高产杆状病毒的转基因卵巢细胞系及其制备方法和应用

摘要

本发明提供一种高产杆状病毒的转基因昆虫细胞系及其制备方法和应用，所述转基因昆虫细胞系的名称为IOZCAS-Spex IX，该细胞系的保藏号为CGMCC No.4506；所述转基因昆虫细胞系的制备方法，包括以下步骤：培养甜菜夜蛾卵巢细胞；将含人端粒酶逆转录酶基因转化入已知表达载体中，获得重组表达载体；将所述重组表达载体引入所述的甜菜夜蛾卵巢细胞中；和使所述甜菜夜蛾卵巢细胞能够表达人端粒酶逆转录酶，获得转基因昆虫细胞系；所述转基因昆虫细胞系的应用为其在杆状病毒生产中的应用。

权利要求

1.一种高产杆状病毒的转基因卵巢细胞系，该细胞系的名称为IOZCAS-Spex IX的转基因昆虫细胞系，其保藏号为CGMCC No.4506。

2.根据权利要求1所述的转基因卵巢细胞系的应用，所述转基因卵巢细胞系在杆状病毒生产中的应用，所述杆状病毒为甜菜夜蛾核型多角体病毒或苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒。

说明书

高产杆状病毒的转基因卵巢细胞系及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种转基因昆虫细胞系及其制备方法和应用，尤其涉及一种高产杆状病毒的转基因卵巢细胞系及其制备方法和应用，属于转基因动物技术领域。 背景技术

[0002] 昆虫细胞系的主要用途表现在：作为研究材料，一直是生理学、发育生物学、细胞生物学、分子生物学和生物化学等科学研究的重要工具；作为杆状病毒表达载体系统的重要组成部分，可表达具有重大经济价值和科学意义的外源蛋白质；作为生物反应器，扩增昆虫杆状病毒，特别是含有外源基因的重组杆状病毒，生产生物杀虫剂。昆虫细胞系具有重要的经济和应用价值，但它的建立往往需要消耗大量的时间和精力。据报道，在1965年第一株昆虫细胞系成功建立后至今，近40年的时间内，已经建立的昆虫细胞系超过500种。它们分别来源于鳞翅目、双翅目、同翅目、膜翅目、直翅目和鞘翅目等170多种昆虫，其中大部分来源于鳞翅目和双翅目昆虫。鳞翅目(Lepidoptera)是昆虫纲第二大的目，全世界已知种达十万种以上，与农业有关的有两个亚目。鳞翅目昆虫具有重大经济意义，除极少数取食显花植物外，许多是农林重要害虫。建立鳞翅目昆虫细胞系为科学研究与生物防治提供了宝贵的生物学材料。鳞翅目的细胞系来源于多种组织，包括卵巢、胚胎、血细胞、脂肪体等。 [0003] 到目前为止，来自甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的细胞系共有6株。Gelernter和 Federici(Gelernter，W.D.and B.A.Federici J.Invertebr.Pathol.1986，48：199 ～207)从剪碎的甜菜夜蛾初孵幼虫组织中，建立了甜菜夜蛾第一个细胞系UCR-SE-1。经克隆形成法，他们又从UCR-SE-1细胞系中分离了SE-UCR-1A细胞系。在SE-UCR-1A细胞系的基础上，Mccarthy和Mckedy(Mccarthy W J，Mckedy D.Dev.Biol.，1990，26(8)：824～
828)筛选获得一个缺失了核苷激酶的细胞系。Hara等(Hara，K.，K.Tsuda，M. Funakoshi and T.Kawarabata In Vitro Cell.Dev.Biol.1993，29A(12)：904～907)也从甜菜夜蛾初孵幼虫组织中建立了第二株细胞系Se3FH。Se3FH对SeNPV敏感，生长速度比UCR-SE-1快。经克隆分离的Se301细胞系100％能被SeNPV感染，生长速度比Se3FH快，产生的空斑比Se3FH大。第三株Le-H-HNU7细胞系是通过甜菜夜蛾血细胞建立的，该细胞系对斜纹夜蛾核多角体病毒敏感。第四株SeHe920-1a细胞系也是来源于甜菜夜蛾血细胞，接入微孢子虫(Vairimorpha sp.)的孢子后，比其它来源于鳞翅目昆虫非血细胞的细胞系具有更高的感染细胞能力。其12个克隆株SeHe920Y1至SeHe920Y12中SeHe920Y7感染微孢子虫的能力最强。另外两株是由本实验室建立的来源于甜菜夜蛾幼虫脂肪体的细胞系，这两株细胞系对甜菜夜蛾核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒均非常敏感。 [0004] 尽管前述文献已有甜菜夜蛾细胞系的有关报道，然而到目前为止，还没有来源于甜菜夜蛾卵巢的细胞系。昆虫的卵巢通常是成对的，是卵子发生和发育的场所。卵巢是由卵巢管(ovariole)组成，在各类昆虫中卵巢管的数目差异很大，鳞翅目昆虫一般为4、6或8条。自Grace利用卵巢组织建立了第一个昆虫细胞系以来，卵巢一直是细胞系建立的重要组织来源。解剖将要羽化的蛹获得的卵巢组织更易于操作，减少污染机会。更多种类的昆虫细胞系仍存在很大的需求，建立新的来源于昆虫卵巢的细胞系，构建更加高效的杆状病毒表达载体系统是十分有意义的。

