通过由提取自趋磁细菌并经受交变磁场的磁小体的各种链所产生的热的释放诱导的癌症或肿瘤的治疗转让专利
申请号 : CN201080060420.9
文献号 : CN102811726B
文献日 : 2015-03-18
发明人 : E·阿尔方德里 , S·富尔 , I·舍比
申请人 : 纳米细菌公司
摘要 :
权利要求 :
1.细菌磁小体的链在制备通过热治疗用于治疗肿瘤的药物中的用途,所述细菌磁小体的链分离自趋磁细菌,其中大多数磁小体具有链延伸方向上的结晶学方向。
2.根据权利要求1的用途,其中所述肿瘤为实体肿瘤。
3.根据权利要求1的用途,其中磁小体的链经受交变磁场来导致热的产生。
4.根据权利要求1或3所述的用途,其中所述磁小体的链含有至少2个磁小体。
5.根据权利要求4所述的用途,其中所述磁小体的链含有2至30个磁小体。
6.根据权利要求5所述的用途,其中所述磁小体的链含有4至20个磁小体。
7.根据权利要求1所述的用途,其中所述磁小体包含在具有介于10至120nm之间的大小的链中。
8.根据权利要求1所述的用途,其中所述磁小体的链获自趋磁细菌,趋磁细菌在含有铁和/或其它过渡金属的生长培养基中培养。
9.根据权利要求8所述的用途,其中所述其它过度金属是钴、镍、铜、锌、锰、或铬。
10.根据权利要求1所述的用途,其中所述磁小体的链获自趋磁细菌,趋磁细菌在含有螯合剂的生长培养基中培养。
11.根据权利要求10所述的用途,其中所述螯合剂选自双膦酸、罗丹明和EDTA。
12.根据权利要求1所述的用途,其中所述磁小体的链具有结合至磁小体和/或并入磁小体的试剂,其中试剂用于使磁小体的链可见。
13.根据权利要求12所述的用途,其中所述试剂是荧光团。
14.根据权利要求12所述的用途,其中所述试剂是荧光团和螯合剂。
15.根据权利要求14所述的用途,其中所述螯合剂是罗丹明。
16.根据权利要求1所述的用途,其中所述磁小体的链包囊于囊泡中。
17.根据权利要求16所述的用途,其中所述囊泡和活性成分组合使用。
18.根据权利要求1所述的用途,其中所述肿瘤细胞或肿瘤的治疗是过热。
19.根据权利要求18所述的用途,其中所述治疗的温度介于37℃至45℃之间。
20.根据权利要求19所述的用途,其中所述治疗的温度介于40℃至45℃之间。
21.根据权利要求20所述的用途,其中所述治疗的温度在43℃。
22.根据权利要求1所述的用途,其中所述肿瘤细胞或肿瘤的治疗是热消融。
23.根据权利要求22所述的用途,其中所述治疗的温度介于45℃至100℃之间。
24.根据权利要求23所述的用途,其中所述治疗的温度介于45℃至70℃之间。
25.根据权利要求24所述的用途,其中所述治疗的温度介于45℃至55℃之间。
26.根据权利要求25所述的用途,其中所述治疗的温度介于50℃至55℃之间。
27.根据权利要求1所述的用途,其中所述磁场的频率介于50至1000kHz之间。
28.根据权利要求27所述的用途,其中所述磁场的频率介于100至500kHz之间。
29.根据权利要求28所述的用途,其中所述磁场的频率介于100至200kHz之间。
30.根据权利要求1所述的用途,其中所述磁场的幅介于0.1至200mT之间。
31.根据权利要求30所述的用途,其中所述磁场的幅介于1至100mT之间。
32.根据权利要求31所述的用途,其中所述磁场的幅介于10至50mT之间。
33.根据权利要求1所述的用途,其中所述磁场施加的时间段在1秒至6小时之间可变。
34.根据权利要求33所述的用途,其中所述磁场施加的时间段在1分钟至1小时之间可变。
35.根据权利要求34所述的用途,其中所述磁场施加的时间段在1分钟至30分钟之间可变。
36.根据权利要求1所述的用途,其中所述加热方法是重复的。
37.根据权利要求1所述的用途,其中通过使用磁场通过磁小体的链进行对肿瘤或肿瘤细胞的靶向。
38.根据权利要求1所述的用途,其中所述对肿瘤或肿瘤细胞的靶向是通过将靶向肿瘤的生物和/或化学靶向分子附着至磁小体的链上或附着至含有磁小体的链的囊泡上得以实现的。
39.根据权利要求38所述的用途,其中生物和/或化学靶向分子是抗体和/或叶酸和/或PEG分子。
40.根据权利要求3所述的用途,其中施加所述交变磁场来改善磁小体的链于肿瘤细胞中的穿透。
41.磁小体的链在制备用于在有需求的受试者中治疗兴趣细胞或组织的药物中的用途,其是通过使用热的产生诱导的治疗,其中使用磁小体的链并且其中这些链经受交变磁场来导致热的产生,所述细菌磁小体的链分离自趋磁细菌,其中大多数磁小体具有链延伸方向上的结晶学方向。
42.根据权利要求41所述的用途,其中所述细胞或组织是肿瘤细胞或肿瘤。
43.一种试剂盒,其包括细菌磁小体的链和装置,装置能够产生交变磁场,其中所述细菌磁小体的链分离自趋磁细菌,其中大多数磁小体具有链延伸方向上的结晶学方向。
44.根据权利要求43的试剂盒,其中所述磁小体的链包囊在囊泡中。
45.一种用于在趋磁细菌中生产磁小体的链的方法,其中大多数磁小体具有链延伸方向上的结晶学方向,其中趋磁细菌在含有铁源和螯合剂和/或除铁以外的过渡金属的生长培养基中培养,其中所述方法使得能够提高磁小体的大小和链的长度,及其加热性质。
46.根据权利要求45所述的方法,其中所述过渡金属为钴、镍、铜、锌、锰、或铬。
47.一种药物,其包含细菌磁小体的链,所述细菌磁小体的链分离自趋磁细菌,其中大多数磁小体具有链延伸方向上的结晶学方向。
48.一种医疗装置,其包含细菌磁小体的链,所述细菌磁小体的链分离自趋磁细菌,其中大多数磁小体具有链延伸方向上的结晶学方向。
49.一种细菌磁小体的链的生产方法,其中:
所述细菌磁小体的链分离自趋磁细菌,其中大多数磁小体具有链延伸方向上的结晶学方向,所述趋磁细菌获自权利要求45所述的方法。
说明书 :
通过由提取自趋磁细菌并经受交变磁场的磁小体的各种链
所产生的热的释放诱导的癌症或肿瘤的治疗
技术领域
(thermoablation)的热治疗。本公开中所述的磁性元素类型是通过生物方法合成的氧化铁
纳米颗粒的链。
背景技术
培养细菌来获得:
源自铁或任何其它过渡金属之一的阳离子形成复合物的单齿(monodentate)或多齿配体
(polydentate ligand)。
体的链还可以包囊于脂质囊泡中(存在或不存在活性成分(principle))并这样用于热疗。
生这样的想法,磁性纳米颗粒可能通过过热或热消融有助于破坏或消除肿瘤,或磁性纳米
颗粒可用于在身体的特定区域释放药物。这种研究领域经常特指交变磁场(AMF)过热,由
于其要求应用交变磁场来诱导通过纳米颗粒产生热。在之前的工作中,已经使用化学合成
的纳米颗粒诱导热,主要是超顺磁氧化铁纳米颗粒(SPION)的形式,其混合于溶液中或与细
胞混合或施用至活的有机体中。还在动物模型上以及临床上在人类上评价了这些加热的
纳米颗粒的抗肿瘤活性。之前进行的工作的综述体现在此后列出的参考文献中(Bae等人,
J.Controlled Release,2007,122,16-23;Ciofani等人,Med.Hypotheses,2009,73,80-82;
De Nardo,Clin.Cancer Res.,2005,11,7087s-7092s;De Nardo 等 人,J.Nucl.
Med.,2007,48,437-444;Higler 等 人,Radiology,2001,218,570-575;Ito 等 人,
Cancer.Sci.,2003,94,308-313;Ito 等 人,J.Biosci.Bioeng.,2003,96,364-369;
Ito 等 人,Cancer Lett,2004,212,167-175;Ito 等 人,Cancer Immunol.
Immun.,2006,55,320-328;Johannsen 等 人,Int.J.Hyperthermia,2005,21,637-647;
Johannsen 等 人,Int.J.Hyperthermia,2007,52,1653-1662;Jordan 等 人,Int.
