骤（1）得到的菌液经过陶瓷膜过滤收集菌体，膜孔径为0.05-1μm，得到菌体；

[0010] （3）生产γ-氨基丁酸：

[0011] 配制0.01-0.5mol/L pH3-7的缓冲液，加入10-100g/L菌体细胞，分批加入底物谷氨酸钠，添加浓度为0-30g/L，在反应温度为28-40℃的条件下，通过再次发酵来生产γ-氨基丁酸，发酵时间为10-50h；发酵结束后，通过离心收集清液；

[0012] （4）将步骤（3）得到的清液经金属微米膜过滤器进一步除去菌体细胞，得到清液；

[0013] （5）脱色：先将步骤（4）得到的清液pH调至7.0-8.0，然后通过颗粒活性炭柱进行脱色处理，收集清液；

[0014] （6）电渗析：采用电渗析去除杂质，控制料液pH为7.0-8.0，在电导率下降至≤1000μs/cm时，停止循环，收集γ-氨基丁酸清液；

[0015] （7）将步骤（6）得到的γ-氨基丁酸清液，制成γ-氨基丁酸粉剂产品或γ-氨基丁酸晶体产品。

[0016] 所述制成γ-氨基丁酸粉剂产品的方法依次包括下列步骤：

[0017] （a）真空浓缩：采用三效板式蒸发器进行浓缩，待料液浓缩至γ-氨基丁酸含量为≥80g/L时，停止浓缩，收集浓缩液；

[0018] （b）喷雾干燥：在浓缩液中添加麦芽糊精或淀粉，调节固形物质量含量为5-50%，进行喷雾干燥，制得质量含量为20-50%的γ-氨基丁酸粉剂产品。

[0019] 所述制成γ-氨基丁酸晶体产品的方法是：将步骤（6）得到的γ-氨基丁酸清液，经过离子交换树脂处理；然后将料液pH调至γ-氨基丁酸等电点，通过降温结晶，得到γ-氨基丁酸晶体产品。

[0020] 步骤（1）所述产胞内谷氨酸脱羧酶的菌株为乳酸菌或希氏乳杆菌。

[0021] 步骤（1）所使用的培养基的组成及以g/L计的含量为：

[0022] 葡萄糖10-30，酵母膏 5-30，蛋白胨.5-30，乙酸钠0.5-5，磷酸氢二钠或磷酸氢二钾0.05-10，硫酸镁0.05-10，硫酸锰0.05-1，PPE聚醚消泡剂0.1-3。

[0023] 所述离子交换树脂先选用阴离子交换树脂，以去除残留的底物谷氨酸钠，再经过酸性阳离子交换树脂，对γ-氨基丁酸进行吸附、洗脱处理。

[0024] 所述阴离子交换树脂为D301、D296或201型强碱或弱碱性阴离子交换树脂；所述阳离子交换树脂是001或D113型强酸或弱酸性阳离子交换树脂。

[0025] 结晶采用等电点降温结晶法，将经离子交换树脂处理后得到的料液进行结晶或添加乙醇进行结晶，添加比例为乙醇：料液=0～10：1V/V；结晶时调节溶液pH值至γ-氨基丁酸的等电点7.2，温度降温范围为90～5℃，晶种的添加量为0. 2-10g/L，搅拌速率为30-100r/min，降温速率为1-10℃/h。

[0026] 本发明利用游离乳酸菌细胞催化合成γ-氨基丁酸，并改进生产工艺，使γ-氨基丁酸产量提高，成本降低，而且还建立了制备高纯度γ-氨基丁酸的方法。本工艺中反应体系里不含有碳源、氮源等培养成分，相对于发酵液而言反应液成分简单，可大幅度提高产品纯度，同时具有后处理简单、生产周期短及环境污染小、成本低等优点。

附图说明

[0027] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

[0028] 图1是本发明一个实施例工业化制备过程中γ-氨基丁酸生成曲线。

[0029] 图2是用乳酸菌细胞转化生成γ-氨基丁酸的转化液的氨基酸检测结果。Glu：谷氨酸；GABA：γ-氨基丁酸。

具体实施方式

[0030] 本发明的γ-氨基丁酸是指4-氨基丁酸，是哺乳动物中枢神经系统抑制性递质。作为新资源食品，可添加到饮料、可可制品、巧克力和巧克力制品、糖果、焙烤食品、膨化食品中，开发新型产品。

