羟基磷灰石空心微球及其制备方法

摘要

本发明涉及一种羟基磷灰石空心微球及其制备方法，本发明以水溶性钙盐和磷酸盐为原料，以水为溶剂，且以DNA作为模板剂，通过水热反应制备所述羟基磷灰石空心微球。在本发明中，通过改变DNA的加入量，可以有效调节羟基磷灰石空心球的直径以及空腔的大小。

权利要求

1.一种羟基磷灰石空心微球的制备方法，其特征在于，以水溶性钙盐和磷酸盐为原料，以水为溶剂，且以DNA作为模板剂，通过水热反应制备所述羟基磷灰石空心微球，所述水溶性钙盐和磷酸盐的摩尔比为5：3，DNA的质量浓度为0.1～1.5克/升，水溶性钙盐的摩尔浓度为0.005～0.2摩尔/升，控制反应液pH值为4～6，所述水热反应的反应温度为100～

180℃，反应时间为6～30小时。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水溶性钙盐为氯化钙和/或其水合物、硝酸钙和/或其水合物、和/或乙酸钙和/或其水合物。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述的磷酸盐为磷酸钠和/或其水合物、磷酸二氢钠和/或其水合物、磷酸氢二钠和/或其水合物、磷酸钾和/或其水合物、磷酸二氢钾和/或其水合物、磷酸氢二钾和/或其水合物、磷酸铵和/或其水合物、磷酸二氢铵和/或其水合物、和/或磷酸氢二铵和/或其水合物。

说明书

羟基磷灰石空心微球及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种羟基磷灰石空心微球及其制备方法。具体涉及一种采用DNA作为模板剂辅助制备羟基磷灰石空心微球的方法，属于生物材料制备领域。

背景技术

[0002] 羟基磷灰石具有与人的骨骼和牙齿相似的无机成分，所含钙和磷元素是细胞生长所必需的营养元素，其良好的生物活性、生物相容性以及生物可降解性使其常应用于骨骼的替代材料、药物的输运载体以及基因的转染等生物医学领域。

[0003] 羟基磷灰石由于合成方法的不同，具有不同的结晶性、尺寸、形貌以及物理化学性质，因而具有不同的用途。目前，各种不同的方法被应用到制备不同形貌的羟基磷灰石纳米结构。例如用水热方法合成羟基磷灰石纳米颗粒、用无表面活性剂的溶剂热法合成羟基磷灰石纳米线/纳米管有序阵列、以及用超声辅助的均匀沉淀法合成羟基磷灰石纳米棒等等。

[0004] 在众多羟基磷灰石纳米结构之中，羟基磷灰石空心微球由于其特殊的结构，以及大的比表面积和高的药物装载能力，使其成为生物医用材料用于药物装载释放和组织工程等领域的理想材料。现有文献报道有利用微波辅助水热法、溶剂热法、离子辅助钙化等方法合成羟基磷灰石空心球。

[0005] CN100398433C公开一种羟基磷灰石空心微球的制备方法，其先制备羟基磷灰石料浆，加入碳酸氢铵作为添加剂，然后通过喷雾干燥结合热处理得到纳米晶粒组成的羟基磷灰石空心微球。CN100584389C则采用十六烷基三甲基溴化铵（CATB）为模板剂来制备空心球状纳米羟基磷灰石。CN101759169A则通过微波加热水热处理制备磷酸钙/羟基磷灰石纳米结构空心微球。CN102557471A则通过在空心玻璃微球上涂层来制备羟基磷灰石空心微载体。虽然目前羟基磷灰石空心微球的制备研究较为活跃，然而目前还没有一种简单低成本的合适方法来控制羟基磷灰石空心球的直径，以及调控空腔的大小。

发明内容

[0006] 面对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种可有效调节羟基磷灰石空心球的直径以及空腔的大小的新颖的制备方法。本发明人经过锐意的研究认识到利用DNA在高温条件下的水解留下空穴可作为羟基磷灰石空心微球的模板剂，此外，该法还有望改善制得的羟基磷灰石空心微球生物学性能，增强羟基磷灰石的药物装载能力。

