本发明公开了一种荧光增白剂CBS-X检测试剂盒，属于添加剂检测技术领域。该试剂盒包括每个微孔内包被浓度为1-3μg/mL荧光增白剂CBS-X特异性抗原的酶标板，浓度为1-3μg/mL的荧光增白剂CBS-X特异性抗体，且所述荧光增白剂CBS-X特异性抗原与荧光增白剂CBS-X特异性抗体溶液的用量比为1：1。本发明还公开了一种荧光增白剂CBS-X检测试剂盒制备方法。本发明的试剂盒在检测荧光增白剂CBS-X时可一次连续检测多个样品，具有便捷，快速，灵敏、成本低的特点。适合用于快速而准确得检测大批量样品中的荧光增白剂CBS-X。
1.一种荧光增白剂CBS-X检测试剂盒，其特征在于，主要包括：
1）包被荧光增白剂CBS-X特异性抗原的酶标板：所述酶标板的每个微孔内荧光增白剂CBS-X特异性抗原的浓度为1-3μg/mL；
2）荧光增白剂CBS-X特异性抗体溶液：该荧光增白剂CBS-X特异性抗体的浓度为
所述荧光增白剂CBS-X特异性抗原与荧光增白剂CBS-X特异性抗体溶液的用量比为1：
2.根据权利要求1所述的荧光增白剂CBS-X检测试剂盒，其特征在于，还包括有酶标二抗，所述酶标二抗是浓度按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗。
3.根据权利要求1或2所述的荧光增白剂CBS-X检测试剂盒，其特征在于，所述荧光增白剂CBS-X特异性抗原的浓度为2μg/mL；所述荧光增白剂CBS-X特异性抗体的浓度为
4.根据权利要求1所述的荧光增白剂CBS-X检测试剂盒，其特征在于，还包括荧光增白剂CBS-X标准品溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液、封闭液和浓缩样品稀释液。
5.根据权利要求4所述的荧光增白剂CBS-X检测试剂盒，其特征在于，所述荧光增白剂CBS-X特异性抗体是鼠源单克隆抗体；所述荧光增白剂CBS-X特异性抗原为荧光增白剂CBS-X与载体蛋白的偶联物；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清白蛋5
白、甲状腺球蛋白中的一种；所述荧光增白剂CBS-X标准品溶液浓度分别为1×10μg/L、
1×10μg/L、1×10μg/L、1×10μg/L、1×10μg/L、1×10μg/L；所述显色剂由显色剂A和显色剂B组成，所述显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，所述显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述终止液为1-2mol/L的硫酸溶液；所述洗涤液为含有0.05%-0.5%吐温-20的
0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述封闭液为含5%脱脂奶粉的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述浓缩样品稀释液为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述酶标板的材料为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的一种。
6.一种荧光增白剂CBS-X检测试剂盒制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
1）制备包被荧光增白剂CBS-X特异性抗原的酶标板：将2-磺酸基苯甲醛、2-磺酸基-5羟基-苯甲醛和荧光增白剂CBS-X分散于干燥DMSO中，加入哌啶，微波加热，反应结束倒入水中，抽滤固体，得到带有酚羟基的荧光增白剂CBS-X衍生物；将带酚羟基的荧光增白剂CBS-X衍生物和碳酸钾分散于干燥DMF中，常温搅拌，加入N-(3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯，加热回流，荧光增白剂CBS-X的酚羟基被叔丁氧酰胺丙氧基所取代；随后将中间产物加入三氟乙酸中，回流搅拌，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的荧光增白剂CBS-X的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合后反应，与载体蛋白偶联制备得到荧光增白剂CBS-X特异性抗原，将荧光增白剂CBS-X特异性抗原包被于酶标板中，所述酶标板的每个微孔内荧光增白剂CBS-X特异性抗原的浓度为1-3μg/mL；