[0031] 实施例1：

[0032] 一、菌体培养

[0033] 乳酸菌菌种经活化后，进行一级种子培养，二级种子培养，最后进入发酵罐培养，接种量3%（V/V，种子液/发酵液）， 30℃静置培养16 h，发酵过程中通过补加碱液进行pH控制，使发酵液pH维持在4.5-7.0范围内，通过0.6μm陶瓷膜过滤收集菌体。

[0034] 种子培养基原料以g/L计：葡萄糖10，酵母膏 5，蛋白胨5，乙酸钠0.5，磷酸氢二钠（或磷酸氢二钾）1，硫酸镁1，硫酸锰1，PPE聚醚消泡剂0.1（但不仅限于此消泡剂，可选用任何可用于发酵工业的消泡剂）。

[0035] 发酵培养基配方以g/L计：葡萄糖10，酵母膏 5，蛋白胨5，乙酸钠0.5，谷氨酸钠1，磷酸氢二钠（或磷酸氢二钾）1，硫酸镁1，硫酸锰1，PPE聚醚消泡剂0.1（但不仅限于此消泡剂，可选用任何可用于发酵工业的消泡剂）。

[0036] 二、生产γ-氨基丁酸

[0037] 采用乳酸菌细胞转化法生产γ-氨基丁酸，反应条件为：配制0.01mol/L pH7的醋酸-醋酸钠缓冲液，加入20g/L菌体细胞，分批加入底物谷氨酸钠，初始底物浓度10g/L，每4h添加一次底物，添加浓度为5g/L，总反应底物浓度为25g/L，反应温度为28℃，发酵时间为17h。结束后，通过离心收集清液，得到含量达12g/L的γ-氨基丁酸转化液，见图1。

[0038] 三、 γ-氨基丁酸含量的检测

[0039] 将上述转化液离心后加入等体积100g/L的三氯乙酸，振荡均匀，再离心（10,000×g，5 min），清液稀释2-10倍，再经0.45 μm膜过滤，进行高效液相分析。采用oODS C18（φ4.6×250nm），40C分析，γ-氨基丁酸用外标法定量。

[0040] 四、产品制备：

[0041] 过滤除菌：将得到的γ-氨基丁酸转化液经金属微米膜过滤器进一步除去菌体细胞，得到清液；

[0042] 脱色：将过滤除菌后得到的清液pH调至7.0-8.0，然后通过颗粒活性炭柱进行脱色处理，收集清液；

[0043] 电渗析：采用电渗析去除杂质，控制料液pH为7.0-8.0，在电导率下降至≤1000μs/cm时，停止循环，收集γ-氨基丁酸清液；

[0044] 将步骤（4）得到的γ-氨基丁酸清液，制成γ-氨基丁酸粉剂产品或γ-氨基丁酸晶体产品。

[0045] 所述制成γ-氨基丁酸粉剂产品的方法依次包括下列步骤：

[0046] （a）真空浓缩：采用三效板式蒸发器进行浓缩，待料液浓缩至γ-氨基丁酸含量为≥50g/L时，停止浓缩；

[0047] （b）喷雾干燥：浓缩液中添加麦芽糊精或淀粉，调节固形物质量含量为5-50%，进行喷雾干燥，制得质量含量为20-50%的γ-氨基丁酸粉剂产品；

[0048] 所述制成γ-氨基丁酸粉剂产品的方法依次包括下列步骤：

[0049] （a）真空浓缩：采用三效板式蒸发器进行浓缩，待料液浓缩至γ-氨基丁酸含量为≥80g/L时，停止浓缩，收集浓缩液；

[0050] （b）喷雾干燥：在浓缩液中添加麦芽糊精或淀粉，调节固形物质量含量为5-50%，进行喷雾干燥，制得质量含量为20-50%的γ-氨基丁酸粉剂产品。

[0051] 所述制成γ-氨基丁酸晶体产品的方法是：将步骤（6）得到的γ-氨基丁酸清液，经过离子交换树脂处理；然后将料液pH调至γ-氨基丁酸等电点，通过降温结晶，得到纯度达到98%的γ-氨基丁酸晶体产品。