J.Hyperthermia,1993,9,51-68;Kawai等 人,Prostate,2005,64,373-381;Kawai等 人,
Prostate,2008,68,784-792;Kikumori等人,Breast Cancer Res.Treat,2009,113,435-4
41,Maier-Hauff等人,J.Neurooncol.,2007,81,53-60; 等人,Environ.Health
Persp.,2005,113,823-839;Ponce 等 人,Int.J.Hyperthermia,2006,22,205-213;Tai 等
人,Nanotechnology,2009,20,135101;Thisen等人,Int.J.Hyperthermia,2008,24,467-4
74)。
Medisys(美国公司,之前的Aduro Biotech和Triton Biosystem)。由这些公司已经发
表的模式描述了使用化学合成磁性纳米颗粒产生的热用于癌症治疗的各种途径(Sirtex:
US2006167313 或 WO 2004/064921;Triton Biosystems 现 在 的 Aspen Medisys、LLC:
US2003/0028071;Magforce:US2008/0268061)。
07A307-3)。为了将临床治疗期间引起的潜在副反应降低到最小,施用的纳米颗粒的量需要
尽可能小,而仍然保留它们希望的作用。对此,磁性纳米颗粒要产生足够大的热量,即显著
的特定吸收率(SAR)。
具有大体积或具有高磁晶各向异性的纳米颗粒来实现(Hergt等人,J.Phys.Condens.
Matter,2006,18,S2919-S2934)。
(Hergt等人,J.Phys.Condens.Matter,2006,18,S2919-S2934;Hergt等人,J.Magn.Magn.
Mater.,2005,293,80-86;Timko等人,J.Mag.Mag.Mat.,2009,321,1521-1524)。在以上的
参考文献中,用于进行实验的细菌磁小体类型尚未明确鉴别。
铁矿组成的磁小体从细菌提取之后,可以氧化成磁赤铁矿。磁小体在细菌内通常以链
的形式排列,但是个体磁小体也可以找到。细菌似乎使用磁小体在地球的地磁场中来
导航并帮助它们定位和维持它们的最佳生长和生存条件(Bazylinski等人,Nat.Rev.
Microbiol.,2004,2,217-230)。已经显示磁小体和磁小体磁铁矿晶体用于一些科学的、商
业的和健康的应用。例如,它们可用于检测单核苷酸多态性,用于提取DNA或用于检测磁性
地生物分子相互作用。它们还可用于免疫分析和受体结合分析或细胞分离中(Arakaki等
人,J.R.Soc.Interface,2005,5,977-999)。已经表明细菌磁小体可插入至脂质体中用于药
物递送的目的(专利号US6251365B1)。然而,在这种模式下很少给出实验证据,以及这种脂
质体的加热能力尚未证明或表明。细菌磁小体和阿霉素形成的复合物的抗癌活性已被实验
证明(Sun等人,Cancer Lett,2007,258,109-117)。在这种情况下,抗癌活性是由于阿霉素
的存在,而不是由于热诱导的治疗。到底,细菌磁小体还没有被验证可用于肿瘤或癌细胞的
体外或体内热治疗。
Sun等人,Sun等人,Nanotoxicology,2010,4,271-283)。
发明内容
的,只有以链的形式组织的并且从趋磁细菌中分离的磁小体产生高效的抗肿瘤活性。事实
上,还研究了包含在全AMB-1趋磁细菌中的细菌磁小体以及个体磁小体(从细菌中提取的
并用十二烷基硫酸钠(SDS)和热处理的)。尽管它们在溶液中的良好加热性质,然而这两种
类型的细菌磁小体和本发明磁小体的链相比,似乎没有或更少产生体内抗肿瘤活性。细菌
磁小体以链形式的组织对热疗效率的影响是本发明的突出贡献。
以就这样使用或包囊在囊泡中使用。通过使磁小体的链经受交变磁场(也称为振荡磁场)来
产生热。
长或更短的链的形成,并且不太可能以个体磁小体的形式出现。
菌并分离自细胞碎片。这些磁小体的链含有优选2至30个之间的磁小体,典型地4至
20个之间的磁小体。属于这些链的大多数磁小体具有结晶学方向并优选还便于在链延
伸的方向上进行轴定向的(axes orientated),其通常是[111](Alphandéry等人,ACS
Nano.,2009,3,1539-1547)。因此,磁小体的链具有磁各向异性,其比个体磁小体的强。因
此,避免了磁小体的链的强烈聚集。当含有典型地4至20个之间的磁小体的若干磁小体的
链相互作用时,其导致更长的磁小体的链的形成,典型地含有4个以上至20个的磁小体。磁
小体的链的长度优选1200纳米以下,更优选600纳米以下,最优选300纳米以下。磁小体
的链中的排列产生若干性质,这有利于体内加热。由于它们在链中的排列,磁小体不易于聚
集,并且还具有稳定的磁矩。这些性质都有助于磁小体的链的旋转,因此通过这种机制产生
热。磁小体在链中的排列还提供了与真核细胞的相互作用,由于它们聚集水平低这是有利
的。这种相互作用导致磁小体的链在真核细胞中的内在化(internalization)。例如,如在
实施例4中更详细描述的,当磁小体的链与细胞混合而施加交变磁场时,相当大比例的细
胞成为磁性的。在一个实施方式中,当施加交变磁场时,磁小体的链穿透到真核细胞中,从
而使得通过细胞内过热的机制破坏细胞。这种机制潜在地比细胞外过热更加高效,因为它
从内部破坏细胞。另一方面,当在个体磁小体存在下混合细胞而施加交变磁场时获得非常
小比例的磁性细胞,这表明个体磁小体仍然在真核细胞外,产生更低效率的细胞破坏机制。
的表面存在氨基基团使得能和各种生物活性大分子偶联,并产生生物相容性(Xiang等人,
Lett.Appl.Microbiol.,2007,6,75-81;Sun等人,Cancer Lett.,2007,258,109-117;Sun
等人,Biotech.Bioeng.,2008,101,1313-1320)。
个兼性厌氧弧菌(anaerobic vibrios)MV-1、MV-2和MV-4株、趋磁磁螺(Magnetospirillum
magnetotacticum)MS-1株、格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense)
MSR-1株、兼性厌氧趋磁螺菌属、趋磁螺菌(Magnetospirillum magneticum)MGT-1株以及
专性厌氧菌、脱硫弧菌属(Desulfovibrio magneticus)RS-1。
粒(即它们仅具有一个磁畴),其具有介于约10nm至约120nm之间、优选10nm至70nm之间、
最可能地30nm至50nm之间的大小。磁小体大小分布取决于细菌株和细菌生长条件可以非
常显著的不同。在AMB-1种中,磁小体的大部分具有介于30nm至50nm之间的大小。当一
种或更多种添加剂(比如本发明描述的那些)存在下进行磁小体生产时,可以获得大小上的
增加。治疗期间温度达到时,大的磁小体的大小导致亚铁磁的行为。还产生热稳定的磁矩。
因此,磁小体在有机体中的运动可以潜在地通过施加外部磁场得到控制。由于其稳定的磁
矩,磁小体比目前用于医学应用的更小的超顺磁氧化铁纳米颗粒(SPION)应当产生更好的
磁响应(magnetic response),其中SPION具有热不稳定的磁矩。作为大的单畴纳米颗粒
的磁小体,当其混悬于溶液中并暴露于交变磁场时,还比大多化学合成的纳米颗粒(通常以
SPION的形式)具有更好的加热特性。
余的最小磁小体。使用具有介于给定范围的大小的磁小体例如还可以有助于将它们引入给
定大小的囊泡。
间的直接接触还降低了毒性风险。磁小体的链的体内旋转可通过其包囊在脂质囊泡或相似
的结构类型中得以改善。
(Genc等人,Langmuir,2009,25,12604-12613)。
况下,磁小体吸收能力显著大于SUV的,因此加热效率更高。
脂酰胆碱)、DSPC(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱)、DMPE(二豆蔻酰磷脂酰乙醇
胺)或DPPE(二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺)。
酸-rac-(1-甘油)])、DPPG(二棕榈酰磷脂酰甘油)。带有各种电荷的脂质混合在一
起以便优化囊泡的表面电荷。事实上,后者是用囊泡包囊磁小体的链以及囊泡在细胞
中内在化的重要参数(Martina等人,J.Am.Chem.Soc.,,2005,127,10676;Tai等人,
Nanotechnology,2009,20,13501)。