[0007] 在此，本发明提供羟基磷灰石空心微球的制备方法，其中，以水溶性钙盐和磷酸盐为原料，以水为溶剂，且以DNA作为模板剂，通过水热反应制备所述羟基磷灰石空心微球。

[0008] 本发明以DNA作为模板剂，一方面利用其在高温条件下水解留下空穴形成空心微球，同时还可利用DNA及其水解产物将有机分子引入到羟基磷灰石中，增强羟基磷灰石的药物装载能力，从而获得一种羟基磷灰石空心微球。而且在本发明中，通过改变DNA的加入量，可以有效调节羟基磷灰石空心球的直径以及空腔的大小。该方法对扩展磷酸钙类生物材料的应用范围具有重要的科学意义和应用价值。此外，本发明采用的原料简单易得、成本较低、操作简便易控、适合规模生产。

[0009] 优选地，在本发明的方法中，所述水溶性钙盐和磷酸盐的摩尔比可为5：3，DNA的质量浓度可为0.1～1.5克/升，水溶性钙盐的摩尔浓度可为0.005～0.2摩尔/升。较佳地，控制反应液pH值为4～6。

[0010] 又，所述水热反应的反应温度可为100～180℃，反应时间可为6～30小时。

[0011] 在本发明中，所述水溶性钙盐可采用氯化钙和/或其水合物、硝酸钙和/或其水合物、和/或乙酸钙和/或其水合物。

[0012] 在本发明中，所述的磷酸盐可采用磷酸钠和/或其水合物、磷酸二氢钠和/或其水合物、磷酸氢二钠和/或其水合物、磷酸钾和/或其水合物、磷酸二氢钾和/或其水合物、磷酸氢二钾和/或其水合物、磷酸铵和/或其水合物、磷酸二氢铵和/或其水合物、和/或磷酸氢二铵和/或其水合物。

[0013] 另一方面，本发明还提供一种上述方法制备的羟基磷灰石空心微球，其中，所述羟基磷灰石空心微球的空间尺寸随着DNA加入量的改变而可调节。优选地，所述羟基磷灰石空心微球的空间尺寸可为0.2～1.8微米。又，所述羟基磷灰石空心微球的直径为1～5微米。

[0014] 本发明提供的羟基磷灰石空心微球形貌和尺寸可控，而且空间尺寸可随着DNA加入量的改变而可调节，尤其适合应用于药物输运、蛋白吸附、基因转染等生物学领域。

[0015] 又，本发明的制备工艺简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。通过本发明所述制备方法制备的羟基磷灰石空心微球作为生物医用材料用于药物输运、蛋白吸附和基因转染等领域将具有良好的应用前景。

附图说明

[0016] 图1为羟基磷灰石空心微球的制备原理示意图；

[0017] 图2为不同水热反应条件下获得样品的X射线衍射（XRD）图；

[0018] 图3为实施例1中样品的透射电镜（TEM）照片；

[0019] 图4为实施例2中样品的透射电镜（TEM）照片；

[0020] 图5为实施例3中样品的透射电镜（TEM）照片；

[0021] 图6为实施例4中样品的扫描电镜（SEM）照片；

[0022] 图7为实施例5中样品的扫描电镜（SEM）照片；

[0023] 图8为实施例6中样品的扫描电镜（SEM）照片；

[0024] 图9为实施例2中样品对疏水性药物布洛芬的装载量计算结果；

[0025] 图10为实施例2中样品装载布洛芬后在磷酸缓冲溶液中的释放结果；

[0026] 图11为实施例2中样品与对比样对牛血红蛋白的吸附曲线；

[0027] 图12为实施例2中样品与对比样对牛血红蛋白的脱附曲线。

具体实施方式

[0028] 以下结合附图及下述具体实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式和/或附图仅用于说明本发明，而非限制本发明。