2）制备荧光增白剂CBS-X特异性抗体：以步骤1)中合成的荧光增白剂CBS-X特异性抗原作为免疫原对小鼠进行免疫；免疫后，取血清效价高的小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠，将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的荧光增白剂CBS-X单克隆抗体；所述荧光增白剂CBS-X特异性抗体的浓度为1-3μg/mL。
7.根据权利要求6所述的荧光增白剂CBS-X检测试剂盒制备方法，其特征在于，步骤
1）中，制备荧光增白剂CBS-X特异性抗原的具体方法为：将0.186g的2-磺酸基苯甲醛、
0.20g的2-磺酸基-5羟基-苯甲醛和0.40g的荧光增白剂CBS-X分散于30mL干燥DMSO中，加入哌啶3mL，微波500瓦加热5min，反应结束倒入水中，抽滤固体，得到带有酚羟基的荧光增白剂CBS-X衍生物；将0.53g的带酚羟基的荧光增白剂CBS-X衍生物和1.01g的碳酸钾分散于80mL干燥DMF中，常温搅拌30min，加入1.2g的N-(3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯，加热回流5h，荧光增白剂CBS-X的酚羟基被叔丁氧酰胺丙氧基所取代；随后将中间产物加入30倍的三氟乙酸中，回流搅拌1h，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的荧光增白剂CBS-X的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合后反应，与牛血清白蛋白偶联制备得到荧光增白剂CBS-X特异性抗原。
8.根据权利要求6所述的荧光增白剂CBS-X检测试剂盒制备方法，其特征在于，步骤
以步骤1)中合成的荧光增白剂CBS-X特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫，首次免疫使用完全弗氏佐剂与荧光增白剂CBS-X特异性抗原溶液乳化，抗原浓度为0.5mg/mL，剂量为100μg/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与荧光增白剂CBS-X特异性抗原溶液乳化，剂量同初次免疫；初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次，共免疫8-10次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫；最后一次不加免疫佐剂直接用荧光增白剂CBS-X特异性抗原水溶液直接腹腔注射，剂量同初次免疫；尾部取血检测血清效价；取血清效价高的小鼠，在无菌条件下，取其脾细胞按6:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为0.5mL/只；将细胞浓度为1.5万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为0.5mL/只；接种杂交瘤细胞6-10天后，收集腹水，反复收集数次；存于4℃冰箱保存；
经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的荧光增白剂CBS-X单克隆抗体。
荧光增白剂CBS-X检测试剂盒及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种添加剂检测技术，具体来说，特别是涉及一种用于荧光增白剂CBS-X含量的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
[0002] 荧光增白剂CBS-X，化学名称为4,4′-双(2-磺酸钠苯乙烯基)联苯，属双二苯乙烯-联苯型光学增白剂，特点是增白强度高,耐氯漂,氧漂性能优良,具有优异的耐洗牢度和干、湿日晒度,匀染性能良好，适合用于洗涤用品，也可直接用于纺织品、纸张的光学增白。
[0003] 长期以来，荧光增白剂的安全性颇受争议，有资料显示荧光增白剂是低毒的，也有资料显示荧光增白剂的分子结构稳定，不易被分解，在生物体内长期累积，会使细胞发生变异，产生潜在的致癌因素。因此，在未充分评估荧光增白剂的安全性的情况下，并不是所有荧光增白剂都被允许使用，欧盟、美国、日本、中国等许多国家对荧光增白剂都有一定的监管，相关法规如欧盟2002/72/EC指令、美国联邦法规21CFR178.3297和GB 9685-2008《食品容器、包装材料用添加剂使用卫生标准》都制定了允许用于生产塑料食品接触材料和制品的添加剂清单，对允许使用的荧光增白剂的最大添加量进行限制。鉴于此，建立相关产品的荧光增白剂的快速检测方法，开展定期监测和安全性评估，对于规范行业发展，保证产品质量，保护消费者身体健康和保护环境等具有深远的意义。而荧光增白剂CBS-X做为允许添加的荧光增白剂中的一种，也亟需一种合适的快速检测方法。
