一种甲型肝炎病毒的提纯方法

摘要

本发明提供了一种甲型肝炎病毒的提纯方法，以甲型肝炎病毒细胞培养液为原料，经超声破碎、离心除细胞碎片、氯仿抽提、超滤浓缩、疏水层析、检测与收集等工艺流程后完成对甲型肝炎病毒的提纯工艺。以它为原料制备的甲型肝炎灭活疫苗的纯度和效价高，工艺简单易放大，使用安全可靠。

权利要求

1.一种甲型肝炎病毒的提纯方法，包括以下步骤：

1）甲型肝炎病毒细胞培养液超声破碎，离心去除细胞碎片，收集上清液，所述离心条件为3500r/min，离心10min；其中，所述超声破碎是将抗原滴度达到1：512的甲型肝炎病毒细胞培养液在冰浴条件下超声破碎，使用的超声破碎仪功率额定功率为1500w，输出功率为

1200w，破碎次数为4次，使细胞破碎率达99％以上，所述甲型肝炎病毒为甲肝病毒SH毒株，保藏号为CGMCC No.4501；

2）氯仿抽提上清液，得到粗制病毒液；所述氯仿抽提是将氯仿按体积比为1:3加入上清液振摇，然后3500r/min离心后吸取上层水相，如此重复抽提5次；将蛋白相和氯仿再用抽提缓冲液抽提并吸取上层水相，合并上层水相得到粗制病毒液；所述的抽提缓冲液为

6.2mM PBS；

3）将粗制病毒液超滤浓缩，缓冲盐溶液洗脱超滤膜，超滤浓缩的倍数为10倍，超滤膜的截留分子量为50KD；缓冲盐溶液为2mol/L的PBS溶液，pH7.2；

4）疏水层析纯化浓缩病毒液；所述层析为：每次上样量为1000ml，上样缓冲液为2mol/L PBS，pH7.2，洗脱缓冲液为0.5mol/L PBS，pH7.2，流速为15ml/min；

5）用280nm波长对平衡好的购自GE公司的XK50/30柱上洗脱的病毒液进行检测，观测电导，根据电导观测结果，从电导30开始收集病毒液，一直收集到电导降到2.4，合并收集的病毒液即完成提纯工艺过程；

将收集到的甲型肝炎病毒液按其总体积的1/4000加入甲醛，再放37℃恒温室内，旋转12天即完成灭活过程；纯化甲肝病毒液灭活后甲肝病毒抗原效价为6400EU/ml，用2mM PBS、pH7.2、稀释10倍至甲肝病毒抗原效价640EU/ml，经无菌、效力、异常毒性、细菌内毒素检查后即为甲型肝炎病毒疫苗制品。

2.一种甲型肝炎病毒的提纯方法，包括以下步骤：

1）甲型肝炎病毒细胞培养液超声破碎，离心去除细胞碎片，收集上清液，所述离心条件为4000r/min，离心8min；其中，所述超声破碎是将抗原滴度达到1：256的甲型肝炎病毒细胞培养液在冰浴条件下超声破碎，使用的超声破碎仪功率额定功率为1500w，输出功率为

1200w，破碎次数为5次，使细胞破碎率达99％以上，所述甲型肝炎病毒为甲肝病毒SH毒株，保藏号为CGMCC No.4501；

2）氯仿抽提上清液，得到粗制病毒液；所述氯仿抽提是将氯仿按体积比为1:2加入上清液振摇，然后4000r/min离心后吸取上层水相，如此重复抽提6次；将蛋白相和氯仿再用抽提缓冲液抽提并吸取上层水相，合并上层水相得到粗制病毒液；所述的抽提缓冲液为

120mM NaCl；

3）将粗制病毒液超滤浓缩，缓冲盐溶液洗脱超滤膜，超滤浓缩的倍数为20倍，超滤膜的截留分子量为50KD；缓冲盐溶液为3mol/L的PBS溶液，pH7.2；

4）疏水层析纯化浓缩病毒液；所述层析为：每次上样量为1500ml，上样缓冲液为2mol/L PBS，pH7.2，洗脱缓冲液为0.5mol/L PBS，pH7.2，流速为15ml/min；