的技术。在一个优选实施方式中,肿瘤中的温度过热期间达到介于约37℃至约45℃之间,
优选约40℃至约45℃之间,更优选在约43℃。
度在热消融期间达到介于约45℃至约100℃之间,更优选约45℃至约70℃之间。
健康细胞对热更加易感(见例如,Overgaard等人,Cancer,1977,39,2637-2646),本公开中
所述的热疗可以选择性地破坏肿瘤细胞。
的产生。
选1分钟至30分钟之间。
6小时以上。
液中存在的氧化铁的量估计这种量,其中混悬液被注射。其介于约0.001mg至约100mg氧
化铁之间,优选约0.01mg至约100mg氧化铁之间,更优选约0.01mg至约10mg氧化铁之间,
更优选0.1至10mg氧化铁之间,典型地0.1至1mg氧化铁之间。需要注射的磁小体的量实
质上取决于待治疗的肿瘤的体积、治疗期间要求的温度和注射方法。最大的肿瘤体积和最
高的肿瘤温度要求施用最大量的磁小体。此外,如果静脉(或从肿瘤位置的外部)施用磁小
体,可能比如果直接施用至肿瘤内或靠近肿瘤需要更多的磁小体链。
中可能比静脉注射或者比注射至位于皮肤表面的肿瘤中要求更慢的注射速度。更浓缩的磁
小体的链的混悬液的注射比较低浓度的磁小体的链的混悬液的注射要求更慢的注射速度。
注射速度优选介于0.1μl/分钟至1升/分钟之间,更优选介于1μl/分钟至100ml/分钟
之间,最优选1μl/分钟至10ml/分钟之间,其中所示的体积是施用的磁小体的链的混悬液
的体积。
磁赤铁矿)的量。在另一个实施方式中,磁小体的链和溶剂混合,溶剂稳定磁小体的链。可
以调整混悬液的pH和/或可以将阳离子和/或阴离子添加到含有磁小体的链的混悬液中
来稳定混悬液。
的磁小体的量施用至患者。
释的通过单次施用或通过若干次连续施用进行施用。一个热循环中的不同热治疗通过休息
时间彼此分开。休息时间可能等于1秒或1秒以上,优选等于1分钟或1分钟以上,更优选
等于10分钟或10分钟以上,优选等于(30分钟)或30分钟以上。
期间内,在一个很短的时间内(通常约一秒)进行治疗,用很短的休息时间(通常约一秒钟的
休息时间)分隔各治疗。治疗的重复次数取决于治疗的时间长短。优选治疗越长,需要的重
复越少,假设治疗的其它参数(比如施加的磁场的强度或频率)是不变的。
这些疗程可通过足够长的时间长短彼此分开。这种时间的长短可等于1天或1天以上,优
选等于15天或15天以上,更优选地等于1个月或1个月以上。
程”的数目。这些参数可能依赖于所靶向的肿瘤的特定性质,即例如取决于其大小、其对热
疗的耐受及其粘度。对于具有大体积和/或高温度耐受和/或高粘度的肿瘤,可考虑增加注
射的磁小体的量和/或施加的磁场的强度/频率和/或治疗的重复次数。在这种情况下,
也可考虑将细菌磁小体包囊在囊泡中来有助于热的产生。在一个实施方式中,调整热疗的
参数来优化待治疗的肿瘤的治疗的效率。
量将比单个肿瘤的更高。不提高磁小体的施用量,还可考虑治疗期间增加治疗时间的长短、
增加施加的磁场的强度(以达到更高的温度)或增加重复的治疗次数。
腺癌、乳腺癌(Kikumori等人,Breast Cancer Res.Treat.,2009,113,435-441)、脑癌
(Thiesen等人,Int.J.Hyperthermia,2008,24,467-474)以及皮肤癌(Ito等人,Cancer
Sci.,2003,94,308-313)。
限定的螯合剂)的生长培养基中。作为一个实例,生长培养基含有实施例1中所提及的成
分。在特异条件下,这些添加剂产生磁小体大小方面和/或在磁小体的链的长度方面的增
加。因此当它们暴露于交变磁场时,它们增强磁小体的链的加热能力。
选2至20μΜ过渡金属(如钴)溶液来进行。按照与Staniland等人所用方法的相同的方
法,这种溶液可以是例如加入至趋磁细菌标准生长培养基(如AMB-1种(ATCC 70027)的培
养基)中的奎尼酸钴溶液(S.Staniland等人,Nature Nanotech.2008,3,158-162)。在钴
(如奎尼酸钴)或另一种过渡金属存在时,甚至当钴掺加的百分比在2%以下时,合成的趋磁
细菌具有改进的磁性质(S.Staniland等人,Nature Nanotech.2008,3,158-162)。在以上
Staniland等人的研究中,对于全趋磁细菌而非提取自趋磁细菌的磁小体的链,观察到当
钴存在时磁性质的变化。以链的形式排列的且提取自趋磁细菌的Co掺加的磁小体的磁性
质的改善,导致改善的加热能力,是本发明的贡献。对于化学合成的纳米颗粒,为了观察到
磁性质的大的变化,大于约10%的Co掺加的百分比通常是必要的(A.Franco等人,J.Mag.
Mag.Mat,2008,320,709-713;R.Tackett等人,J.Mag.Mag Mat,2008,320,2755-2759)。这
表明,和未掺加的磁小体相比,甚至对于低百分比的钴掺加,Co掺加的磁小体可以具有改善
的加热能力。
过渡金属在趋磁细菌中的渗透。这种方法产生具有改善的加热性质的磁小体。
基中。
(乙二胺二(o-羟基-p-甲苯基)乙酸)、CaNa2-EDTA、EDTCA(乙二胺四乙酸加上十六烷基三
甲基溴化铵(Cetavlon),一种铵表面活性剂)、EDDA(乙二胺-N,N'-二乙酸)、EDDHA(乙二胺N,N'-双(2-羟基苯乙酸))、EGTA(乙二醇-双-(β-氨基-乙醚)N,N,N',N'-四-乙
酸)、HEDTA(N-(2-羟乙基)-乙二胺三乙酸)、HEEDTA(羟基-2-乙二胺三乙酸)、NTA(次氮
基三乙酸酯/盐)或酚酸。
或其衍生物;其中氨基醇官能团比如多巴胺、去铁酮、去铁胺(deferoxamine)、去铁胺
(desferrioxamine);其中氨基羧酸或酮官能团比如阿霉素、咖啡因、D-青霉胺、吡咯喹啉、HEIDA(羟基乙基亚氨基N,N二烯酸)。
三(亚甲基膦酸)、CEPA(2-羧乙基膦酸)、DMMP(甲基膦酸二甲酯)、DTPMP(二亚乙基三胺
五(亚甲基膦酸))、EDTMP(乙二胺四(亚甲基膦酸))、HEDP(1-羟基乙叉-1,1-二膦酸)、
HDTMP(己二胺四(亚甲基膦酸))、HPAA(2-羟基膦酰基羧酸)、PBTC(膦酰基丁烷-三羧
酸)、PMIDA(N-(膦酰基甲基)亚氨基二乙酸)、TDTMP(四亚甲基二胺四(亚甲基膦酸))、
ADP(腺苷二磷酸)或1-{12-[4-(二吡咯亚甲基二氟化硼)丁醇]氨基}十二酰-2-羟
基-sn-甘油-3-磷酸酯、一种L-α-磷脂酸的钠盐、一种1-棕榈酰-2-(二吡咯亚甲基二
氟化硼)十一酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸的钠盐)。
三膦酸、(氧次膦基三(亚甲基))三膦酸。1-羟基亚甲基-双-膦酸的实例包括阿仑膦酸
(福善美 )、帕米膦酸、唑来膦酸、利塞膦酸、奈立膦酸、伊班膦酸(邦罗力 )、米诺膦酸以及文献中所述的其它化合物(L.Wilder等人,J.Med.Chem.,2002,45,3721-3728;M.Neves,N.
Med.Biol.,2002,29,329-338;H.Shinoda 等 人,Calcif.Tissue Int.,1983,35,87-89;
M.A.Merrel,Eur.J.Phramacol.,2007,570,27-37)。对于0.4μΜ或4μΜ奈立膦酸、阿仑
膦酸和利塞膦酸引入细菌生长培养基中,此处观察到45nm以上的磁小体的百分比变得比
不存在双膦酸时合成的磁小体(的百分比)高。这些条件中合成的磁小体的链因此具有改善
的加热性质。
DMPS(二巯基丙烷磺酸盐或2,3-二巯基-1-丙磺酸钠)、磺酰罗丹明101、DMSA(二巯基琥
珀酸)。
将磁小体的链直接注射至肿瘤中将不可能。
所选的注射类型是静脉内时,经常是这种情况。靶向步骤的目的是使磁小体的链定位至肿
瘤细胞和/或肿瘤的环境中和/或肿瘤细胞和/或肿瘤中。
向类型称为磁靶向。
着正确的路径直到它们到达肿瘤位置。由于在靶向步骤期间其可能需要改变和调整施加的
磁场的特征,这种磁靶向的类型称为“活性”靶向。适合的MRI设备,在其中患者或磁场可
以在任何方向上定向,可用于靶向步骤。另一方面,磁铁可置于肿瘤位置之中或附近以便将
磁小体的链吸引至肿瘤和/或肿瘤环境中。在这种情况下,磁靶向将实质上是被动的(即实
质上要等待磁小体的链在肿瘤和/或肿瘤环境中积累)。
的,它特异性识别肿瘤细胞。这种靶向类型称为分子靶向。
得能够靶向特异性细胞,还有利于细胞内吸收和/或使得能够避免磁小体的链被巨噬细
胞识别(Allen等人,Trends in Pharmacological Sciences 1994,15,215-220;Blume
等 人,Biochim.Biophys.Acta 1990,1029,91-97;Gabizon等 人,Biochim.et Biophys.