[0004] 目前，国内外对荧光增白剂的检测方法包括以下几种：紫外灯直接照射观测法、色谱法、色谱质谱联用法。其中，紫外灯直接照射观测法只是一种简单的判断，不能鉴别荧光增白剂的种类；色谱法和色谱质谱联用法具有特异性高、结果准确的优点，但是这两种方法的缺点是样品前处理繁琐，消耗大量溶剂，且需要昂贵的实验室设备，检测成本高。
发明内容
[0005] 基于此，本发明在于克服现有技术的缺陷，提供一种荧光增白剂CBS-X检测试剂盒和一种荧光增白剂CBS-X试剂盒制备方法，该试剂盒在检测荧光增白剂CBS-X时可一次连续检测多个样品，具有便捷，快速，灵敏、成本低的特点。
[0006] 本发明的第一个目的在于提供一种荧光增白剂CBS-X检测试剂盒，其技术方案如下：一种荧光增白剂CBS-X检测试剂盒，主要包括：
[0007] 1）包被荧光增白剂CBS-X特异性抗原的酶标板：所述酶标板的每个微孔内荧光增白剂CBS-X特异性抗原的浓度为1-3μg/mL；
[0008] 2）荧光增白剂CBS-X特异性抗体溶液：该荧光增白剂CBS-X特异性抗体的浓度为1-3μg/mL；
[0009] 所述荧光增白剂CBS-X特异性抗原与荧光增白剂CBS-X特异性抗体溶液的用量比为1：1。
[0010] 在其中一个实施例中，所述荧光增白剂CBS-X检测试剂盒还包括有酶标二抗，所述酶标二抗是浓度按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗。
[0011] 在其中一个实施例中，所述荧光增白剂CBS-X特异性抗原的浓度为2μg/mL；所述荧光增白剂CBS-X特异性抗体的浓度为2μg/mL。
[0012] 在其中一个实施例中，所述荧光增白剂CBS-X检测试剂盒还包括荧光增白剂CBS-X标准品溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液、封闭液和浓缩样品稀释液。
[0013] 在其中一个实施例中，所述特异性荧光增白剂CBS-X特异性抗体是鼠源单克隆抗体；所述荧光增白剂CBS-X特异性抗原为荧光增白剂CBS-X与载体蛋白的偶联物；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清白蛋白、甲状腺球蛋白中的一种；所述荧光增5 4 3 2
白剂CBS-X标准品溶液浓度分别为1×10μg/L、1×10μg/L、1×10μg/L、1×10μg/L、
1 0
1×10μg/L、1×10μg/L；所述显色剂由显色剂A和显色剂B组成，所述显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，所述显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述终止液为1-2mol/L的硫酸溶液；所述洗涤液为含有0.05%-0.5%吐温-20的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述封闭液为含5%脱脂奶粉的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述浓缩样品稀释液为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述酶标板的材料为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的一种。
[0014] 本发明的第二个目的在于提供一种荧光增白剂CBS-X检测试剂盒制备方法，主要包括以下步骤：
[0015] 1）制备包被荧光增白剂CBS-X特异性抗原的酶标板：将2-磺酸基苯甲醛、2-磺酸基-5羟基-苯甲醛和荧光增白剂CBS-X分散于干燥DMSO中，加入哌啶，微波加热，反应结束倒入水中，抽滤固体，得到带有酚羟基的荧光增白剂CBS-X衍生物；将带酚羟基的荧光增白剂CBS-X衍生物和碳酸钾分散于干燥DMF中，常温搅拌，加入N-(3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯，加热回流，荧光增白剂CBS-X的酚羟基被叔丁氧酰胺丙氧基所取代；随后将中间产物加入三氟乙酸中，回流搅拌，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的荧光增白剂CBS-X的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺（NHS）和碳二亚胺（EDC）混合后反应，与载体蛋白偶联制备得到荧光增白剂CBS-X特异性抗原，将荧光增白剂CBS-X特异性抗原包被于酶标板中，所述酶标板的每个微孔内荧光增白剂CBS-X特异性抗原的浓度为1-3μg/mL；