[0005] 与哺乳动物细胞成熟的培养技术相比，昆虫细胞培养技术亟待建立与完善。昆虫是世界上种类最多的生物群体，有着丰富的细胞遗传学系统。细胞在体外培养过程中，由于受到各种环境因子的影响，有时会发生自发转化，即永生化。永生化的细胞在生长过程中失去接触抑制，可无限繁殖传代，这样的转化不仅所需时间长，而且转化率极低。建立一株细胞系往往需要培养大量原代细胞，费时费力，经常守株待兔式地等待细胞自发转化，条件难以控制，常常因污染而前功尽弃。体外培养细胞成功传代后，当培养到一定代数时，通常会进入生长抑制状态，生命力明显减弱，增殖能力下降，生长停滞并最终死亡。人工诱导体外培养细胞转化是获得细胞永生化的重要手段。在人工设计的诱变因素下使细胞发生转化，通常只需1-3个月就可实现，而且转化率较高，传代细胞生长周期长、性状稳定。 [0006] 目前发现，细胞永生化与端粒和端粒酶关系密切。端粒与端粒酶是真 核细胞染色体末端的一种特殊结构，由端粒DNA和端粒蛋白质组成。端粒DNA是富含G的高度保守的重复核苷酸序列，参与DNA复制，并对维持染色体的稳定和完全复制有重要作用。体外培养的细胞每分裂一次，端粒缩短50-200bp，当缩短至一临界值时，细胞就会停止分裂，走向衰老和死亡。人类细胞端粒是由10-15kb的重复序列(TTAGGG)n组成；在植物中端粒以(TTTAGGG)n重复序列出现；昆虫细胞端粒一般是由6-8kb的重复序列(TTAGG)n组成。目前已知，在昆虫中存在三种端粒DNA类型：家蚕(Bombyx mori)的端粒DNA由重复序列(TTAGG)n构成(Okazaki et al.1993)；果蝇(Drosophila melanogaster)端粒DNA由转座因子HeT-A和TART组成(Biessmann et al.1990，Levis et al.1993)；摇蚊中的端粒DNA由复杂的基因串联重复序列组成(Nielsen & 1993，Zhang et al.1994)。端粒酶是一种核糖核蛋白酶，由RNA和蛋白质组成，具有逆转录酶的功能，以自身的RNA为模板合成端粒DNA，以维持端粒的长度。在原代培养的细胞中稳定表达人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)能稳定端粒的长度，使细胞易于永生化(Cemi C.Telomeres，telomerase，and myc.An update[J].Mutat Res.2000，462(1)：31-47.)。

