单核苷多态性rs3888188在检测结核病易感性中的应用

摘要

本发明公开了单核苷多态性rs3888188在检测结核病易感性中的应用。所述SNP为rs3888188，位于人IFITM3基因核心启动子区域(即转录起始位点上游103bp处/翻译起始位点ATG上游204bp处)，rs3888188G为结核病易感的风险因素，rs3888188的多态性与结核病具有很高的相关性。当该位点的基因型为GG时，待测个体的结核病易感性或患有结核病的风险增高。本发明在诊断并治疗结核病，从而为合理预防结核病方面重要意义和价值。

权利要求

1.检测人基因组中rs3888188多态性或基因型的物质在制备如下1）-4）中任一所述产品中的应用：

1）检测与结核病相关的单核苷酸多态性的产品；

2）检测结核病易感性或患有结核病风险的产品；

3）鉴定或辅助鉴定结核病易感基因的产品；

4）筛查结核病患者的产品。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述用于检测人基因组中rs3888188多态性或基因型的物质含有扩增包括rs3888188在内的人基因组DNA片段的PCR引物对。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述PCR引物对由序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成。

4.一种检测与结核病相关的单核苷酸多态性的产品，其特征在于：所述产品中含有用于检测人基因组中rs3888188多态性或基因型的物质。

5.一种检测结核病易感性或患有结核病风险的产品，其特征在于：所述产品中含有用于检测人基因组中rs3888188多态性或基因型的物质。

6.一种鉴定或辅助鉴定结核病易感基因的产品，其特征在于：所述产品中含有用于检测人基因组中rs3888188多态性或基因型的物质。

7.一种筛查结核病患者的产品，其特征在于：所述产品中含有用于检测人基因组中rs3888188多态性或基因型的物质。

8.根据权利要求4-7中任一所述的产品，其特征在于：所述用于检测人基因组中rs3888188多态性或基因型的物质含有扩增包括rs3888188在内的人基因组DNA片段的PCR引物对。

9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：所述PCR引物对由序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成。

10.检测人基因组中rs3888188、rs6598045和rs7478728多态性或基因型的物质在制备权利要求1-3中任一所述的1）-4）中任一所述产品中的应用。

11.一种检测结核病易感性或患有结核病风险的产品，其特征在于：所述产品为一比对卡，所述比对卡上设置如下序列：人IFITM3基因启动子区域中包括rs3888188、rs6598045和rs7478728的任意一段DNA序列，所述DNA序列中rs3888188、rs6598045和rs7478728的碱基分别为G、T和T，或分别为C、A和A。

12.权利要求11所述产品在制备筛查结核病患者产品中的应用。

说明书

单核苷多态性rs3888188在检测结核病易感性中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及单核苷多态性rs3888188在检测结核病易感性中的应用。

背景技术

[0002] 结核病（Tuberculosis，TB）是当今全球关注的三大传染病之一，严重威胁着民众的健康。我国结核病患者数量居世界第二位，开展结核病的遗传易感研究对消除结核病、降低死亡率、保障人民健康以及推动首都经济、卫生事业健康持续发展有重要科学价值和社会效益。

[0003] 结核病主要的致病菌为结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis,MTB），而结核病的发病是一个多因素综合作用的结果。结核病的发生、发展和临床结局，不仅受环境和MTB毒力的控制，而且受到宿主遗传免疫的影响。研究显示感染了MTB的个体中仅有10%最终进展为结核病，这提示宿主遗传差异在结核病的发病中起主导作用。在以病例-对照研究为基础的基因相关性分析和全基因组关联分析，都已取得了令人信服的证据，即个体对结核病易感的差异性部分是由宿主基因决定的。

[0004] 目前，尚没有研究证明干扰素诱导的跨膜蛋白3（IFITM3）及其基因IFITM3与结核病易感关联。由于基因的启动子序列能够结合转录因子或调控因子，因而其对基因自身的转录、表达至关重要。启动子区域的单核苷酸多态性（SNP）可能通过改变启动子与转录因子或调控因子的结合能力影响着基因的转录活性。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供单核苷多态性rs3888188在结核病方面的新用途。