[0016] 2）制备荧光增白剂CBS-X特异性抗体：以步骤1)中合成的荧光增白剂CBS-X特异性抗原作为免疫原对小鼠进行免疫；免疫后，取血清效价高的小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠，将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的荧光增白剂CBS-X单克隆抗体；所述荧光增白剂CBS-X特异性抗体的浓度为1-3μg/mL。
[0017] 在其中一个实施例中，上述步骤1）中，制备荧光增白剂CBS-X特异性抗原的方法优选为：将0.186g,即1.0mmol的2-磺酸基苯甲醛、0.20g,即1.0mmol的2-磺酸基-5羟基-苯甲醛和0.40g，即1.0mmol的荧光增白剂CBS-X分散于30mL干燥DMSO中，加入哌啶3mL，微波500瓦加热5min，反应结束倒入水中，抽滤固体，得到带有酚羟基的荧光增白剂CBS-X衍生物；将0.53g，即1.0mmol的带酚羟基的荧光增白剂CBS-X衍生物和1.01g,即
10mmol的碳酸钾分散于80mL干燥DMF中，常温搅拌30min，加入1.2g,即5mmol的N-(3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯，加热回流5h，荧光增白剂CBS-X的酚羟基被叔丁氧酰胺丙氧基所取代；随后将中间产物加入30倍的三氟乙酸（TFA）中，回流搅拌1h，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的荧光增白剂CBS-X的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合后反应，与牛血清白蛋白偶联制备得到荧光增白剂CBS-X特异性抗原。
[0018] 在其中一个实施例中，上述步骤2）为：以步骤1)中合成的荧光增白剂CBS-X特异性抗原作为免疫原对10周龄的Ba lb/c小鼠进行免疫，首次免疫使用完全弗氏佐剂与荧光增白剂CBS-X特异性抗原溶液乳化，抗原浓度为0.5mg/mL，剂量为100μg/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与荧光增白剂CBS-X特异性抗原溶液乳化，剂量同初次免疫；初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次，共免疫8-10次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫；最后一次不加免疫佐剂直接用荧光增白剂CBS-X特异性抗原水溶液直接腹腔注射，剂量同初次免疫；尾部取血检测血清效价；取血清效价高的小鼠，在无菌条件下，取其脾细胞按6:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为0.5mL/只；将细胞浓度为1.5万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为0.5mL/只；接种杂交瘤细胞6-10天后，收集腹水，反复收集数次；存于4℃冰箱保存；经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的荧光增白剂CBS-X单克隆抗体。
[0019] 本发明的荧光增白剂CBS-X检测原理为：
[0020] 将荧光增白剂CBS-X特异性抗原吸附于固相载体上，加入样品或荧光增白剂CBS-X的标准溶液及荧光增白剂CBS-X特异性抗体工作液，待测样品中荧光增白剂CBS-X和固相载体上包被的荧光增白剂CBS-X特异性抗原竞争结合荧光增白剂CBS-X特异性抗体，孵育后，加入酶标二抗进行酶活性的放大作用，孵育，显色后终止，测定样品的吸光度，该值与样品中荧光增白剂CBS-X的量呈负相关，与标准曲线比较即可得出荧光增白剂CBS-X浓度范围。
[0021] 下面对前述技术方案的优点进行说明：
[0022] 本发明的荧光增白剂CBS-X检测试剂盒，利用竞争酶联免疫测定法检测荧光增白剂CBS-X，具有特异性高，结果准确且前处理简单，对仪器设备要求低、检测成本低的特点。同时，本试剂盒中的试剂以工作液形式提供，操作简单、快捷，为使用者节省了时间并减少因步骤复杂造成的误差。适合用于快速而准确得检测大批量样品中的荧光增白剂CBS-X。