Acta,1992,1103,94-100;Zhang等人,Biomaterials 2002,23,1553-1561)。
的链(包囊或不包囊于囊泡中)已达到目标位点,和/或验证磁小体的链在靶向肿瘤的路上,
和/或验证它们已被正确地清楚,和/或验证它们已经成功地施用。
效率和/或抗肿瘤活性。
Res.2009,15,5170-5177)。这种实施方式关注磁小体的链的检测。
小体的表面和/或表面附近和/或之中。这种荧光分子可以是罗丹明、钙黄绿素、荧光素、
溴化乙锭、绿色或黄色荧光蛋白、香豆素、青色素或这些所列分子的衍生物。
溶液存在时,培养趋磁细菌获得荧光磁小体。例如通过在约40μΜ至约400μΜ罗丹明溶
液存在时培养趋磁细菌可以获得荧光磁小体。
的激发/检测方案。例如,光学纤维可以刚好置于在皮肤表面附近的肿瘤的上面来激发修
饰的磁小体并收集它们发射的光。
修饰的磁小体的荧光。
过外科手段地打个孔,该孔为细菌磁小体离开肿瘤位置并到达有机体外提供了路径)。细菌
磁小体还可以从肿瘤位置去除并驱向要从身体中除去的其它器官比如肝。
的化疗或其它癌症治疗技术相比,其提供了一种改善。
(在这样的温度下,形成囊泡的脂质失去其双层结构)介于20℃和60℃之间。在肿瘤细胞中
或肿瘤中或肿瘤细胞的环境中或肿瘤的环境中,通过加热磁小体的链以及因此施加交变磁
场中的囊泡,来释放活性成分。
这种情况下,热疗用来破坏肿瘤的一部分(其在外科手术期间不可去除)和/或防止肿瘤在
外科手术之后再次生长。
种实施方式中,在这种腔中施用磁小体的链。
附图说明
链的TEM显微照片;(c)从链上脱离的个体磁小体的TEM显微照片;(d)化学合成的纳米颗
粒(SPION@Citrate)的TEM显微照片;(e)在磁小体的链(CM)以及个体磁小体(IM)的表
面,电荷的测量作为含有这两种类型细菌磁小体的混悬液pH的函数;(f)磁小体的链(CM)
以及个体磁小体(IM)的红外光谱。
脂糖凝胶中(凝胶)的细胞混悬液;(b)对于88mT的AMF幅,与在(a)中的相同;(c)在23mT(方形)或88mT(磁滞)下测量的全细菌的小磁滞回线(Minor hysteresis loops);(d)包含在水中、或凝胶中的趋磁细菌混悬液的特定吸收率(SAR),作为AMF幅的函数。根据包含
在凝胶中的趋磁细菌混悬液的小磁滞回线面积测量的磁滞损耗;(e)在23mT和88mT下测
量的完整细胞的SAR的柱条图。框代表由于磁滞损耗对所观察的温度提高的贡献。
为时间的函数。线分别表示混悬于水中(溶液)或在2%琼脂糖凝胶中(凝胶)的磁小体的链
的加热速度;(b)对于88mT的AMF幅,与在(a)中的相同;(c)在23mT(方形)和88mT(线)下的磁小体的链的小磁滞回线;(d)根据混悬于水中(混悬液)或凝胶中(凝胶)的磁小体的链的加热速度在22℃处的斜率测量的SAR,作为AMF幅的函数。根据包含在凝胶中(磁滞)
的磁小体的链的混悬液的小磁滞回线面积测量的磁滞损耗。(e):在23mT和88mT下测量的
磁小体的链的SAR的柱条图。框代表对分别由磁滞损耗和磁小体的链的旋转所导致的观察
到的温度提高的贡献。
磁小体的温度的提高作为时间的函数。线分别表示混悬于水中(混悬液)或在2%琼脂糖凝
胶中(凝胶)的个体磁小体的温度变化;(b)对于88mT的AMF幅,与在(a)中的相同。(c):
在23mT(方形)和88mT(线)下测量的个体磁小体的小磁滞回线,(d)根据包含于水中(混
悬液)或凝胶中(凝胶)的个体磁小体的加热速度在22℃处的斜率测量的SAR,作为AMF幅
的函数。根据包含在凝胶中(磁滞)的个体磁小体的小磁滞回线面积测量的磁滞损耗;(e):
在23mT和88mT下测量的个体磁小体的SAR的柱条图。框代表对分别由于磁滞损耗和个体
磁小体的旋转所观察到的温度提高的贡献。
以及磁小体链长度的分布(b)。(c):当这种混悬液暴露于频率183kHz和磁场强度43mT或
80mT的交变磁场时,含有406μg/ml磁赤铁矿的这种类型磁小体的混悬液随时间的温度变
化。(d-f)提取自趋磁细菌的磁小体的链的性质,其是在存在0.4μM EDTA时合成的。图表
显示这种类型磁小体的磁小体大小的分布(d),以及磁小体链长度的分布(e)。(f):当混悬液暴露于频率183kHz和磁场强度43mT或80mT的交变磁场时,含有浓度为406μg/ml磁赤
铁矿的这种类型磁小体的混悬液随时间的温度变化。
历频率183kHz和磁场强度43mT或80mT的交变磁场时,随时间的温度变化函数。(b)含有
未掺加和Co掺加的、以链的形式组织的磁小体的两种混悬液的随时间的温度变化函数。这
些混悬液的浓度是1.52mg/mL,并且它们暴露于频率183kHz和磁场强度80mT的交变磁场
中。
强度的函数。(b)-(d):当向这些混悬液施加B=20mT(b)、B=43mT(c)或B=60mT(d)交变磁场时,含有MDA-MB-231细胞(细胞是在不存在或存在各种浓度(0.125mg/mL
MDA-MB-231细胞的抑制百分比,作为这四种混悬液的磁赤铁矿的浓度的函数。(d)当上述
四种混悬液(0.125mg/mL
的AMF。将小鼠置于线圈内用于治疗。(b)显示加热的肿瘤和横跨肿瘤的位置的示意图,其
在红外测量温度期间进行记录。(c)-(f):用个体磁小体混悬液治疗的小鼠的研究(小鼠1
至4)。(c)当在治疗期间施加磁场时,肿瘤和直肠温度的变化。这些温度在不同的治疗的
小鼠之间取平均(小鼠1至3);(d)治疗开始后10分钟,对于显示出典型行为的小鼠,横跨
经治疗的肿瘤所测量的温度分布;(e)对于其中已注射有个体磁小体混悬液的肿瘤(小鼠1
至3),标准化的肿瘤体积的变化。肿瘤的体积通过治疗时的肿瘤体积进行标准化;(f)对于
其中仅注射有PBS的所谓的对照肿瘤,与在(e)中的相同。在小鼠4中,注射个体磁小体混
悬液但是不施加磁场。
或暗反差);(d)对(c)的区域的放大,显示磁小体聚集。
均(小鼠5至8);(b)治疗开始10后分钟,对于显示出典型行为的小鼠,横跨经治疗的肿瘤
所测量的温度分布;(c)对于其中已注射含有磁小体的链的混悬液的肿瘤,标准化的肿瘤
体积的演变(evolution)。治疗的肿瘤的体积通过治疗时的肿瘤体积进行标准化;(d)对于
其中仅注射有PBS的对照肿瘤,与在(c)中的相同。在小鼠9中,注射含有磁小体的链的混
悬液,但是不向小鼠施加磁场。
5中治疗后30天收集的肿瘤组织的显微照片显示存在细菌磁小体(蓝色或暗反差);(c)对
(b)的放大。(d)对(c)的放大,显示细胞的核被细菌磁小体所包围。
间。(b)、(d)、(f)、(h):对于标准磁小体的链(b)、磁小体-EDTA(d)、SPION@Citrate(f)、或SPION@PEG(h)治疗后期间,标准化的肿瘤体积的变化(即,治疗后2天至30天测量的肿
瘤体积除以治疗当天测量的肿瘤体积)。在(b)、(d)、(f)和(h)中,误差棒是通过考虑各小鼠标准化的肿瘤体积估计的标准偏差。
塞膦酸盐(e)、或存在4μM阿仑膦酸盐(f)时合成的趋磁细菌,显示磁小体链长度分布的图
表。当强度43mT或80mT的交变磁场施加于含有磁小体的链(不存在双膦酸(g)、存在4μM
利塞膦酸盐(h)、或存在4μM阿仑膦酸盐(i)时合成的)的混悬液时,温度的变化作为时间
的函数。
(b)治疗开始后10分钟,对于显示出典型行为的小鼠,横跨经治疗的肿瘤所测量的温度分
布;(c)对于其中已注射有SPION@Citrate的混悬液的肿瘤(小鼠10至13),标准化的肿瘤
体积的演变。经治疗的肿瘤的体积通过治疗时的肿瘤体积进行标准化;(d)对于其中仅注
射有PBS的对照肿瘤,与在(c)中的相同。在小鼠14中,注射SPION溶液,但是不向小鼠施
加磁场。
具体实施方式
取自趋磁细菌并通过加热和SDS处理从链上脱离,覆盖有柠檬酸离子的化学合成的超顺磁
氧化铁纳米颗粒(SPION@Citrate)或商业上可获得的覆盖有PEG分子的化学合成的纳米颗
粒(SPION@PEG)。SPION@PEG购自德国公司Micromod(产品名称: -D-spio,产品
编号:79-00-201)。