[0006] 所述新用途为检测人基因组中rs3888188多态性或基因型的物质在制备如下1）-4）中任一所述产品中的应用：

[0007] 1）检测与结核病相关的单核苷酸多态性的产品；

[0008] 2）检测结核病易感性或患有结核病风险的产品；

[0009] 3）鉴定或辅助鉴定结核病易感基因的产品；

[0010] 4）筛查结核病患者的产品。

[0011] 本发明保护含有用于检测人基因组中rs3888188多态性或基因型的物质的上述1）-4）中的任一所述产品。

[0012] 所述用于检测人基因组中rs3888188多态性或基因型的物质含有扩增包括rs3888188在内的人基因组DNA片段的PCR引物对。

[0013] 所述PCR引物对具体可由序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成。

[0014] 本发明保护检测人基因组中rs3888188、rs7478728和rs6598045多态性或基因型的物质在制备上述1）-4）中任一所述产品中的应用。

[0015] 本发明还提供一种检测结核病易感性或患有结核病风险的产品，所述产品为一比对卡，所述比对卡上设置如下序列：人IFITM3基因启动子区域中包括rs3888188、rs6598045和rs7478728的任意一段DNA序列，所述DNA序列中rs3888188、rs6598045和rs7478728的碱基分别为G、T和T，或分别为C、A和A。若待测个体的在rs3888188、rs6598045和rs7478728三个位点的碱基与比对卡的相同或互补，则判定该待测个体结核病易感性或患有结核病风险增高。

[0016] 本发明保护所述比对卡在制备筛查结核病产品中的应用。

[0017] 在本发明的实施例中，所述结核病具体为中国北方汉族儿童结核病。

[0018] 所述rs3888188为refSNP ID，是人IFITM3基因（位于染色体11p15.5）核心启动子区域转录起始位点上游103bp处或翻译起始位点ATG上游204bp处的T/G二等位多态性的SNP位点。所述rs3888188的基因型是GG、GT或TT。所述GG是rs3888188位点为G的纯合型，所述TT是rs3888188位点为T的纯合型，所述GT是rs3888188位点为T和G的杂合型。所述检测人基因组中rs3888188的多态性或基因型具体可为检测rs3888188的核苷酸种类。

[0019] 所述rs6598045为refSNP ID，是人IFITM3基因（位于染色体11p15.5）核心启动子区域翻译起始位点ATG上游188bp处的C/T二等位多态性的SNP位点。

[0020] 所述rs7478728为refSNP ID，是人IFITM3基因（位于染色体11p15.5）核心启动子区域翻译起始位点ATG上游181bp处的C/T二等位多态性的SNP位点。

[0021] 实验证明，rs3888188（-204T/G）SNP位点的G等位基因在中国北方汉族儿童结核病患儿中所占比例显著高于正常对照（66.2%vs.60.5%,P=0.007），即rs3888188G为结核病易感的风险因素，rs3888188的多态性与结核病具有很高的相关性。因此，通过检测该位点的核苷酸种类、判断该位点的基因型可用于检测结核病的易感性或患有结核病风险，如检测得到的rs3888188基因型为GG的个体与TT个体相比，更容易患有结核病或患有结核病的风险高。

[0022] 实验证明，不同rs3888188基因型（GG、GT、TT）的正常人外周淋巴细胞经IFN-γ诱导后，GG个体的IFITM3基因mRNA表达水平最低，未受干扰素IFN-γ诱导而明显增高，说明IFITM3基因表达量不足为结核病发病风险因素，即IFITM3基因为结核病易感基因。因此，通过检测该位点的核苷酸种类，判断该位点的基因型，可用于鉴定或辅助鉴定与该位点相关的基因是否为结核病易感基因。

[0023] 实验证明，rs3888188的G等位基因在结核病患儿中所占比例显著增加（66.2%vs.60.5%,P=0.007）。因此，在实际应用中，可将检测该位点多态性的物质与其它物质（如检测其它的与结核病相关的单核苷酸多态性的物质）联合在一起制备筛查结核病患者的产品。

[0024] 其中，检测人基因组中rs3888188的多态性的物质可为通过下述至少一种方法确定rs3888188的多态性所需的试剂和/或仪器：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和SNP芯片。所述产品可为试剂或试剂盒，还可为试剂或试剂盒和仪器的组合产品，如由引物和DNA测序仪组成的组合产品，由PCR试剂和DNA测序试剂和DNA测序仪组成的组合产品。

[0025] 本发明实施例采用PCR引物扩增包括rs3888188在内的基因组DNA片段，对得到的346bp的PCR产物进行序列检测，确定rs3888188的多态性和基因型。所述PCR引物在序列上没有特殊要求，只要能扩增出包括rs3888188在内的基因组DNA片段即可，具体可为序列表序列1和序列2所示的单链DNA。