具体实施方式
[0023] 下面对本发明的实施例进行详细说明，但不对本发明的内容造成任何限制。
[0024] 实施例1
[0025] 本实施例所述的荧光增白剂CBS-X检测试剂盒的主要组成成份如下：
[0026] 1）荧光增白剂CBS-X特异性抗原工作液；
[0027] 通过以下方法制得：将0.186g,即1.0mmol的2-磺酸基苯甲醛、0.20g,即1.0mmo l的2-磺酸基-5羟基-苯甲醛和0.40g，即1.0mmol的荧光增白剂CBS-X分散于30mL干燥DMSO中，加入哌啶3mL，微波500瓦加热5min，反应结束倒入水中，抽滤固体，得到带有酚羟基的荧光增白剂CBS-X衍生物；将0.53g，即1.0mmo l的带酚羟基的荧光增白剂CBS-X衍生物和1.01g,即10mmol的碳酸钾分散于80mL干燥DMF中，常温搅拌30min，加入1.2g,即5mmol的N-(3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯，加热回流5h，荧光增白剂CBS-X的酚羟基被叔丁氧酰胺丙氧基所取代；随后将中间产物加入30倍的三氟乙酸（TFA）中，回流搅拌1h，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的荧光增白剂CBS-X的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺（NHS）和碳二亚胺（EDC）混合，与牛血清白蛋白混合，室温搅拌1h，偶联制备荧光增白剂CBS-X特异性抗原，并用浓缩样品稀释液稀释至浓度为2μg/mL。
[0028] 2）荧光增白剂CBS-X特异性抗体工作液；
[0029] 通过以下方法制得：将合成得到的荧光增白剂CBS-X特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫。首次免疫使用完全弗氏佐剂与荧光增白剂CBS-X特异性抗原的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液乳化，抗原浓度为0.5mg/mL，剂量为100μg/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与荧光增白剂CBS-X特异性抗原的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液乳化，剂量同初次免疫。初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次，共免疫8-10次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫。最后一次不加免疫佐剂直接用荧光增白剂CBS-X特异性抗原的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液直接腹腔注射，剂量同初次免疫。尾部取血检测血清效价。取血清效价高的小鼠，在无菌条件下，取其脾细胞按6:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株。
[0030] 单克隆抗体的制备与纯化：Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为0.5mL/只。将细胞浓度为1.5万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为0.5mL/只。接种杂交瘤细胞6-10天后，收集腹水，反复收集数次。存于4℃冰箱保存。经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化。具体方法：每1份腹水中加入3份乙酸钠缓冲液（浓度0.05mol/L,pH4.0），用浓度0.1mmol/L NaOH调整pH至4.5，在4℃下搅拌30min，期间缓慢加入辛酸，按稀释前腹水体积计算40μL/mL；在4℃静止3h，离心（10140r/min,30min），取上清液，保持在4℃环境中，30min内加入（NH4)2SO4使终浓度为0.277g/mL，静止1h，4℃离心（10140r/min，30min），弃上清液，得到单克隆抗体沉淀，并用浓缩样品稀释液稀释至浓度为2μg/mL。
[0031] 3）辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗；
[0032] 由商业公司提供的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗；