5）用280nm波长对平衡好的购自GE公司的XK50/30柱上洗脱的病毒液进行检测，观测电导，根据电导观测结果，从电导30开始收集病毒液，一直收集到电导降到2.4，合并收集的病毒液即完成提纯工艺过程；

将收集到的甲型肝炎病毒液按其总体积的1/4500加入甲醛，再放37℃恒温室内，旋转13天即完成灭活过程；纯化甲肝病毒液灭活后甲肝病毒抗原效价为12800EU/ml，用2mM PBS、pH7.2、稀释20倍至甲肝病毒抗原效价640EU/ml，经无菌、效力、异常毒性、细菌内毒素检查后即为甲型肝炎病毒疫苗制品。

3.权利要求1或2所述的方法在制备甲型肝炎疫苗中的应用。

说明书

一种甲型肝炎病毒的提纯方法

技术领域

[0001] 本发明涉及病毒提纯方法领域，具体地，涉及一种甲型肝炎病毒的提纯方法。

背景技术

[0002] 甲型肝炎，简称甲肝，是由甲型肝炎病毒（HAV）引起的一种严重危害人类健康的急性传染病。甲肝主要通过“粪-口”途径传播，或个人间的传播，或因污染了甲肝病毒的水或者食物从而引起甲肝爆发。大龄儿童和成人感染甲肝后，70％以上为临床型感染，病死率为0.3％～0.6％；50岁以上患者的病死率为1.8％；慢性肝病者感染甲肝后，发生急性肝衰竭的危险性升高。随着生活条件的改善，成年人感染甲肝人数有增多趋势，临床型甲肝比例上升，从而甲肝成为较严重的公共卫生问题。

[0003] 我国是甲型肝炎高发区，每年至少有24万人患甲型肝炎，造成巨大的经济损失和社会危害，因此，研制并开发有效的预防和治疗甲型肝炎的疫苗和药物成为亟待解决的问题。

[0004] 目前世界上有两种预防控制甲肝的疫苗，一种是甲肝减毒活疫苗；另一种是甲肝灭活疫苗。由于各生产厂家使用的甲肝病毒纯化工艺不同，产品质量参差不齐。

[0005] 目前常见的甲肝病毒分离方法为分子筛层析技术，该技术特点是操作相对简单，而且生产应用已久，但该技术对甲肝病毒纯化的纯度不高，制得的甲肝抗原纯度低于50%，使得每剂甲型肝炎灭活疫苗成品中总蛋白浓度高于10μg/ml，这增加了甲型肝炎疫苗的不安全因素，增大了疫苗使用的风险，且增加了成本。因此迫切需要一种对甲肝病毒纯化效果好，病毒纯度更高，且单位体积层析胶纯化效率高，安全有效的甲型肝炎病毒提纯方法以利于大规模病毒生产纯化以供应疫苗生产。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种甲型肝炎病毒的提纯方法，以克服上述不足。

[0007] 本发明使用的甲型肝炎病毒SH株，其保藏编号为CGMCC No.4501，已公开在中国专利CN102174477A中。

[0008] 本发明提供一种甲型肝炎病毒的提纯方法，包括以下步骤：

[0009] 1）甲型肝炎病毒细胞培养液超声破碎，离心去除细胞碎片，收集上清液；

[0010] 2）氯仿抽提上清液，得到粗制病毒液；

[0011] 3）将粗制病毒液超滤浓缩，缓冲盐溶液洗脱超滤膜；

[0012] 4）疏水层析纯化浓缩病毒液；

[0013] 5）病毒液的检测与收集。

[0014] 其中，步骤1）所述甲型肝炎病毒细胞培养液超声破碎是将抗原滴度达到1：256-1024的甲型肝炎病毒细胞培养液在冰浴条件下超声破碎。

[0015] 其中，步骤1）所述所述超声破碎使用的超声破碎仪功率为500-1500w，输出功率为50%-95%，破碎次数为4-6次。

[0016] 其中，所述步骤1）的离心方法为3500-4500r/min，离心5min-10min。

[0017] 其中，所述步骤2）氯仿抽提是将氯仿按体积比为1:1-3加入上清液振摇，然后3500-4500r/min离心后吸取上层水相，如此重复抽提4-6次；将蛋白相和氯仿再用抽提缓冲液抽提并吸取上层水相，合并上层水相得到粗制病毒液。