[0052] 实施例2：

[0053] 一种生物法制备γ-氨基丁酸的方法，包括下列步骤：

[0054] （1）菌体制备：

[0055] 在培养基中添加谷氨酸钠，添加量为1-30g/L（例1 g/L、15 g/L、30 g/L）的作为诱导剂，进行诱导产酶，接入产胞内谷氨酸脱羧酶的菌株进行培养；培养条件为：培养温度25～35℃（例25℃、30℃、35℃），发酵过程中通过补加碱液进行pH控制，使发酵液pH维持在4.5-7.0范围内，培养时间8～24小时（例8h、16h、24h）；培养结束后得到菌液；

[0056] （2）陶瓷膜过滤收集菌体：将步骤（1）得到的菌液经过陶瓷膜过滤收集菌体，膜孔径为0.05-1μm（例0.05μm、0.5μm、1μm），得到菌体；

[0057] （3）生产γ-氨基丁酸：

[0058] 配制0.01-0.5mol/L（例0.01 mol/L、0.2 mol/L、0.5 mol/L） pH3-7（例3、5、7）的缓冲液，加入菌体细胞，菌体细胞加入量为10-100g/L（例10 g/L、50 g/L、100 g/L），分批加入底物谷氨酸钠，添加浓度为1-30g/L（例1g/L、15 g/L、30 g/L），在反应温度为28-40℃（例28℃、32℃、40℃）的条件下，通过再次发酵来生产γ-氨基丁酸，发酵时间为10-50h（例10h、25h、50h）；发酵结束后，通过离心收集清液；

[0059] （4）将步骤（3）得到的清液经金属微米膜过滤器进一步除去菌体细胞，得到清液；

[0060] （5）脱色：先将步骤（4）得到的清液pH调至7.0-8.0，然后通过颗粒活性炭柱进行脱色处理，收集清液；

[0061] （6）电渗析：采用电渗析去除杂质，控制料液pH为7.0-8.0，在电导率下降至≤1000μs/cm时，停止循环，收集γ-氨基丁酸清液；

[0062] （7）将步骤（6）得到的γ-氨基丁酸清液，制成γ-氨基丁酸粉剂产品或γ-氨基丁酸晶体产品。

[0063] 所述制成γ-氨基丁酸粉剂产品的方法依次包括下列步骤：

[0064] （a）真空浓缩：采用三效板式蒸发器进行浓缩，待料液浓缩至γ-氨基丁酸含量为≥80g/L时，停止浓缩，收集浓缩液；

[0065] （b）喷雾干燥：在浓缩液中添加麦芽糊精或淀粉，调节固形物质量含量为5-50%（例5%、30%、50%），进行喷雾干燥，制得质量含量为20-50%的γ-氨基丁酸粉剂产品。

[0066] 所述制成γ-氨基丁酸晶体产品的方法是：将步骤（6）得到的γ-氨基丁酸清液，经过离子交换树脂处理；然后将料液pH调至γ-氨基丁酸等电点，通过降温结晶，得到γ-氨基丁酸晶体产品。

[0067] 步骤（1）所述产胞内谷氨酸脱羧酶的菌株为乳酸菌或希氏乳杆菌。

[0068] 步骤（1）所使用的培养基的组成及以g/L计的含量为：

[0069] 葡萄糖10-30（例10、20、30），酵母膏 5-30（例5、20、30），蛋白胨.5-30（例5、20、30），乙酸钠0.5-5（例0.5、3、5），磷酸氢二钠或磷酸氢二钾0.05-10（例0.05、5、10），硫酸镁0.05-10（例0.05、5、10），硫酸锰0.05-1（例0.05、0.5、1），PPE聚醚消泡剂0.1-3（例
0.1、1、3）。

[0070] 所述离子交换树脂先选用阴离子交换树脂，以去除残留的底物谷氨酸钠，再经过酸性阳离子交换树脂，对γ-氨基丁酸进行吸附、洗脱处理。

[0071] 所述阴离子交换树脂为D301、D296或201型强碱或弱碱性阴离子交换树脂；所述阳离子交换树脂是001或D113型强酸或弱酸性阳离子交换树脂。

[0072] 结晶采用等电点降温结晶法，将经离子交换树脂处理后得到的料液进行结晶或添加乙醇进行结晶，添加比例为乙醇：料液=0～10：1V/V（例1:1、5:1、10:1）；结晶时调节溶液pH值至γ-氨基丁酸的等电点7.2，温度降温范围为90～5℃（例90℃、40℃、5℃），晶种的添加量为0. 2-10g/L（例0.2 g/L、5 g/L、10 g/L），搅拌速率为30-100r/min，降温速率为1-10℃/h（例1℃/h、5℃/h、10℃/h）。