[0029] 本发明提供了一种生物医用羟基磷灰石空心微球及其DNA辅助制备方法。采用普通的水溶性钙盐和磷酸盐为原料，即、以水溶性钙盐作为钙源、磷酸盐作为磷源，以水为溶剂，通过DNA辅助水热反应制得羟基磷灰石空心微球。其主要原理如附图1所示，即利用DNA生物分子在溶液中形成的表面带有DNA链段的球形粒子1作为模板，通过静电相互作用2+
吸附钙离子2（Ca ）在DNA粒子表面，并在表面与磷酸根离子3形成羟基磷灰石纳米片，在水热条件下DNA分子水解并留下空腔，从而形成羟基磷灰石空心微球4。通过控制反应体系中DNA的加入量，可以有效控制羟基磷灰石空心微球空腔的大小。

[0030] 作为水溶性钙盐可采用常用的水溶性钙盐，例如氯化钙、硝酸钙、乙酸钙等，应理解可采用一种水溶性钙盐，也可采用两种以上的水溶性钙盐；此外还应理解可以采用水溶性钙盐水合物，例如CaCl2·2H2O。

[0031] 所述的磷酸盐可采用常见的磷酸盐，包括但不限于磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵。应理解可采用一种磷酸盐，也可采用两种以上的磷酸盐；此外还应理解可以采用磷酸盐水合物，例如Na2HPO4·12H2O。

[0032] 下面说明本发明方法的步骤：

[0033] （1）液相反应体系的配制：以水溶性钙盐（如CaCl2，C4H6O4Ca·H2O，Ca(NO3)2）和磷酸盐（如NaH2PO4，Na2HPO4，KH2PO4，K2HPO4）为原料，以水为溶剂，加入一定量的DNA。其中，水溶性钙盐和磷酸盐的摩尔比为5:3，DNA的质量浓度为0.1-1.5克/升，控制水溶性钙盐浓度为0.005摩尔/升-0.2摩尔/升，调节pH值为4～6，室温下混合均匀。这里，优选将水溶性钙盐和磷酸盐分别溶于水中，先将DNA加至水溶性钙盐的水溶液并调节pH至4～6，然后将形成的磷酸盐水溶液加（例如滴加）至水溶性钙盐的水溶液。更优选地，在整个添加过程中，混合溶液的pH为4～6。然而应理解，可以采用其它常用混合方式，例如并不将水溶性钙盐和磷酸盐分别制成溶液再混合，而是将水溶性钙盐和磷酸盐先后或同时加入水，优选去离子水中，搅拌形成溶液。可以采用例如盐酸水溶液调节pH，例如用1mol/L盐酸调节pH至5。

[0034] （2）将步骤1中制备得到的溶液转移至密闭的反应釜中，在100-180℃进行水热反应，反应时间为6-30小时。

[0035] （3）对步骤2制备的产物进行分离。分离的方法包括离心分离、过滤或静置沉淀分离，对分离出的产物进行洗涤和干燥处理，得到羟基磷灰石空心微球粉体。

[0036] 本发明制备的产物物相为羟基磷灰石相，空心微球的表面由纳米片层结构组成，球的直径为1-5微米，空腔的尺寸可由加入的DNA量进行调控。

[0037] 本发明具有如下优点：

[0038] （1）制备的羟基磷灰石空心微球由纳米片层结构组成，具有多孔结构，壁上孔道可与内部空腔相连通；

[0039] （2）制备的羟基磷灰石空心微球的大小可以通过改变离子浓度、反应温度、反应时间等来调节；

[0040] （3）制备的羟基磷灰石空心微球的空腔大小可以通过更改反应体系中DNA的加入量进行调节；

[0041] （4）制备的羟基磷灰石空心微球具有高的比表面积，可以高效的装载药物并体现出优越的药物释放特性。

[0042] 本发明使用的原料来源广泛、价格低廉、无污染，且具有优越的生物相容性，使用的制备方法简单、方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。本发明所述制备方法制备的羟基磷灰石空心微球在包括药物递送、蛋白质吸附的生物、环境、化学领域将具有良好的应用前景。