[0018] 其中，所述的抽提缓冲液为120mM NaCl或6.2mM PBS。

[0019] 其中，所述步骤3）超滤浓缩的倍数为10-30倍，超滤膜的截留分子量为50-100KD。

[0020] 其中，所述步骤3）缓冲盐溶液为2-4mol/L的PBS溶液，pH7.2。

[0021] 其中，所述步骤4）层析方法为：每次上样量为1000-2000ml，上样缓冲液为2mol/L PBS，pH7.2，洗脱缓冲液为0.5mol/L PBS，pH7.2，流速为15ml/min。

[0022] 进一步地，用280nm波长对平衡好的柱上洗脱病毒液进行检测。

[0023] 本发明提供了上述甲型肝炎病毒提纯方法在制备甲型肝炎疫苗中的应用。

[0024] 将通过疏水层析步骤收集到的病毒液进行灭活，按照体积比1:4000-5000将甲醛添加入病毒液中，37℃恒温，旋转12-15天完成灭活过程。

[0025] 灭活甲型肝炎病毒根据效价稀配后经无菌、效力、异常毒性、细菌内毒素等检查后即为甲型肝炎病毒疫苗制品。

[0026] 本发明具有以下有益的效果：（1）提高了甲型肝炎病毒回收率，高浓度缓冲盐洗脱超滤膜，有效减少超滤膜对病毒的吸附；（2）提高了病毒纯度，细胞病毒液经超声破碎、氯仿抽提、超滤膜超滤浓缩和凝胶过滤层析可有效去除杂蛋白，提高病毒纯度，使用本发明方法纯化得到的甲型肝炎病毒的纯度大于95%；（3）本发明方法纯化得到的甲型肝炎病毒用于甲型肝炎或疫苗的制备中，每剂有效剂量的甲型肝炎灭活疫苗成品中总蛋白浓度低于3μg/ml，比现有技术中总蛋白浓度高于10μg/ml更加安全可靠。因此本发明方法提纯的病毒用于制备甲型肝炎病毒疫苗具有安全可靠，免疫原性好、特异性强。

附图说明

[0027] 图1为实施例1中纯化得到的甲型肝炎病毒的VP1、VP2和VP3含量检测HPLC色谱图。

[0028] 图2为实施例2中纯化得到的甲型肝炎病毒的VP1、VP2和VP3含量检测HPLC色谱图。

[0029] 图3为实施例3中纯化得到的甲型肝炎病毒的VP1、VP2和VP3含量检测HPLC色谱图。

具体实施方式

[0030] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

[0031] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

[0032] 实施例1甲型肝炎病毒的提纯方法与制备疫苗的应用（1）

[0033] 1、取1000ml甲型肝炎病毒收获液（甲肝病毒SH毒株保藏号：CGMCC No.4501）。将甲型肝炎病毒收获液（无菌抗原滴度达到1:512）在冰浴条件下，使用超声波粉碎仪（购自宁波新芝公司，额定功率1500w，输出功率1200w）破碎细胞温，使细胞破碎率达99％以上，超声破碎4次；

[0034] 2、将超声破碎后的细胞液以3500r/min的转速离心10min，收集上清液；

[0035] 3、氯仿按体积比1:3加入上清液中振摇，3500r/min离心吸取上层水相；蛋白相和氯仿再用抽提缓冲液（6.2mM PBS）抽提，加氯仿震摇后吸取上清为1次抽提，重复抽提5次，合并上层水相得粗制病毒液；

[0036] 4、将步骤3制得的粗制甲肝病毒液经超滤膜超滤浓缩，超滤浓缩10倍，超滤膜的截留分子量为50KD；

[0037] 5、用高浓度缓冲盐溶液2mol/L的PBS溶液，pH7.2洗脱超滤膜；

[0038] 6、浓缩的病毒液经凝胶层析纯化，凝胶层析所用层析柱为Phenyl Sepharose6FF。层析方法为：每次上样量为1000ml，上样缓冲液为2mol/LPBS，pH7.2，洗脱缓冲液为
0.5mol/L PBS，pH7.2，流速为15ml/min。