[0033] 4）荧光增白剂CBS-X标准品溶液6瓶；
[0034] 浓度分别为：1×105μg/L、1×104μg/L、1×103μg/L、1×102μg/L、1×101μg/L、0
1×10μg/L；
[0035] 5）酶标板；
[0036] 96孔聚苯乙烯酶标板，由商业公司提供；
[0037] 6）底物显色剂；
[0038] 由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为浓度为30%的过氧化氢水溶液，显色剂B为浓度为10mg/mL的四甲基联苯胺DMSO溶液；
[0039] 7）洗涤液；
[0040] 为含有重量比为0.05%-0.5%吐温-20的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；
[0041] 8）终止液；
[0042] 为2mol/L的硫酸溶液；
[0043] 9）封闭液；
[0044] 为含5%脱脂奶粉的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；
[0045] 10）浓缩样品稀释液；
[0046] 为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液（即磷酸根浓度为0.01M/L，pH 7.4的磷酸盐缓冲液）；
[0047] 11）自封袋；
[0048] 由商业公司提供。
[0049] 实施例2
[0050] 间接竞争ELISA方法的建立。
[0051] 采用间接竞争ELISA法检测荧光增白剂CBS-X单克隆抗体的竞争抑制率，方法如下：
[0052] 1）用2μg/mL的荧光增白剂CBS-X特异性抗原包被96孔酶标板，100μL/孔，放置于4℃冰箱包被过夜，用250μL/孔封闭液（即5%脱脂奶粉）封闭后用洗涤液洗涤，并拍干；
[0053] 2）加入荧光增白剂CBS-X标准品溶液（浓度分别为：1×105μg/L、1×104μg/L、3 2 1 0
1×10μg/L、1×10μg/L、1×10μg/L、1×10μg/L）或样品溶液50μL，再加入浓度为
2μg/mL的荧光增白剂CBS-X特异性抗体工作液50μL，混合均匀，37℃温育1h；
[0054] 3）洗涤拍干后，加入用稀释液按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗工作液，100μL/孔，37℃温育1h；
[0055] 4）洗涤拍干，每孔加入50μL显色液B液、10μL显色液A液显色15mi n，加入浓度为2mol/L的硫酸溶液，50μL/孔，终止反应，设定酶标仪于450nm处（优选用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定OD值。
[0056] 以抑制率I%为纵坐标，以荧光增白剂CBS-X浓度的对数1g[荧光增白剂CBS-X(ng/mL)]为横坐标，绘制荧光增白剂CBS-X竞争抑制曲线。将样品的抑制率代入标准曲线回归方程，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中荧光增白剂CBS-X的实际含量。
[0057] 抑制率计算公式如下：
[0058]
[0059] 其中：I——抑制率
[0060] B——（样本溶液的平均吸光度值）
[0061] B0——（0μg/L标准溶液的平均吸光度值）
[0062] BN——（参比空白对照平均吸光度值）
[0063] 实施例3
[0064] 试剂盒灵敏度、特异性、准确度。
[0065] 1.灵敏度测定。
[0066] 利用实施例2的间接竞争ELISA法测定结果建立荧光增白剂CBS-X检测的标准5
工作曲线。荧光增白剂CBS-X单克隆抗体在1μg/L～1×10μg/L范围内有良好的线性，IC 50=905.1ng/mL，最低检测限为0.553ng/mL，检测范围（抑制20%～80%之间）为4.714ng/
2
mL～1520.113μg/mL。纸和塑料制品的检测限为0.277ng/cm，食品样品的检测限为
0.277ng/g，日化产品的检测限为50ng/g。
[0067] 2.特异性测定。
[0068] 采用实施例2的间接竞争ELISA法测定荧光增白剂CBS-X结构类似物（联二苯、2-乙烯基苯磺酸钠盐、2-苯乙烯苯磺酸钠盐、2-联二苯乙烯基苯磺酸钠盐）与单抗7 6 5 4
混合物的交叉反应。将系列浓度（1×10μg/L、1×10μg/L、1×10μg/L、1×10μg/L、