[0007] 虽然有关将端粒酶基因应用于哺乳动物细胞永生化的报道很多，但未见涉及利用转染人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)获得昆虫永生化细胞系的报道。通过人工诱导体外转化方法建立来源于昆虫蛹卵巢并表达人端粒酶逆转录酶基因的细胞系，为获得永生化昆虫细胞系提供了重要途径。

发明内容

[0008] 因此，本发明的目的是针对目前尚无含有人端粒酶昆虫细胞系的不足，提供一种高产杆状病毒的转基因卵巢细胞系，其含有人端粒酶逆转录酶基因，为获得永生化昆虫细胞系提供了重要途径。

[0009] 本发明的另一目的是提供一种高产杆状病毒的转基因卵巢细胞系的制备方法。 [0010] 本发明的再一目的是提供一种高产杆状病毒的转基因卵巢细胞系的应用。 [0011] 针对上述目的，本发明的技术方案如下：

[0012] 本发明一方面提供了一种高产杆状病毒的转基因卵巢细胞系，该细胞系的名称为IOZCAS-Spex IX的转基因昆虫细胞系，其保藏号为CGMCC No.4506。

[0013] 优选地，所述转基因卵巢细胞系含有人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)。 [0014] 优选地，所述人端粒酶逆转录酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。 [0015] 本发明的又一方面提供了一种高产杆状病毒的转基因卵巢细胞系的制备方法，包括以下步骤：

[0016] 步骤1：培养甜菜夜蛾卵巢细胞；

[0017] 步骤2：将含人端粒酶逆转录酶基因转化入已知表达载体中，获得重组表达载体； [0018] 步骤3：将所述重组表达载体导入所述的甜菜夜蛾卵巢细胞中；和 [0019] 步骤4：使所述甜菜夜蛾卵巢细胞能够表达人端粒酶逆转录酶，获得转基因昆虫细胞系。

[0020] 优选地，在步骤1)中，所述培养甜菜夜蛾卵巢细胞，包括以下步骤： [0021] 步骤1.1：将甜菜夜蛾雌性蛹浸没在3％次氯酸溶液中5分钟，75％乙醇溶液中10-20分钟，进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水清洗昆虫，再吸干蛹表面水分； [0022] 步骤1.2：解剖昆虫，取出甜菜夜蛾卵巢组织；

[0023] 步骤1.3：用生理盐水清洗步骤2中获得的组织2-3次，再用细胞培养液I清洗，清洗后把该组织放入含有1mL细胞培养液I润洗过的细胞培养瓶中，盖紧瓶盖，放入27℃无光照的细胞培养箱中培养24小时；

[0024] 步骤1.4：加入适量的细胞培养液I，使组织完全或大部分浸没在该培养液中，在与步骤1.3同样条件下培养；

[0025] 步骤1.5：每7-10天吸出半量的培养液，并同时换入半量新的细胞培养液II，直至观察到不断扩展并开始增殖的细胞充满了整个培养瓶。

[0026] 优选地，在步骤2中，所述已知的表达载体为pIZT-V5-His或pIB-V5-His。 [0027] 优选地，在步骤3)中，所述重组表达载体通过脂质体导入所述的甜菜夜蛾卵巢细胞中。

[0028] 优选地，在步骤4)中，具体通过以下步骤获得转基因卵巢细胞系： [0029] 步骤4.1：放入与步骤1.3同样条件下培养至少4小时，并不时晃动。转染后换适量细胞培养液II继续在与步骤1.3同样条件下培养；

[0030] 步骤4.2：72小时后荧光倒置显微镜观察转染效果，换含有真核细胞 筛选抗生素的细胞培养液III或者细胞培养液IV筛选，成功表达hTERT的细胞继续与步骤1.3同样条件下培养；

[0031] 步骤4.3：在将该细胞与步骤1.5相同培养细胞，直至获得转基因昆虫细胞系。 [0032] 上述整个过程都是在无菌条件下进行的；其中所述的四种细胞培养液分别是细胞培养液I是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素、苯基硫脲和胎牛血清的混合物；细胞培养液II是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素和胎牛血清的混合物，细胞培养液III是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素、博莱霉素(zeocin)和胎牛血清的混合物，细胞培养液IV是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素、杀稻瘟菌素(blasticidin)和胎牛血清的混合物，配成的细胞培养液pH为6.0-6.8。