[0039] 7、检测与收集病毒。用280nm波长对平衡好的XK50/30柱（购自GE公司）上洗脱的病毒液进行检测（观测电导），根据电导观测结果，从电导30开始收集病毒液，一直收集到电导降到2.4，合并收集的病毒液即完成提纯工艺过程。

[0040] 8、HPLC纯度分析

[0041] 将步骤7中纯化所得HAV液加入终浓度为4mol/L盐酸弧(GuHCL)和lmmol/L二硫苏糖醇(DTT)的混合溶液中。50℃恒温水浴l0min裂解HAV颗粒。HPLC色谱柱为TSK-GEL G5000PW，流动相为6.2mmol/L pH6.8PBS，流速为0.6ml/min，紫外检测器波长为280nm，温度为25℃，每次进样量为50μl，出峰后从半峰高起收集甲型肝炎病毒的VP1、VP2和VP3蛋白峰。通过高效液相色谱仪系统软件分析发现，VP1、VP2和VP3纯度达97%，其中VP1纯度7%、VP2纯度64%、VP3纯度26%。HPLC色谱图见图1。

[0042] 9、灭活。将步骤7中收集到的甲型肝炎病毒液按其总体积的1/4000加入甲醛，再放37℃恒温室内，旋转12天即完成灭活过程。

[0043] 10、检定。灭活甲型肝炎病毒根据效价稀配后经无菌、效力、异常毒性、细菌内毒素等检查后即为甲型肝炎病毒疫苗制品。

[0044] （1）疫苗配制：

[0045] 纯化甲肝病毒液灭活后甲肝病毒抗原效价为6400EU/ml，用2mM PBS（pH7.2）稀释10倍至甲肝病毒抗原效价640EU/ml即为配制好的甲型肝炎灭活疫苗。

[0046] （2）无菌检查

[0047] 按中《华人民共和国药典》2010版第三部附录XII A无菌检查法进行。将疫苗用0.22μm滤膜过滤后，用0.1%蛋白胨溶液清洗滤膜，滤膜分成三份，分别放入2支硫乙醇酸盐培养基和1支改良马丁培养基中，其中1支硫乙醇酸盐培养基置30℃，其余置20℃培养
14天。无菌检查结果为合格。

[0048] （3）效力检查

[0049] 按《华人民共和国药典》2010版第三部附录X S法进行。将疫苗和甲肝病毒抗原参考品稀释成相同的一系列稀释度，用ELISA试剂，测出疫苗和参考品各个稀释度的吸光度，根据平行线统计法，计算出疫苗相对于参考品的相对效力。本实施例制得的疫苗效力为1.12。

[0050] （4）异常毒性检查

[0051] 按《华人民共和国药典》2010版第三部附录XII F法进行。腹腔注射疫苗，小鼠注射0.5ml，共5只，豚鼠注射5.0ml，共2只。观察7天。检测发现本实施例疫苗的异常毒性为0.50。

[0052] （5）细菌内毒素检查

[0053] 按《华人民共和国药典》2010版第三部附录XII E凝胶限量试验法进行。用鲎试剂检测细菌内毒素，疫苗应稀释80倍，以消除干扰因素的影响。结果发现本实施例制得甲肝疫苗的细菌内毒素为＜2.0EU/ml。

[0054] 实施例2甲型肝炎病毒的提纯方法与制备疫苗的应用（2）

[0055] 1、取1000ml甲型肝炎病毒收获液（甲肝病毒病毒SH毒株保藏号：CGMCC NO.4501）。将甲型肝炎病毒收获液（无菌抗原滴度达到1:256）在冰浴条件下，使用超声波粉碎仪（购自宁波新芝公司，额定功率1500w，输出功率1200w）破碎细胞温，使细胞破碎率达99％以上，超声破碎5次；

[0056] 2、超声破碎后的细胞液以4000r/min的转速离心8min，收集上清液；

[0057] 3、氯仿按体积比1:2加入上清液中振摇，4000r/min离心吸取上层水相；蛋白相和氯仿再用抽提缓冲液（120mM NaCl）抽提，加氯仿震摇后吸取上清为1次抽提，重复抽提6次，合并上层水相得粗制病毒液；