请一开始所列出的其它参考文献)和化学包被,其稳定纳米颗粒,但应该不产生任何抗肿瘤
活性。
7087s-7092s)。比较了磁小体的链与这两种标准(SPION@Citrate和SPION@PEG)在热疗中
的效率。
液体培养基中。一升中,这种生长培养基含有0.68g磷酸二氢钾、0.85g琥珀酸钠、0.57g酒
石酸钠、0.083g醋酸钠、225μl 0.2%刃天青、0.17g硝酸钠、0.04g L-抗坏血酸、2ml 10mM
的奎尼酸铁溶液、10ml Woolf维生素和5ml Woolf矿物质。通过将0.19g奎尼酸和0.29g
FeCl3·6H2O溶解于100毫升蒸馏水中制备奎尼酸铁溶液。Woolf矿物质的溶液包含在1L
0.5g次氮基三乙酸(NTA,C6H9NO6)、1.5g硫酸镁HEPTA(MgSO4.7H2O)、1g氯化钠、0.5g硫酸锰(MnSO4.H2O)、100mg七水合硫酸亚铁(FeSO4.7H2O)、100mg硝酸钴(CO(NO3)2.7H2O)、100mg氯化钙(CaCl2)、100mg七水硫酸锌(ZnSO4.7H2O)、10mg硫酸铜水合物(CuSO4.5H2O)、10mg十二水合硫酸铝钾(AIK(SO4).12H2O)、10mg硼酸(H3BO3)、10mg钼酸钠(Na2MoO4.2H2O)、2mg亚硒酸钠(Na2SeO3)、10mg二水合钨酸钠(Na2WO4.2H2O)和20mg氯化镍(NiCl2.6H2O)的蒸馏水
中。通过将2.2mg叶酸(维生素B9)、10.2mg吡哆醇(维生素B6)、5.2mg核黄素(维生素B2)、
2.2mg生物素(维生素H或B7)、5.2mg硫胺素(维生素B1)、5.2mg烟酸(维生素B3或PP)、
5.2mg泛酸(维生素B5)、0.4mg维生素B12、5.2mg氨基苯甲酸、5.2mg硫辛酸和900mg磷酸
钾溶解于1升蒸馏水中制备Woolf维生素溶液。使用5M的氢氧化钠溶液将生长培养基的
pH调整到6.85。在平台期如下所述收获细胞。如生长培养基的染色变化所指示的,从粉色
到无色,当培养基完全还原时发生平台期。
水中。对于全完整细胞的混悬液,这种样本不再进一步处理。图1(a)的TEM显微照片显
示一个典型的含有几条磁小体的链的AMB-1趋磁细菌。
也进行了测试,并能够从细菌中提取磁小体的链。对于60分钟以内的超声时间,并未裂解
所有的趋磁细菌,而对于180分钟以上的超声时间,由于个别聚集的磁小体的存在,开始观
察到聚集。
链用10mM Tris·HCl缓冲液(pH 7.4)以这种方式洗涤10次,并最终重悬于无菌去离子水
中。提取自全细菌的磁小体的链的典型的组装显示于图1(b)的TEM显微照片中。使用动
态光散射测量(NanoZetasizer,Malvern仪器Ltd.),测量的磁小体的链的表面电荷作为pH
的函数。在生理pH,图1(e)显示磁小体的链的表面电荷在-22mV下为负。使用Nicolet
380FT IR Thermo Electro进行红外测量。还记录磁小体的链的混悬液的红外线吸收光谱。
显示官能团羧酸、胺、酰胺、磷酸(P-O)产生的峰,揭示了磁小体的链的混悬液中蛋白质和
磷脂的存在。这一结果表明,包围磁小体的膜以及将磁小体结合在一起的丝存在于样本中
(D.Faivre等人,Chem.Rev.,2008,108,4875-4898)。
负责磁小体在各链中的排列的细胞骨架)来获得个体磁小体(即,不以链的形式组织的磁小
体)(D.Faivre,Chem.Rev.,2008,108,4875-4898)。如针对磁小体链所述的洗涤个体磁小体
并重悬于去离子水中。图1(c)的TEM显微照片显示一个典型的个体磁小体的组装。个体
磁小体具有不同于磁小体的链的性质。它们形成纳米颗粒的聚集的组装体(图1(c))。它
们具有强烈依赖于其聚集水平的表面电荷。当个体磁小体经超声并分散于水中时,在pH 7
时它们具有和磁小体的链相对相似的表面电荷。然而,当它们聚集时,个体磁小体具有正电
荷(在pH 7时10mV,图1(e))。个体磁小体被磷脂酸(在图1(f)的红外线吸收光谱中存
在的P-0峰)而非蛋白质(在图1(f)的红外线吸收光谱中没有酰胺)所包围,这表明包围磁
小体的生物材料尚未完全去除,但是已经充分变性,产生不以链的形式组织的个体磁小体。
-2 -1 -1 -1
度,对于Fe(DS)2和二甲胺分别为1.3×10 mol L 和8.5×10 mol L 。然后溶液在28.5℃
强烈搅拌2小时,通过离心从上清中分离出获得的未包被的纳米晶体的沉淀。在第二步骤
-2 -1
中,用酸性溶液(HNO3,10 mol.L )洗涤沉淀,直至到达溶液pH=2。溶解于水中的柠檬酸钠
-2 -1
([Na3C6O7H5]=1.5×10 molL )用于包被纳米颗粒。溶液在90℃时经历2小时超声以及
加入诱导纳米晶体沉淀的丙酮。用大量过量丙酮洗涤之后,在空气中干燥沉淀。用柠檬酸
-1 -1
离子包被的纳米晶体最后分散在水中。通过加入氢氧化钠NaOH(10 mol.L )溶液,pH从
起始时~2,逐步上升到7.4。SPION@Citrate由磁赤铁矿组成,并具有~10nm的平均大小。
SPION@Citrate的TEM显微照片显示于图1(d)中。
magnetization)、约20nm的大小、20%以内的多分散性,以及它们在对于pH>4的水缓冲液中
是稳定的。
用于进行高频高幅AMF(交变磁场)过热的磁场参数范围内(Ivkov等人,Clin.Cancer
Res.,2005,11,7093s-7103s;De Nardo等人,Clin.Cancer Res.,2005,11,7087s-7092s;
De Nardo等人,The J.Nucl.Med.,2007,48,437-444)。对于AMF过热,推荐磁场频率
介于50kHz和1MHz之间,而磁场幅需要保持在100mT以下(Mornet等人,J.Mater.
Chem.,2004,14,2161-2175)。我们比较三种不同类型的磁小体排布的产热性质
(Alphandéry 等 人,J.Phys.Chem.C,2008,112,12304-12309;Alphandéry 等 人,ACS
Nano,2009,3,1539-1547):1)包含在完整AMB-1趋磁细菌中的磁小体链;2)提取自保留其
磁小体膜的细菌的磁小体的链;以及3)个体磁小体晶体,其磁小体膜大多已被去除。
Mag.,1998,34,3745-3754)。为了确定这些机制中的哪个负责上述三种不同类型磁小体排
布的热产生,我们比较样本在水中的加热速度,在水中细胞和磁小体的旋转是可能的,出现
在凝胶中的那些,旋转被抑制。以这种方式,可以确定由细菌或磁小体的旋转产生的热的
量,以及磁滞损耗产生的热的量。为了验证凝胶中产生的热是由于磁滞损耗,我们使用磁测
量独立测量了磁滞损耗。
验样本。五微升含有按重量计2×10 %磁小体的溶液沉积在碳包被的铜网上,检验之前使
网干燥。相同相对量的磁小体用于制备所有样本,从而特定样本中的聚集不是由于磁小体
浓度上的差异造成的。
于磁测量,含有按重量计2.10 %磁小体的趋磁细菌细胞、磁小体的链或个体磁小体
的25微升液体混悬液,沉积在硅基底顶上。然后样品以平行于磁场的方向放置在由
硬明胶制成的囊内。进行三种类型的磁测量,饱和等温剩磁(saturating isothermal
remanent magnetization)(SIRM)以及主(major)或小(minor)磁滞回线的那些。按照
和前述相似方法,SIRM测量用于确定磁小体的组成(Alphandéry等人,J.Phys.Chem.C,
2008,112,12304-12309)并显示磁小体中的磁铁矿已几乎完全氧化成磁赤铁矿。这一结果
并不令人意外,因为我们的磁性材料的混悬液不是新鲜配制的,并且磁小体中的磁铁矿已
知随着时间被氧化成磁赤铁矿(Chen等人,Earth Planet.Sci.Lett,2005,240,790-802)。
磁赤铁矿和磁铁矿在室温下具有非常相似的磁性质(Alphandéry等人,J.Phys.Chem.