[0026] 本发明所提供的应用和产品在诊断并治疗结核病，从而在合理预防结核病方面具有重要意义和价值。

附图说明

[0027] 图1为三种单体型启动子对萤光素酶活性的影响。

[0028] 图2为IFN-γ诱导下rs3888188基因型不同的外周淋巴细胞中IFITM3基因mRNA表达水平。

具体实施方式

[0029] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0030] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0031] 实施例1、rs3888188的单核苷酸多态性与结核病相关（病例-对照分析）[0032] 对来自中国北方汉族儿童的951例正常对照（即正常对照组）和368例结核病（即结核病例组）DNA样本的IFITM3基因核心启动子序列（如序列表序列3所示）进行PCR扩增，将扩增获得的PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳分离，回收并纯化346bp的条带进行测序。

[0033] 使用在线Shesis 软件（http://analysis.bio-x.cn/SHEsisMain.htm）对测序所见SNP位点进行等位基因频率和基因型频率的统计、针对等位基因和基因型分别进行结核病例组和正常对照组的卡方检测和odds ratio（优势比）的计算、位点间连锁分析、单倍体分析等遗传学统计分析，共获得2个与结核病显著相关的SNP位点rs3888188和rs7478728，及1个与结核病不相关的SNP位点rs6598045，对这三个SNP位点进行基因分型的结果如表1所示。其中，rs3888188（-204T/G）SNP位点的G等位基因以及rs7478728（-181C/T）的T等位基因在结核病患儿中所占比例显著增加（66.2%vs.60.5%,P=0.007；82.6%vs.77.9%,P=0.008），即rs3888188G和rs7478728T为儿童结核病易感的风险因素。

[0034] 由上述三个SNP构成的单倍体分析显示（表2），人群中存在三个主要的单体型（＞10%），分别为GTT、TTC和TCT，其中，GTT单体型在结核病人中显著增加（63.6%vs.56.6%，P=0.002，OR=1.32），而TTC单体型在对照组中显著增加（21.8%vs.17.0%，P=0.005，OR=0.73）。

[0035] 表1.基因分型结果

[0036]

[0037] 注：位置一栏中“-204”表示位于IFITM3基因翻译起始位点ATG上游的204bp处；其它同理；

[0038] n表示数目；OR（95%CI）表示优势比（95%的置信区间）；P值表示统计学意义，当P﹤0.05表示比较的样本有显著差异，当p﹤0.01表示比较的样本有极显著差异（已用**标出）。

[0039] 表2单体型分析结果

[0040]

[0041] 注：OR（95%CI）表示优势比（95%的置信区间）；P值表示统计学意义，当P﹤0.05表示比较的样本有显著差异，当p﹤0.01表示比较的样本有极显著差异（已用**标出）。

[0042] 上述PCR扩增的特异性引物如下：

[0043] 上游引物：5’-GAG CCC TGA ACC GGG ACA GTG-3’（如序列表序列1所示）；

[0044] 下游引物：5’-TGG TGT CCA GCG AAG ACC AGC-3’（如序列表序列2所示）。

[0045] 上述PCR扩增的反应体系（50μl）：待测DNA样品0.50ng、上下游引物各30pmol、2×Taq Plantinum PCR MasterMix(天根生化科技（北京）有限公司，货号KT204)25μl）和去离子水。其中，2×TaqPlantinum PCR MasterMix包括：Taq DNA聚合酶（0.1U/μL），KCl(20mM)，MgCl2(4mM)和dNTP(500μM)。

[0046] 上 述 PCR 扩 增 的 反 应 条 件：94 ℃ 变 性 3min；35 个 循 环：94℃30s,68℃30s,72℃30s；72℃延伸10min。

[0047] 上述三个SNP位点对应于序列表序列3的位置分别为：

[0048] 与结核病相关的rs3888188（-204T/G）对应于序列表序列3的第142位；

[0049] 与结核病不相关的rs6598045（-188C/T）对应于序列表序列3的第158位；

[0050] 与结核病相关的rs7478728（-181C/T）对应于序列表序列3的第165位。

[0051] 实施例2、IFITM3基因为结核病易感基因

[0052] 一、IFITM3基因启动子上的SNP对IFITM3基因表达的影响

[0053] 将三个SNP位点rs3888188、rs6598045和rs7478728为GTT、TTC或TCT单体型启动子序列构建到相应的双萤光素酶报告基因检测载体pGL3-basic（Promega，E1751）中进行双萤光素酶报告基因实验，对上述不同单体型启动子的转录活性进行比较，具体如下：