[0058] 4、将步骤3制得的粗制甲肝病毒液经超滤膜超滤浓缩，超滤浓缩20倍，超滤膜的截留分子量为50KD；

[0059] 5、用高浓度缓冲盐溶液3mol/L的PBS溶液，pH7.2洗脱超滤膜；

[0060] 6、浓缩的病毒液经凝胶层析纯化，凝胶层析所用层析柱为Phenyl Sepharose6FF。层析方法为：每次上样量为1500ml，上样缓冲液为2mol/LPBS，pH7.2，洗脱缓冲液为
0.5mol/L PBS，pH7.2，流速为15ml/min。

[0061] 7、检测与收集病毒。用280nm波长对平衡好的XK50/30柱（购自GE公司）上洗脱的病毒液进行检测（观测电导），根据电导观测结果，从电导30开始收集病毒液，一直收集到电导降到2.4，合并收集的病毒液即完成提纯工艺过程。

[0062] 8、HPLC纯度分析

[0063] 将步骤7中纯化所得HAV液加入终浓度为4mol/L盐酸弧(GuHCL)和lmmol/L二硫苏糖醇(DTT)的混合溶液中。50℃恒温水浴l0min裂解HAV颗粒。HPLC色谱柱为TSK-GEL G5000PW，流动相为6.2mmol/L pH6.8PBS，流速为0.6ml/min，紫外检测器波长为280nm，温度为25℃，每次进样量为50μl，出峰后从半峰高起收集甲型肝炎病毒的VP1、VP2和VP3蛋白峰。通过高效液相色谱仪系统软件分析发现，VP1、VP2和VP3纯度达98%，其中VP1纯度7%、VP2纯度65%、VP3纯度26%。HPLC色谱图见图2。

[0064] 9、灭活。将步骤7中收集到的甲型肝炎病毒液按其总体积的1/4500加入甲醛，再放37℃恒温室内，旋转13天即完成灭活过程。

[0065] 10、检定。灭活甲型肝炎病毒根据效价稀配后经无菌、效力、异常毒性、细菌内毒素等检查后即为甲型肝炎病毒疫苗制品。

[0066] （1）疫苗配制：

[0067] 纯化的甲肝病毒液灭活后甲肝病毒抗原效价为12800EU/ml，用2mM PBS（pH7.2）稀释20倍至甲肝病毒抗原效价640EU/ml即为配制好的甲型肝炎灭活疫苗。

[0068] （2）无菌检查

[0069] 按中《华人民共和国药典》2010版第三部附录XII A无菌检查法进行。将疫苗用0.22μm滤膜过滤后，用0.1%蛋白胨溶液清洗滤膜，滤膜分成三份，分别放入2支硫乙醇酸盐培养基和1支改良马丁培养基中，其中1支硫乙醇酸盐培养基置32℃，其余置23℃培养
14天。本实施例制得疫苗的无菌检查结果合格。

[0070] （3）效力检查

[0071] 按《华人民共和国药典》2010版第三部附录X S法进行。将疫苗和甲肝病毒抗原参考品稀释成相同的一系列稀释度，用ELISA试剂，测出疫苗和参考品各个稀释度的吸光度，根据平行线统计法，计算出疫苗相对于参考品的相对效力。本实施例制得疫苗的效力为1.05。

[0072] （4）异常毒性检查

[0073] 按《华人民共和国药典》2010版第三部附录XII F法进行。腹腔注射疫苗，小鼠注射0.5ml，共5只，豚鼠注射5.0ml，共2只。观察7天。本实施例制得疫苗的异常毒性为0.50。

[0074] （5）细菌内毒素检查

[0075] 按《华人民共和国药典》2010版第三部附录XII E凝胶限量试验法进行。用鲎试剂检测细菌内毒素，疫苗应稀释80倍，以消除干扰因素的影响。本实施例制得疫苗的细菌内毒素为＜2.0EU/ml。

[0076] 实施例3甲型肝炎病毒的提纯方法与制备疫苗的应用（3）

[0077] 1、取1000ml甲型肝炎病毒收获液（甲肝病毒毒株保藏号：CGMCC NO.4501）。将甲型肝炎病毒收获液（无菌抗原滴度达到1:1024）在冰浴条件下，使用超声波粉碎仪（购自宁波新芝公司，额定功率1500w，输出功率1200w）破碎细胞温，使细胞破碎率达99％以上，超声破碎5次；