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1×10μg/L、1×10μg/L、1×10μg/L）的上述物质分别与抗体同时加入到已包被封闭好的酶标板中，具体步骤同实施例2，分别计算各类似物的抑制率。利用单克隆抗体对荧光增白剂CBS-X的IC50值与单克隆抗体对各类似物的IC50值的比值得到交叉反应率（CR%），公式如下：
[0069]
[0070] 结果表明荧光增白剂CBS-X单克隆抗体与联二苯、2-乙烯基苯磺酸钠盐、2-苯乙烯苯磺酸钠盐、2-联二苯乙烯基苯磺酸钠盐的交叉反应率均检测不到具体数值，为少于0.05%。
[0071] 3.准确度测定。
[0072] 向空白纸制品、塑料制品和食品样品中添加0.1μg/mL和10μg/mL的荧光增白剂CBS-X，日用产品样品中添加100μg/mL和1000μg/mL的荧光增白剂CBS-X，重复三次，每次做三个平行，采用实施例2的间接竞争ELISA法测定抑制率，然后将抑制率（三个平行的平均值）代入标准曲线回归方程，算出含量，并计算回收率。
[0073] 回收率公式如下：
[0074]
[0075] 结果表明纸制品的回收率为87.5%～103.2%，塑料制品的回收率为90.5%～99.7%，食品的回收率为87.5%～98.2%，日用产品的回收率为86.5%～95.8%。
[0076] 实施例4
[0077] 检测纸样品中的荧光增白剂CBS-X的迁移。
[0078] 1.样品的前处理。
[0079] 将纸制品测得面积后，按每平方厘米2mL的量注入蒸馏水，或采用全部浸泡的方法，其面积以纸制品的二面计算，在室温（>20℃）浸泡2h后，取50μL进行分析。
[0080] 2.间接竞争ELISA法检测样品中荧光增白剂CBS-X的残留。
[0081] 采用实施例2的方法进行检测，根据测定结果，计算出抑制率，代入标准曲线方程求出荧光增白剂CBS-X的含量，见下表1。
[0082] 表1纸制品中荧光增白剂CBS-X的迁移量。
[0083]
[0084] 实施例5
[0085] 检测塑料制品中荧光增白剂CBS-X的迁移。
[0086] 1.样品的前处理。
[0087] 1.1空心制品。
[0088] 按测得的样品体积准确量取蒸馏水加入空心制品中，在室温（>20℃）浸泡2h。大于1.1L的塑料容器也可裁成试片进行测定。可盛放溶剂的塑料薄膜袋应浸泡无文字图案的内壁部分，可将袋口张开置于适当大小的烧杯中，加入适量蒸馏水依法浸泡。复合食品包装袋则按每平方厘米2mL计，注入蒸馏水依上法浸泡。在室温（>20℃）浸泡2h，取50μL进行分析。
[0089] 1.2扁平制品。
[0090] 扁平制品测得其面积后，按每平方厘米2mL的量注入蒸馏水依法浸泡。或可采用全部浸泡的方法，其面积应以二面计算。在室温（>20℃）浸泡2h，取50μL进行分析。
[0091] 1.3板材、薄膜、和试片。
[0092] 同上述扁平制品的前处理方法。
[0093] 1.4橡胶制品。
[0094] 橡胶制品按接触面积每平方厘米加2mL蒸馏水，无法计算接触面积的，按每克样品加20mL蒸馏水。在室温（>20℃）浸泡2h，取50μL进行分析。
[0095] 1.5滴塑垫片。
[0096] 能整片剥落的按每平方厘米2mL加蒸馏水。不能整片剥落的取边缘较厚的部分剪成宽0.3～0.5cm，长1.5～2.5cm的条状，称重。按每克样品加60mL蒸馏水。在室温（>20℃）浸泡2h，取50μL进行分析。
[0097] 2.间接竞争ELISA法检测样品中荧光增白剂CBS-X的残留。
[0098] 采用实施例2的方法进行检测，根据测定结果，计算出抑制率，代入标准曲线方程求出荧光增白剂CBS-X的含量，见下表2。
[0099] 表2塑料制品中荧光增白剂CBS-X的迁移量。
[0100]
[0101] 实施例6
[0102] 检测食品中荧光增白剂CBS-X。
[0103] 1.样品的前处理。
[0104] 用均质器将样品均质，称取10g（精确至0.01g）样品加入适量的超纯水中，超纯水量以完全浸泡样品为准，用超声波萃取15min后，以10000r/min离心10min，用滤纸过滤，将过滤后的样液过经10mL甲醇和10mL去离子水活化的strata-X-AW（3mL，60mg）固相萃取柱，控制流速不大于1mL/min，然后分别用3mL去离子水和3mL甲醇淋洗，最后用6mL 2%氨水甲醇溶液进行洗脱，收集洗脱液在50℃水浴中氮吹至近干后，加入2mL超纯水溶解，取50μL进行分析。
[0105] 2.间接竞争ELISA法检测样品中荧光增白剂CBS-X的残留。
[0106] 采用实施例2的方法进行检测，根据测定结果，计算出抑制率，代入标准曲线方程求出荧光增白剂CBS-X的含量，见下表3。
[0107] 表3食品中荧光增白剂CBS-X的含量。
[0108]