C,2008,112,12304-12309)。磁小体的磁铁矿转化为磁赤铁矿的事实并没有本质上改变这
种模式得出的结论,因为磁赤铁矿和磁铁矿在室温具有非常相似的磁性质(Alphandéry等
人,J.Phys.Chem.C,2008,112,12304-12309)。在300K下进行主磁滞回线测量以便确定包
含在样品中的磁赤铁矿的量。通过样本的饱和磁化强度除以磁赤铁矿的饱和磁化强度来确
定后者。对于磁小体晶体那么大的纳米颗粒,饱和磁化强度是整批材料(bulk material)
的饱和磁化强度(整批磁赤铁矿的情况下)。最后,还通过作为连续磁场的函数记录样本的
磁化强度进行小磁滞回线的测量,在-H0和H0之间施加磁场,其中H0是23mT、36mT、66mT或
88mT。
-1 -1
是457μgml ,对于含有磁小体的链的液体混悬液为435μg ml 以及对于含有个体磁小
-1
体的液体混悬液为380μg ml 。这三种混悬液的各250μl倾入聚丙烯管内,并放置在产
生108kHz频率的振荡磁场的线圈中心,场幅被固定在23mT、36mT、66mT或88mT。为了产生
交变电流,将线圈连接到发电机上(Celes inductor C97104),使用光学纤维探针(Luxtron STF-2,BFi OPTiLAS SAS)测量温度。
小,通常~0.02%。含有完整的M.magneticum全细胞的水混悬液经受频率ν=108kHz和场幅
H0=23mT和H0=88mT的振荡磁场。当磁场强度从23mT的提高到88mT时,混悬于液体中的细
胞加热速度提高(图2(a)和图2(b))。根据22℃下测量的温度随时间的变化斜率(ΔΤ/
δΤ),我们使用如下等式1来估计混悬于液体中的完整细胞的SAR(Mornet等人,J.Mater.
Chem.,2004,14,2161-2175;Hergt等人,J.Magn.Magn.Matter.,2005,293,80-86):
从108±32W/gFe增加至864±130/W/gFe。为了确定全趋磁细菌产生的热的量(SAR)是否
来自全细菌的旋转、来自磁滞损耗或来自这两种机制,我们测量全完整细胞的小磁滞回线
的面积(图2(c)),其提供全细胞磁滞损耗的估计。使用Hergt等人的方法(Hergt等人,
J.Magn.Magn.Matter.,2005,293,80-86)我们从图2(c)显示的小磁滞回线的面积推导出
完整细胞的磁滞损耗从23mT时的54±25W/gFe增加至88mT时的810±121W/gFe。这些SAR
值与混悬液中的细菌细胞测量的那些相似(图(2d))。出乎意料地,固定在琼脂糖凝胶中的
细胞所确定的SAR,显著小于小磁滞回线的面积并且似乎并没有提供良好的磁滞损耗的估
计(图2(d))。这可能是由于制备凝胶期间一些细菌细胞的损失导致比其它样品中更低浓
度的磁小体。从这些结果中,我们推导完整的细菌细胞的旋转不利于在这种情况下热的生
产。由于大的重量和体积,M.magneticum的完整细胞不能够在施加外部磁场下充分旋转来
产热。通过对由于细菌细胞旋转的SAR的估计,SARrot,可以证实缺少旋转的贡献。使用以
下等式(2)估计后者(Hergt等人,IEEE Trans.Mag.1998,34,3745-3754)。
性能和热能之间的比,Ea/KbT~480(Alphandéry等人,ACS Nano 2009,3,1539-1547),我们
发现,τn~3.1038sec.并且因此τb/τn<<1。这证实了使用(2)测量SAR。在等式(2)中,
ω=2πf,其中f=108kHz是振荡磁场的频率,Ms是磁赤铁矿的饱和磁化强度(MS=390emu/
cm3),H0是施加的磁场的幅(23mT
重,Kb~1.3810-23J/K是波尔兹曼常数以及τb~10sec是完整细菌细胞在水中的布朗弛豫时
间。使用公式τb=3ηVh/KbT估计布朗弛豫时间,其中Vh是流体动力学体积。对于全趋磁
细菌,我们认为Vh=4/3πr3,其中r是细菌典型长度的一半(1.5μm)。使用这些值,我们发
现,SARrot介于5.10-2W/gFe和7.10-1W/gFe之间,对于H0值在23至88mT之间。这些值比由
于磁滞损耗测量的SAR小得多,其是23mT时的~82±58W/gFe以及88mT时的~841±153W/
gFe(图2(d)),这些值是根据溶液中加热速度推导的SAR与根据小磁滞回线的测量推导
的(SAR)之间的平均值。因此全细菌细胞的旋转似乎无助于观测到的温度的上升。如
图2(d)所示,SAR似乎完全是由于磁滞损耗。这些损耗在更高的磁场幅时(88mT时
SAR~841±153W/gFe)变得比在23mT时(SAR~82±58W/gFe)更显著。随着磁场幅的增加而
增加的磁滞损耗的这一发现,之前已经在化学合成的磁铁矿纳米颗粒中观察到(Hergt等
人,IEEE Trans.Mag.,1998,34,3745-3754)。混悬液中全细胞的SAR每周期,其定义为SAR
除以振荡磁场频率,介于0.7±0.5J/kgFe和7.8±1.4J/kgFe之间。这些值比大多化学合
成的磁性纳米颗粒获得的那些值高,对于广范围的磁性纳米颗粒大小和组成以及对于大的
磁场频率和幅的选择,其典型地介于0.001J/kgFe和1.2J/kgFe之间(Dutz等人,J.Magn.
Magn.Mater.,2007,308,305-312;Ma 等 人,J.Magn.Magn.Mater.,2004,268,33-39;
Jordan 等 人,J.Nano.Res.,2003,5,597-600;Brusentsov 等 人,J.Magn.Magn.
Mater.,2001,225,113-117;Chan 等 人,Scientific and clinical applications of
magnetic carriers, 等人,(编辑),Plenum Pres,NY,1997,607-618)。我们得出这样
的结论,在我们的实验条件下全趋磁细菌的混悬液比大多化学合成的磁性纳米颗粒产生更
大量的热。
1(b)显示了典型的磁小体的链的组装(Alphandéry等人,ACS Nano,2009,3,1539-1547;
Alphandéry等人,J.Phys.Chem.C,2008,112,12304-12309),其不聚集成团块,但是彼此作
为链足够接近以至于磁性地相互作用。对于磁场幅23mT和88mT,磁小体的链的热产生速度
分别显示于图3(a)和3(b)中。在溶液中,它们特征在于在23mT时在1500sec.的时间段
~43℃的增加(图3(a))以及在88mT时在相同的时间段~48℃的增加(图3(b))。这些加热
速度比用全细胞获得的那些高约2至约10倍之间(图2(a)、2(b)、4(a)和4(b))。这表明磁小体的链产生比完整细菌细胞产生更大的磁滞损耗,或表明它们在振荡磁中旋转有助
于热产生或两者都有。为了辨别,如果有的话,这些解释中的哪个负责更大的热产生速度,
确定了磁小体的链的磁滞损耗。图3(c)显示链在23mT和88mT时的小磁滞回线。磁小体
的链的小磁滞回线的面积小于完整细菌细胞获得的那些(图2(c))。这种降低可能是由于磁
小体的链之间的磁相互作用(Alphandéry等人,J.Phys.Chem.C,2008,112,12304-12309),
并且因此我们得出这样的结论与混悬于液体中的完整细菌细胞相比,观察到的磁小体的链
的更高的热产生速度,不是由于磁滞损耗的增加而是由于链的旋转。旋转对磁小体的链
的热产生的贡献可以进一步通过估计混悬于液体中的磁小体的链的SAR来证实。使用等
式(1)以及对于混悬于中磁小体的链的ΔΤ/δΤ值(图3(a)和图3(b)),我们发现,
SAR从23mT时的~864±86W/gFe增加至88mT时的~1242±124W/gFe(图3(d))。这些SAR
值大于推导自凝胶中磁小体的链的SAR(SAR在23mT时的~54±22W/gFe以及88mT时的
SAR~487±97W/gFe)或推导自小磁滞回线面积(SAR在23mT时的~108±41W/gFe以及88mT时
的SAR~486±97W/gFe)的磁滞损耗。为了证实旋转对磁小体的链的产热机制的贡献,我们使
用等式2确定SARrot,其为布朗弛豫时间中的因素。这一公式,仅在饱和区域下适用,其中
SAR显示强烈依赖场幅(Hergt等人,IEEE Trans.Mag.,1998,34,3745-3754)。由于~36mT