[0043] 下面进一步举例实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。例如，下述实施例以Ca(CH3COO)2·H2O和Na2HPO4·12H2O作为起始原料，但如上述，也可采用其他合适的水溶性钙盐和磷酸盐替代。下述示例具体的反应温度、时间投料量等也仅是合适范围中的一个示例，即、本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

[0044] 实施例1

[0045] 在室温下，将1.791克Na2HPO4·12H2O溶于250毫升去离子水中形成溶液A，将1.762克Ca(CH3COO)2·H2O溶于100毫升去离子水中形成溶液B。取0.020克鱼精DNA加入到60毫升溶液A中，室温搅拌使其完全溶解，用1摩尔/升的盐酸调节pH为5后，逐滴加入20毫升的溶液B，此过程中用1摩尔/升的盐酸调节pH值使其保持在pH等于5左右。
滴加完成后，将混合的澄清液体转入聚四氟乙烯内衬中（内衬容量为100毫升）并密封。将内衬放入水热反应外套内并连同外套一起放入保温炉，在150℃下保温12小时。反应体系自然冷却到室温后，取出产物，用离心法分离产物，分离的产物用去离子水洗涤3次，用无水乙醇洗涤1次，60℃空气中干燥，得到如附图3所示的空腔较小的羟基磷灰石空心微球，该羟基磷灰石空心微球的平均直径为3微米，空腔尺寸为0.3微米。

[0046] 实施例2

[0047] 在室温下，将1.791克Na2HPO4·12H2O溶于250毫升去离子水中形成溶液A，将1.762克Ca(CH3COO)2·H2O溶于100毫升去离子水中形成溶液B。取0.060克鱼精DNA加入到60毫升溶液A中，室温搅拌使其完全溶解，用1摩尔/升的盐酸调节pH为5后，逐滴加入20毫升的溶液B，此过程中用1摩尔/升的盐酸调节pH值使其保持在pH等于5左右。
滴加完成后，将混合的澄清液体转入聚四氟乙烯内衬中（内衬容量为100毫升）并密封。将内衬放入水热反应外套内并连同外套一起放入保温炉，在150℃下保温12小时。反应体系自然冷却到室温后，取出产物，用离心法分离产物，分离的产物用去离子水洗涤3次，用无水乙醇洗涤1次，60℃空气中干燥，得到如附图4所示的羟基磷灰石空心微球，该羟基磷灰石空心微球的平均直径为5微米，空腔尺寸为0.7微米。制得的产品的X射线衍射（XRD）图参见图2。

[0048] 利用该实施例所得到的羟基磷灰石空心微球进行疏水性药物布洛芬的装载以及在磷酸缓冲溶液（PBS）中的释放实验，其药物装载能力如附图9所示的结果可达到200mg -1g 。如附图10所示，该药物输运体系在PBS溶液中具有缓慢的药物释放特性，其累计药物释放量与时间的平方根具有很好的线性关系。

[0049] 利用该施例所得到的羟基磷灰石空心微球进行牛血红蛋白的吸附与释放试验，如-1附图11所示，该羟基磷灰石空心微球对牛血红蛋白的吸附量可高达120mg g ,其值明显高-1
于纯羟基磷灰石对比样的43mg g 。附图12说明该羟基磷灰石空心微球-牛血红蛋白吸附体系在50小时内具有缓慢持续的释放特性，其累计蛋白释放量与时间的自然对数具有很好的线性关系。

[0050] 实施例3

[0051] 在室温下，将1.791克Na2HPO4·12H2O溶于250毫升去离子水中形成溶液A，将1.762克Ca(CH3COO)2·H2O溶于100毫升去离子水中形成溶液B。取0.100克鱼精DNA加入到60毫升溶液A中，室温搅拌使其完全溶解，用1摩尔/升的盐酸调节pH为5后，逐滴加入20毫升的溶液B，此过程中用1摩尔/升的盐酸调节pH值使其保持在pH等于5左右。
滴加完成后，将混合的澄清液体转入聚四氟乙烯内衬中（内衬容量为100毫升）并密封。将内衬放入水热反应外套内并连同外套一起放入保温炉，在150℃下保温12小时。反应体系自然冷却到室温后，取出产物，用离心法分离产物，分离的产物用去离子水洗涤3次，用无水乙醇洗涤1次，60℃空气中干燥，得到如附图5所示的羟基磷灰石空心微球，该羟基磷灰石空心微球的平均直径为3微米，空腔尺寸为1微米。