[0054] 1、引物的设计

[0055] 上游引物起始于IFITM3基因转录起始位点上游244bp处，下游引物终止于IFITM3基因转录起始位点下游102bp处（翻译起始位点ATG前一碱基处）。上下游酶切位点分别选取NheI（GCTAGC）和XhoI（CTCGAG），引物序列如下：

[0056] 上游引物：5’-TATACTGCAGCTAGCGAGCCCTGAACCGGGACAGTG-3’；

[0057] 下游引物：5’-TATACTGCACTCGAGTGGTGTCCAGCGAAGACCAGC-3’。

[0058] 2、PCR扩增及载体构建

[0059] 以相应单体型的基因组DNA为模板，利用步骤1的引物对进行PCR扩增，将得到377bp的产物进行回收纯化及测序。将测序正确的片段经NheI和XhoI双酶切后连入载体pGL3-basic的NheI和XhoI位点间，经酶切和测序证实，获得了插入GTT单体型启动子的重组载体A，插入TTC单体型启动子的重组载体B和插入TCT单体型启动子的重组载体C。

[0060] 3、双萤光素酶报告基因检测

[0061] 将步骤2获得的三种重组载体A、B和C分别转染入Hela细胞，获得含重组载体A的Hela细胞甲，含重组载体B的Hela细胞乙和含重组载体C的Hela细胞丙，用含10%胎牛血清(GIBCO,货号16000-044)的DMEM(Invitrogen，货号31600-034)培养基分别培养上述细胞，每种细胞分成三组分别在培养48小时后，在培养基中添加干扰素-γ(终浓度100pg/ml)诱导0、5和20小时，使用双萤光素酶报告基因活性检测试剂盒(Promega，货号E2920)，并按照使用说明(Dual-Glo Luciferase Assay System Technical Manual)检测三种单体型启动子下游的萤光素酶相对活性，结果如图1所示，其中，图1中的“+”表示相对于单体型GTT启动子的结果差异显著性(P＜0.05）。

[0062] 结果表明：结核病人中多见的GTT单体型启动子的活性最低，这说明结核病易感等位基因rs3888188G 、rs6598045T和rs7478728T的变异降低了IFITM3基因的表达，即IFITM3基因表达量不足为结核病发病风险因素。

[0063] 二、rs3888188的单核苷酸多态性对IFITM3基因mRNA表达的影响[0064] 由于rs3888188(-204T/G)和rs7478728(-181C/T)两个SNP与结核病易感相关，而两者有较高的连锁性(97%)，我们选取正常人群rs3888188(-204T/G)不同基因型个体(GG、GT、TT)的外周淋巴细胞用含10%胎牛血清(GIBCO，货号16000-044)的1640培养基(Invitrogen，货号31800-022)培养，每个样本细胞分成三份，分别在体外培养24小时后，在培养基中添加终浓度100pg/ml的IFN-γ，提取经IFN-γ诱导0、2、8和24小时的细胞总RNA，反转录后获得cDNA，以此cDNA为模板，用特异引物F和R对IFITM3基因进行实时荧光定量PCR扩增，以18S为内参基因，引物为FC和RC。实时荧光定量PCR在ABI7000实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen -ΔΔCT
TD(2001)报道的方法，即2 计算相对表达量。

[0065] ΔΔCT＝(CT.Target-CT.Actin)Time x-(CT.Target-CT.Actin)Time 0[0066] Time x表示任意时间点，Time 0表示经18S校正后1倍量的目标基因表达。

[0067] IFITM3基因的特异引物序列如下(靶序列为IFITM3基因cDNA上的序列，大小为402bp)：

[0068] F：5’-ATG AAT CAC ACT GTC CAA ACC TTC T -3’；

[0069] R：5’-CTA TCC ATA GGC CTG GAA GAT CAG -3’；

[0070] 内参基因18S的特异引物序列如下：

[0071] FC:5'-GGAAGGGCACCACCGGAG-3'；

[0072] RC:5'-TGCAGCCCCGGACATCAAG-3'。

[0073] 结果如图2所示，其中，图2中的“*”表示相对于TT基因型结果的P﹤0.01的差异显著性；“＋”表示相对于TT基因型结果的P﹤0.05的差异显著性。结果表明：在正常人群中，携带有结核病易感基因型rs3888188GG的个体，其外周血淋巴细胞IFITM3基因在有或无IFN-γ诱导情况下均相对于携带rs3888188TT基因型的个体低表达，这说明IFITM3基因表达量不足为结核病发病的风险因素。