[0033] 昆虫细胞培养液可以是各种商品化的昆虫细胞培养液，如TNM-FH，Grace’s，Sf900，TC-100，IPL-41，Ex-Cell 400等等。

[0034] 通常，细胞培养液中青霉素含量为100U/mL、链霉素含量为100U/mL；筛选转基因细胞的培养液为上述培养液含博莱霉素(zeocin)400μg/mL；转基因细胞系培养液为上述培养液含博莱霉素(zeocin)50μg/mL；动物血清含量为细胞培养液的10％(体积比)。 [0035] 本发明的再一方面提供一种高产杆状病毒的转基因卵巢细胞系的应用，所述转基因卵巢胞系在杆状病毒生产中的应用。

[0036] 优选地，所述杆状病毒为甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeNPV)或苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)。

[0037] 本发明中表达了人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的甜菜夜蛾蛹卵巢细胞系的生物学特征观察和测定：

[0038] 1.经实验观察，该细胞系大部分为贴壁细胞，也有部分悬浮于培养液中。细胞的形状有3种类型：大部分细胞圆形、少部分梭形，较少似巨噬细胞形，易聚集形成细胞团；荧光信号转染初期较强，转染效率高。

[0039] 2.IOZCAS-Spex IX对甜菜夜蛾核型多角体病毒及苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒敏感，可以观察到典型的细胞病理特征，即细胞核增大，内含大量的多角体颗粒，感染率分别为92.41％和83.15％；并且至少可以连续传代3代。

[0040] 3. 按 照 McIntosh and Ignoffo，1989(McIntosh，A.H.and C.M.IgnoffoJ.Invertebr.Pathol.1989，54：97～102)的方法，测定第10代细胞生长曲线 和群体倍增时间。以2.5×105细胞/mL的浓度接种到24孔培养板中，27℃培养，每48h测定细胞浓度，绘制生长曲线，并按公式T＝tlg2/[lg(N/N0)]计算，第10代的细胞群体倍增时间为70.09小时。

[0041] 其中T＝在对数期平均增长一倍所需的时间

[0042] t＝接种到测定细胞数的时间

[0043] N0＝接种时的细胞数

[0044] N＝时刻t所测定的细胞总数

[0045] 4.按照Takahashi et al.(Takahashi，Mitsuhashi and Ohtaki(1980)Develop.Growth and Differ.22：11-19)的方法，测定了第12代细胞的核型。由于甜菜夜蛾的染色体数目n＝31(Hara，Tsuda，Funakoshi and Kawarabata In Vitro Cell.Dev.Biol.1993，29A(12)：904～907)，而IOZCAS-Spex IX的染色体数目在116-131之间，因此，新建立的细胞系IOZCAS-Spex IX由4倍体细胞组成。

[0046] 5.使用DAF-PCR的方法(McIntosh，Grasela and Matteri(1996)，InsectMol.Biol.5：187～195)鉴定了细胞系IOZCAS-SpexIX确是来源于甜菜夜蛾，而非其它细胞系的污染。由IOZCAS-SpexIX提取的DNA与甜菜夜蛾蛹DNA、来源于甜菜夜蛾幼虫脂肪体的IOZCAS-SpexII-A的DNA扩增后主要的带型相同；而与对照，来源于草地贪夜蛾的Sf9、棉铃虫脂肪体的IOZCAS-Ha-I、美洲棉铃虫蛹卵巢的BCIRL-Hz-AM1的细胞带型明显不同。 [0047] 6.使用传统细胞冻存的方法对一定代次的部分细胞进行冻存处理，保存细胞的种资，并成功复苏。

附图说明

[0048] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

[0049] 图1为本发明所述的IOZCAS-Spex IX的培养形态图，图中标尺所示为400μm； [0050] 图2为本发明所述的IOZCAS-Spex IX的转染荧光(绿色荧光GFP标记)图，图中标尺所示为400μm；