[0052] 实施例4

[0053] 在室温下，将1.791克Na2HPO4·12H2O溶于250毫升去离子水中形成溶液A，将1.762克Ca(CH3COO)2·H2O溶于100毫升去离子水中形成溶液B。取0.060克鱼精DNA加入到60毫升溶液A中，室温搅拌使其完全溶解，用1摩尔/升的盐酸调节pH为5后，逐滴加入20毫升的溶液B，此过程中用1摩尔/升的盐酸调节pH值使其保持在pH等于5左右。
滴加完成后，将混合的澄清液体转入聚四氟乙烯内衬中（内衬容量为100毫升）并密封。将内衬放入水热反应外套内并连同外套一起放入保温炉，在120℃下保温12小时。反应体系自然冷却到室温后，取出产物，用离心法分离产物，分离的产物用去离子水洗涤3次，用无水乙醇洗涤1次，60℃空气中干燥，得到如附图6所示的羟基磷灰石空心微球，该羟基磷灰石空心微球的平均直径为4微米。制得的产品的X射线衍射（XRD）图参见图2。

[0054] 实施例5

[0055] 在室温下，将1.791克Na2HPO4·12H2O溶于250毫升去离子水中形成溶液A，将1.762克Ca(CH3COO)2·H2O溶于100毫升去离子水中形成溶液B。取0.060克鱼精DNA加入到60毫升溶液A中，室温搅拌使其完全溶解，用1摩尔/升的盐酸调节pH为5后，逐滴加入20毫升的溶液B，此过程中用1摩尔/升的盐酸调节pH值使其保持在pH等于5左右。
滴加完成后，将混合的澄清液体转入聚四氟乙烯内衬中（内衬容量为100毫升）并密封。将内衬放入水热反应外套内并连同外套一起放入保温炉，在180℃下保温12小时。反应体系自然冷却到室温后，取出产物，用离心法分离产物，分离的产物用去离子水洗涤3次，用无水乙醇洗涤1次，60℃空气中干燥，得到如附图7所示的羟基磷灰石空心微球，该羟基磷灰石空心微球的平均直径为3微米。制得的产品的X射线衍射（XRD）图参见图2。

[0056] 实施例6

[0057] 在室温下，将1.791克Na2HPO4·12H2O溶于250毫升去离子水中形成溶液A，将1.762克Ca(CH3COO)2·H2O溶于100毫升去离子水中形成溶液B。取0.060克鱼精DNA加入到60毫升溶液A中，室温搅拌使其完全溶解，用1摩尔/升的盐酸调节pH为5后，逐滴加入20毫升的溶液B，此过程中用1摩尔/升的盐酸调节pH值使其保持在pH等于5左右。
滴加完成后，将混合的澄清液体转入聚四氟乙烯内衬中（内衬容量为100毫升）并密封。将内衬放入水热反应外套内并连同外套一起放入保温炉，在150℃下保温30小时。反应体系自然冷却到室温后，取出产物，用离心法分离产物，分离的产物用去离子水洗涤3次，用无水乙醇洗涤1次，60℃空气中干燥，得到如附图8所示的羟基磷灰石空心微球，该羟基磷灰石空心微球的平均直径为2微米。制得的产品的X射线衍射（XRD）图参见图2。

[0058] 产业应用性：本发明的制备工艺简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。通过本发明所述制备方法制备的羟基磷灰石空心微球作为生物医用材料用于药物输运、蛋白吸附和基因转染等领域将具有良好的应用前景。