[0078] 2、超声破碎后的细胞液以4500r/min的转速离心5min，收集上清液；

[0079] 3、氯仿按体积比1:1加入上清液中振摇，4500r/min离心吸取上层水相；蛋白相和氯仿再用抽提缓冲液（120mM NaCl）抽提，加氯仿震摇后吸取上清为1次抽提，重复抽提4次，合并上层水相得粗制病毒液；

[0080] 4、将步骤3制得的粗制甲肝病毒液经超滤膜超滤浓缩，超滤浓缩30倍，超滤膜的截留分子量为100KD；

[0081] 5、用高浓度缓冲盐溶液4mol/L的PBS溶液，pH7.2洗脱超滤膜；

[0082] 6、浓缩的病毒液经凝胶层析纯化，凝胶层析所用层析柱为Phenyl Sepharose6FF。层析方法为：每次上样量为2000ml，上样缓冲液为2mol/LPBS，pH7.2，洗脱缓冲液为
0.5mol/L PBS，pH7.2，流速为15ml/min。

[0083] 7、检测与收集病毒。用280nm波长对平衡好的XK50/30柱（购自GE公司）上洗脱的病毒液进行检测（观测电导），根据电导观测结果，从电导30开始收集病毒液，一直收集到电导降到2.4，合并收集的病毒液即完成提纯工艺过程。

[0084] 8、HPLC纯度分析

[0085] 将步骤7中纯化所得HAV液加入终浓度为4mol/L盐酸弧(GuHCL)和lmmol/L二硫苏糖醇(DTT)的混合溶液中。50℃恒温水浴l0min裂解HAV颗粒。HPLC色谱柱为TSK-GEL G5000PW，流动相为6.2mmol/L pH6.8PBS，流速为0.6ml/min，紫外检测器波长为280nm，温度为25℃，每次进样量为50μl，出峰后从半峰高起收集甲型肝炎病毒的VP1、VP2和VP3蛋白峰。通过高效液相色谱仪系统软件分析发现，VP1、VP2和VP3纯度达97%，其中VP1纯度7%、VP2纯度64%、VP3纯度26%。HPLC色谱图见图3。

[0086] 9、灭活。将步骤7中收集到的甲型肝炎病毒液按其总体积的1/5000加入甲醛，再放37℃恒温室内，旋转15天即完成灭活过程。

[0087] 10、检定。灭活甲型肝炎病毒根据效价稀配后经无菌、效力、异常毒性、细菌内毒素等检查后即为甲型肝炎病毒疫苗制品。

[0088] （1）疫苗配制：

[0089] 纯化的甲肝病毒液灭活后甲肝病毒抗原效价为12800EU/ml，用2mM PBS（pH7.2）稀释20倍至甲肝病毒抗原效价640EU/ml即为配制好的甲型肝炎灭活疫苗。

[0090] （2）无菌检查

[0091] 按中《华人民共和国药典》2010版第三部附录XII A无菌检查法进行。将疫苗用0.22μm滤膜过滤后，用0.1%蛋白胨溶液清洗滤膜，滤膜分成三份，分别放入2支硫乙醇酸盐培养基和1支改良马丁培养基中，其中1支硫乙醇酸盐培养基置35℃，其余置25℃培养
14天。本实施例制得疫苗的无菌检查结果合格。

[0092] （3）效力检查

[0093] 按《华人民共和国药典》2010版第三部附录X S法进行。将疫苗和甲肝病毒抗原参考品稀释成相同的一系列稀释度，用ELISA试剂，测出疫苗和参考品各个稀释度的吸光度，根据平行线统计法，计算出疫苗相对于参考品的相对效力。本实施例制得疫苗的效力为1.10。

[0094] （4）异常毒性检查

[0095] 按《华人民共和国药典》2010版第三部附录XII F法进行。腹腔注射疫苗，小鼠注射0.5ml，共5只，豚鼠注射5.0ml，共2只。观察7天。本实施例制得疫苗的异常毒性为0.50。

[0096] （5）细菌内毒素检查

[0097] 按《华人民共和国药典》2010版第三部附录XII E凝胶限量试验法进行。用鲎试剂检测细菌内毒素，疫苗应稀释80倍，以消除干扰因素的影响。本实施例制得疫苗的细菌内毒素为＜2.0EU/ml。