-4
以上发生饱和(图3(d)),我们只测量23mT时的SAR。使用布朗弛豫时间τB~1.210 sec,
我们发现在23mT时SARrot~3600W/gFe大于我们通过测量混悬于液体中的磁小体链的SAR
(864±86W/gFe)与由于磁滞损耗的SAR(90±59W/gFe)之间的差异所实验测量的774±145W/
gFe的SAR。理论预测和实验观察之间的差异可解释为磁小体的链的部分聚集。我们得出
这样的结论,旋转有助于磁小体的链的加热机制以及这种贡献从23mT时的90±10%的SAR
降低至88mT时的相同SAR的40±10%(图3(c))。这种降低可以解释为,随着磁滞损耗的
磁场幅的增加,比由磁小体的链在磁场中旋转造成的SAR的增强更强的增强(Hergt等人,
IEEE Trans.Mag.1998,34,3745-3754)。
(c)中。这些纳米晶体与个体纳米晶体的紧密组装体相互作用和组织(Alphandéry等人,
ACSNano.,2009,3,1539-1547、Alphandéry等人,J.Phys.Chem.C,2008,112,12304-12309;
Kobayashi等人,Earth Planet.Sci.Lett,2006,245,538-555),不像图1(b)中显示的有膜
的磁小体。对于23mT和88mT的磁场幅,含有这些个体磁小体的液体混悬液的加热速度显
示于图4(a)和4(b)中。它们比在23mT和88mT时混悬于液体中的磁小体的链观察到的
那些低(图3(a)、3(b)、4(a)和4(b))。磁小体的链与个体磁小体之间观察到的溶液加热速度的差异可以是由于磁小体旋转的贡献的差异或对SAR的磁滞损耗或者两者的组合。
根据小磁滞回线的面积估计磁滞损耗(图4(c))产生SAR值介于23mT时的270±100W/gFe
与88mT时的427±85W/gFe,或根据凝胶中个体磁小体的加热速度估计磁滞损耗(图4(a)和
4(b))产生SAR值介于23mT时的135±70W/gFe与88mT时的432±86W/gFe。上述两种方法
估计的磁滞损耗(图4(d))与对于磁小体的链估计的那些相似(图3(d))。因此,磁小体的链与混悬于液体中的个体磁小体之间观察到的SAR中的差异必然由结构在磁场中旋转的
能力差异所导致。等式2预测由于混悬于液体中的个体磁小体的旋转的SAR应当与磁小体
的链推导的相同,在23mT时SARrot~3600W/gFe。因此,个体磁小体观察到的更低的加热速度
最可能是由于个体磁小体比磁小体的链更易于聚集成团块的事实。使用电子显微镜,个体
磁小体的聚集是清晰明显的(图1(c)),并且还可以在液体混悬液中视觉观察到。这阻止这
些磁小体旋转,就像磁小体的链一样容易。
的链和个体磁小体具有相似的磁滞损耗,假定它们都是体内热治疗的等价的良好候选者。
合剂比如双膦酸盐分子、多巴胺、罗丹明、EDTA或过渡金属比如钴。
酸(阿仑膦酸盐、利塞膦酸盐或奈立膦酸盐)、4μM、20μM或400μM的罗丹明溶液、0.4μM
或4μM的EDTA溶液、0.4μM、4μM或40μM多巴胺溶液、2μM或20μM奎尼钴溶液。1ml
趋磁细菌的混悬液加入到一升上述生长培养基中,并且细菌生长10天。生长10天后,按照
和实施例1中描述的相同操作收集细菌并从细菌中提取细菌磁小体的链。然后五微升含有
-4
按重量计2×10 %磁小体的细菌磁小体的链的混悬液沉积在碳网上,用于透射电子显微镜
(TEM)分析。TEM用于确定磁小体的大小和估计链的长度。以便评价各种类型提取的磁小
体的链的加热性质,后者混合于水中。不同混悬液的浓度估计为每毫升磁赤铁矿的量。对
于含有在几种双膦酸存在时合成的磁小体的混悬液,它们是0.3mg/mL,对于含有Co掺加的
磁小体的混悬液是1.52mg/mL,以及对于含有在EDTA、罗丹明、多巴胺或阿仑膦酸盐存在时
合成的磁小体的混悬液,是0.406mg/mL。施加频率183kHz和强度43mT或80mT的交变磁场
下,加热混悬液。使用热电偶微探针(IT-18,Physitemp,Clifton,USA)测量这些混悬液的
温度变化。
体的链(CM-EDTA)的性质。呈现了CM-EDTA的结果,因为它们导致了最重要的磁小体性质
的变化,即和CM-对照相比,磁小体大小、磁小体链长度和加热效率的最大提高。
小体的百分比高于CM-对照的(图5(a))。此外,磁小体大小分布的吻合(fit)表明大的磁
小体的大小从CM-对照的~42nm(图5(a))提高至CM-EDTA的~60nm(图5(d))。我们
还观察到小的磁小体(<30nm)的百分比对于CM-对照是显著的(>25%,图5(a))而对于
CM-EDTA是低的(<10%,图5(d))。如通过比较图5(b)和5(e)中所呈现的图表可以观
察到的,平均磁小体链长度还从CM-对照的~150nm(图5(b))提高至CM-EDTA的~300nm
(图5(e))。长的磁小体的链(长度>800nm)仅对于CM-EDTA出现(图5(e))。当向含有
CM-EDTA的混悬液施加交变磁场时,对于CM-EDTA其产生温度上的提高比CM-对照的大,对
于两者磁场强度均为43mT和80mT(图5(c)及5(f))。此外,CM-EDTA的饱和温度(43mT
时35℃以及80mT时45℃,图5(f))均比CM-对照获得的那些高(43mT时28℃以及80mT
时35℃,图5(c))。这些特征揭示,与CM-对照比较,CM-EDTA加热能力更高,其可以归因
于磁小体大小和/或磁小体链长度的增加。
合剂(4μM罗丹明B、4μM多巴胺、4μM阿伦磷酸盐)存在时培养的细菌的磁小体的链,在
施加强度43mT或80mT的交变磁场下,比CM-对照温度提高得更快。
17(c))。对于在双膦酸存在时合成磁小体(图17(e)和17(f)),具有长度在400nm以上
的链的百分比也比没有双膦酸时合成的(图17(d))那些更高。由于这些行为,对于在4μM
利塞磷酸盐(图17(h))或4μM阿伦磷酸盐(图17(i))存在时合成的磁小体,由施加磁
场诱导的温度的变化比没有双膦酸存在时合成的磁小体的那些(图17(g))大。对于40mT
和80mT强度的磁场均观察到这种行为。对于引入至生长培养基的具有0.4μM浓度的双膦
酸,与对于4μM浓度获得的那些,观察到相似的结果。相反,对于引入至细菌生长培养基的
40μM的双膦酸浓度,细菌磁小体的链的性质没有显著区别于在标准条件中合成的细菌磁
小体的链的性质。这些结果表明,到达最佳加热效率必要的双膦酸浓度介于0.1和40μM
之间,尤其0.1和10μM之间,典型地在0.4和4μM之间。还测试了第三个双膦酸(奈立膦
酸),并产生与阿仑膦酸或利塞膦酸获得的那些相似的结果。
磁小体的链经受43mT的交变磁场时,混悬液的温度在30分钟内升高3度。对于没有罗丹
明存在时合成的磁小体的链,在相同实验条件下观察到仅一度的温度升高。这表明,在生长
培养基中存在罗丹明改善磁小体的链的加热能力。
Spectroscopy,EELS)测量来检测一些磁小体中钴的存在。这一结果与Staniland等人的
一致(S.Staniland等人,Nature Nanotech.,2008,3,158-162),其还显示对于在相似条
件下合成的趋磁细菌,磁小体中钴的存在。如图6(b)中所示,当含有Co掺加的磁小体
(CγFe203=1.52mg/mL)的混悬液暴露于强度80mT和频率183kHz的交变磁场中,混悬液的温
度比含有CM-对照的提高更多。由于磁小体大小和磁小体链长度显示出与未掺加和Co掺
加的磁小体极为相似,Co掺加的磁小体的增强的加热效率可以解释为它们磁晶各向异性的
增加。
养于这些条件时磁小体大小和/或磁小体链长度的增加。
钴的磁小体的磁晶各向异性的增加。
在所诱导的毒性风险打开了道路。
氨酰胺、1mM丙酮酸钠、50U/ml链霉素(均购自Life Technologies Inc.)。所有体外实验在
37℃时在5%二氧化碳孵化器中进行。
基-2-基)-2,5-二苯基四氮唑(购自Sigma,St Louis,MO,USA)还原为紫色甲臜晶体的能
4
力。将细胞以每孔210 个细胞的密度接种于96-孔平底板(Falcon,Strasbourg,France)
并在培养基中孵育24小时。然后,去除培养基,并替换为含有具有不同磁赤铁矿浓度
(0.125mg/mL