[0051] 图3为本发明所述的IOZCAS-Spex IX感染甜菜夜蛾后获得大量的病毒多角体试验结果图，图中标尺所示为200μm；

[0052] 图4为本发明所述的IOZCAS-Spex IX感染苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒后获得大量的病毒多角体试验结果图，图中标尺所示为200μm；

[0053] 图5为本发明所述的IOZCAS-Spex IX的生长曲线；

[0054] 图6为本发明所述的IOZCAS-Spex IX的核型；

[0055] 图7为DAF-PCR鉴定IOZCAS-Spex IX的DNA指纹扩增琼脂糖电泳图，图中1为IOZCAS-Spex IX，2为甜菜夜蛾蛹(Spodoptera exigua pupa)，3为脂肪体的IOZCAS-Spex II-A，4为棉铃虫脂肪体的IOZCAS-Ha-I，5为美洲棉铃虫蛹卵巢的BCIRL-Hz-AM1，6为草地贪夜蛾的Sf9，7为DNA标记(DNAMarker)；

[0056] 图8为表达载体质粒pIZT-V5-His，具有多克隆位点、杆状病毒早起启动子、V5表位和抗Zeocin基因；

[0057] 图9为表达载体质粒pIB-V5-His，具有多克隆位点、杆状病毒早起启动子、V5表位和抗Blasticidin基因；

[0058] 图10为转基因昆虫细胞系PCR扩增的琼脂糖电泳结果示意图，图中1为IOZCAS-Spex IX细胞系，2为甜菜夜蛾卵巢(spodoptera exigua ovary)，3为DNA标记(DNA Marker)。

具体实施方式

[0059] 以下实施例中所使用的技术，包括基因扩增，基因克隆，细胞转染，以及细胞培养、检测技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂、细胞等，除非是说明书中特别说明，均为本领域技术人员可以通过公共途径获得的。 [0060] 实施例1.转基因甜菜夜蛾蛹卵巢细胞系的建立

[0061] 取末龄的甜菜夜蛾5天雌性蛹浸没在3％次氯酸溶液中5分钟，75％乙醇溶液中10-20分钟，进行表面消毒。解剖该蛹取出卵巢组织，操作时尽量保持其完整。用生理盐水清洗该组织2-3次，再用细胞培养液I(以TNM-FH为主，含100U/mL的青霉素，100U/mL的链霉素和10％(v/v)的胎牛血清，pH＝6.2)清洗1-2次，放入使用1mL培养液润洗过的
2
25cm 的细胞培养瓶中，放入摄氏27℃无光照的细胞培养箱中培养24小时。然后加入3mL细胞培养液I，放入同样条件下培养。注意该方法成功建立细胞系的关键是要使组织紧贴在细胞培养瓶底，勿使组织悬浮在细胞培养液中。以后每7-10天左右吸出半量的培养液，并同时换入半量的新细胞培养液II。在此操作第3天后可以观察到组织周围游离出大量单个的细胞，并逐渐向外围扩展。当甜菜夜蛾卵巢的原代细胞增殖至10天时，根据invitrogen公司Cellfectin II Reagent (Cat.no.10362-100，10362-125)方法将本实验室构建的人端粒酶逆转录酶重组质粒转染到原代细胞中，27℃无光照的细胞培养箱中培养。转染后第三天可通过荧光倒置显微镜观察转染效果。转染初期，部分细胞漂浮死亡，每7天半量换细胞培养液II，观察细胞增殖情况。当细胞有聚团增殖趋势时，加入400μg/mL博莱霉素(zeocin)筛选，成功转染了重组质粒基因的细胞贴壁生长正常，未转染的细胞则漂浮死亡。11天后当细胞增殖至将要铺满整个培养瓶时，细胞连同全部的培养液吸出放入新培养瓶中，并加入2mL新的细胞培养液III或IV(含50μg/mL博莱霉素(zeocin))。细胞系建立初步成功。在细胞开始传代的第17天后开始第二次分瓶传代，以后传代时间逐渐缩短，传到第5代时，传代时间缩短至10天，细胞生长开始稳定，传至第12代时，传代时间已缩短至4-5天。最终该细胞系被命名为IOZCAS-Spex IX。IOZCAS-Spex IX已于2010年12月
28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.4506，分类命名：甜菜夜蛾蛹卵巢转基因细胞株。

[0062] 实施例2.人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因重组质粒pIZT-hTERT和pIB-hTERT的构建

[0063] 利用载体质粒pIZT-V5-His构建重组质粒pIZT-hTERT。如图8所示，载体质粒pIZT-V5-His具有多克隆位点、杆状病毒早起启动子、V5表位和抗Zeocin基因。将载体质粒pIZT-V5-His进行EcoR I和EcoR V限制性酶切，将hTERT基因(其序列如SEQ ID NO 1所示)(来自质粒pBABE-puro-hTERT)进行Sal I限制性酶切，dNTP补平、EcoR I酶切后，克隆到载体质粒中获得hTERT重组质粒pIZT-hTERT。

[0064] 利用载体质粒pIB-V5-His构建重组质粒pIB-hTERT。如图9所示，载体质粒pIB-V5-His具有多克隆位点、杆状病毒早起启动子、V5表位和抗Blasticidin基因。将载体质粒pIB-V5-His进行EcoR I和EcoR V限制性酶切，将hTERT基因(来自质粒pBABE-puro-hTERT)进行Sal I限制性酶切，dNTP补平、EcoR I酶切后，克隆到载体质粒中获得hTERT重组质粒pIB-hTERT。

[0065] 实施例3.IOZCAS-Spex IX的生物学特性观察和测定

[0066] (1)形态特征：经显微镜观察，该细胞系细胞易于形成细胞团且可忍受高密度生长环境，突破了接触抑制。如图1-2所示，细胞的形状有3种类型：圆形、梭形和椭圆形。大部分细胞贴壁。

[0067] (2)细胞的生长：27℃下，细胞系第10代在含10％胎牛血清、100U/mL的青霉素、100U/mL的链霉素、50μg/mL博莱霉素的TNM-FH培养液中，群体倍增时间为70.09h。如图
6
5所示，细胞最高密度约可达2.7×10 个细胞/mL。

[0068] (3)核型分析：如图6所示，IOZCAS-Spex IX第12代细胞是4倍体细胞，染色体数目范围116-131(2n＝62)。

[0069] (4)DAF-PCR鉴定：如图7所示，细胞系IOZCAS-Spex IX确是来源于甜菜夜蛾，而非其它细胞系的污染。由IOZCAS-Spex IX提取的DNA同于甜菜夜蛾蛹和脂肪体的DNA指纹扩增图谱，而不同于草地贪夜蛾的Sf9、棉铃虫脂肪体的IOZCAS-Ha-I、美洲棉铃虫蛹卵巢的BCIRL-Hz-AM1的图谱。

[0070] (5)冻存和复苏：使用传统细胞冻存的方法对一定代次的部分细胞进行冻存处理，保存细胞的种资，并可以成功复苏。

[0071] 实施例4.病毒敏感性

[0072] IOZCAS-Spex IX对甜菜夜蛾核型多角体病毒敏感：将SeNPV及AcMNPV出芽型病毒粒子BV以0.001幼虫当量/毫升的浓度接种IOZCAS-SpexIX，培养7天后，如图3-4所示，通过倒置显微镜可以观察到典型的细胞病理特征，即细胞核增大，内含大量的多角体颗粒。并且至少可以连续传代3代。病毒感染率分别为92.41％和83.15％。

[0073] 实施例5.转hTERT基因细胞中hTERT基因的测定

[0074] 利用PCR技术，测定转hTERT基因的细胞系IOZCAS-Spex IX中hTERT基因的存在。

[0075] 引物：

[0076] hTERT上游引物：AGC TGC GGC CCT CCT TCC TAC TCA

[0077] hTERT下游引物：GAC GCT CGG CCC TCT TTT CTC TGC

[0078] 反应条件：

[0079] 95℃，2min；

[0080] 95℃/30S，57℃/30S，72℃/60S；30个循环

[0081] 72℃，5min。

[0082] 如图10所示，PCR检测结果证明，转基因的细胞株内存在hTERT基因。