(PBS来自Life Technologies)洗涤细胞并用0.1mLMTT(2mg/mL)在37℃时孵育额外4小
时。然后通过加入100μl DMSO(Sigma-Aldrich)溶解不溶性产物(基本上由甲臜组成)。
使用Labsustem MultiScan MS酶标仪在570nm处测量溶解的甲臜的吸光度。提供了有功
能的线粒体数目的评估,其是一种与活细胞数目成正比的数字。抑制百分比然后估计为死
细胞(即凋亡中的细胞)的数目除以总细胞数目。
在)孵育细胞24小时、48小时或72小时。孵育时间结束时,细胞暴露于(对于对照不暴露
于)频率183kHz和强度20mT、43mT或60mT的交变磁场中。该处理进行一次或两次20分
钟。处理后,用PBS洗涤细胞两次。然后,为了收获细胞,250μl胰蛋白酶-EDTA加入到粘
附的细胞中。750μl液体培养基加入到收获的细胞中对混悬液进行匀浆。然后在700G下
将混悬液离心3分钟,去除上清,将细胞重悬于1mL PBS中。为了评价活细胞百分比,5μl
碘化丙啶(PI)(1mg/mL混合于乙醇中,Sigma Aldrich)加入至细胞混悬液中。由于PI仅
穿透至死细胞中,测量它的荧光提供死细胞百分比的估计。根据这种估计,我们可以推导活
细胞的百分比。为了测量PI的荧光,在流式细胞仪(Beckton Dickinson FACSCalibur 3C)
中分析细胞,流式细胞仪含有488nm处发射的氩激光以及能够检测激光激发的PI荧光的检
测器FL3-H。测量每样本上万个细胞来确定活细胞的百分比。
过施加磁场来处理。用热电偶微探针(IT-18,Physitemp,Clifton,USA)测量温度,探针宏
观地测量温度(即细胞混悬液作为一个整体的温度,而非各个体细胞中的温度)。
钟。孵育期间,施加频率183kHz和磁场强度43mT的交变磁场。处理后,通过将0.6mT的强
磁铁放置于接近混悬液中细胞来收集磁性细胞。去除含有非磁性细胞的上清,而被磁铁吸
引的细胞重悬于1mL PBS中。然后使用流式细胞仪估计磁性细胞的百分比。
不同强度,活细胞的百分比是高的(>80%),表明毒性低。这可以解释为这样的事实,刚治疗
后细胞没有达到凋亡的状态。对于在各种量的磁小体的链存在时孵育几分钟的细胞,混悬
液的温度变化(其是由于交变磁场的施加)对于磁场强度20mT(图7(b))、43mT(图7(c))和60mT(图7(d))分别显示于图7(b)、7(c)和7(d)中。如图7(b)所示,20mT的磁
场强度过低以至于不能引起温度升高。相反,图7(d)显示60mT的磁场强度诱导温度上大
的升高。甚至对于没有磁小体的链存在时孵育的细胞,也发生后者的情况,表明它产生自傅
科电流。43mT的磁场强度是提供可接受的行为的强度,即不存在磁小体的链时没有温度变
化以及温度的升高,其中温度随着孵育的磁小体的链的量的增加而增加(图7(c))。
(a))、48小时(D2,图8(b))或72小时(D3,图8(c)和8(d))。进行一次(图8(a)至8(c))或两次(图8(d))热诱导的处理。没有磁场时,对于孵育48小时或72小时的1mg磁
小体的链,磁小体的链的存在是有毒的(50%以下的活细胞)。对于所有其它测试条件,磁小
体的链的存在表现出低毒性(50%以上的活细胞)。存在磁场时,图8(a)至8(c)显示对
于43mT或以上的磁场以及对于0.5mg以上的孵育的磁小体的量,活细胞的百分比显著降
低。图8(d)显示通过重复两次治疗,有可能改善治疗的效率,其中通过使用少量磁小体破
坏高百分比的活细胞来限定治疗的效率。事实上,对于进行两次的治疗,和用0.5mg进行一
次治疗相比(B=43mT)(图8(c)),对于所用的0.25mg磁小体的链达到20%的活细胞百分比
(B=43mT)(图8(d))。
制百分比。在所有的测试条件下,对于磁小体的链存在时孵育的MDA-MB-31细胞,细胞的抑
制百分比所有其它类型纳米颗粒(个体磁小体、SPION@Citrate和SPION@PEG)存在时孵育
的那些更大。针对所用的0.125mg的最少的磁小体的链的量以及对于进行一次以上的治疗
(图9(a)和图9(c)),获得治疗的最佳条件(即磁场存在时产生高百分比的抑制,而没有磁场时产生低百分比的抑制的那些条件)。
Citrate存在时孵育的细胞,磁性细胞的百分比是高的。其介于40%和90%之间,这取决于
交变磁场施加多久(图9(d))。图9(d)还显示MDA-MD-231细胞中个体磁小体的内在化百
分比是低的(<20%)。这可解释为个体磁小体聚集的倾向性,其阻止它们穿透到细胞中。图
9(d)中所示,SPION@PEG具有极低的MDA-MD-231细胞中内在化百分比,这表明施加交变磁
场后磁性纳米颗粒在真核细胞中的内在化百分比强烈取决于所用纳米颗粒的类型。
体的链更均匀的加热或这两个性质的组合。
行。
磷酸盐缓冲液(PBS)中的大约两百万个MDA MB 231人乳腺癌细胞然后用注射器(26G针)
2
皮下注射至小鼠的左和右两侧。使用卡钳每3天测量肿瘤大小。然后使用公式V=A×B/2
估计肿瘤体积,其中A是长的肿瘤横向直径,B是短的肿瘤横向直径(Sun等人,Cancer
3
Lett.,2007,258,109-117)。肿瘤生长为期21天,直到它们达到约100mm 的体积。
最有可能是由于麻醉剂量的高估。尸体剖检后,这些小鼠的器官没有显示明显的系统性充
血或梗死。麻醉下,含有分散至无菌水中的化学合成的纳米颗粒或各种类型的细菌磁小体
的注射器的针纵向插入到小鼠的肿瘤中。然后将小鼠置于直径6.7cm的线圈内,其中向它
们施加交变磁场。为了产生交变磁场,使用来自Ambrell,Soultz,France的10kW EasyHeat
能源供应在线圈内产生交变电流。图10(a)的示意图显示用于进行实验的实验设置。使
用可植入的热电偶微探针(IT-18,Physitemp,Clifton,USA)进行温度的测量来获得直肠温
度或肿瘤中心部分中的温度的局部估计。监测直肠温度的变化来证实肿瘤温度的升高是局
部的,不发生在小鼠的整个体内。红外照相机(Moblr2,Optophase,Lyon,France)用于获得
更全面的肿瘤和肿瘤环境的温度变化的图。在图10(b)的示意图中通过线来表示穿过横截
面测量的温度。第一治疗后的30天期间,测量未加热的和加热的肿瘤的肿瘤大小的变化。
体的链(小鼠5至8中混悬液2)、SPION(小鼠10至13中混悬液3)以及全趋磁细菌(小鼠
15至16中混悬液4)的100微升混悬液施用至位于小鼠右肋侧的肿瘤中。注射不同混悬液
后,小鼠经受频率183kHz和磁场强度~43mT(小鼠1、2、3、5、6、7、8、10、11、12、13)或~80mT(小鼠15和16)的交变磁场,持续20分钟。以3天的间隔重复3次治疗。对于接受磁小体
的链的混悬液的小鼠,磁场要降低~5mT以避免肿瘤内的温度超过50℃。对于接受全细菌的
小鼠,磁场要提高至~80mT来观察肿瘤内的温度提高。第五组被认为是对照组,并不经受交
变磁场的施加。这组由这样的小鼠组成,其中在位于它们右肋侧的肿瘤内接受100μl生理
盐水(小鼠17和18)、100μl混悬液1(小鼠4、19和20)、100μl混悬液2(小鼠9、21和
22)、100μl混悬液3(小鼠14、23和24)以及100μl混悬液4(小鼠25、26、27)。最后位
于各小鼠左肋侧的27个肿瘤用作内对照,并仅接受生理盐水。
悬液2为20mg ml )从而它们在水中产生相似的加热性质。这些浓度代表包含在一毫升水
中磁赤铁矿的量。它们以三种不同的方式进行估计,通过在480nm处测量不同混悬液的吸
光度、通过冻干后称量纳米颗粒或磁小体的量或通过使用SQUID磁强计测量(Alphandéry
等人,J.Phys.Chem.C,2008,112,12304-12309)来测量沉积在基底顶上的20μl各混悬液
的饱和磁化强度。这三种不同类型的测量产生对含有个体磁小体和SPION的混悬液浓度相
同的估计。对于含有磁小体的链的混悬液,包围细菌磁小体的生物材料的存在导致通过吸
光度和冻干对磁赤铁矿浓度的高估。因此使用SQUID测量确定这些混悬液的浓度。对于用
8
全趋磁细菌的治疗,注射的细菌浓度为100μl中10 个细胞。
对切片进行染色来检测染成蓝色的细菌磁小体的存在。在位于小鼠右侧肋的肿瘤病理切片
中评价赘生细胞的坏死、在非坏死区域中400×放大时每3个随机选择的视野有丝分裂的
数目以及色素细胞的量。
0.6mT的磁场时,进一步在各种磁小体的混悬液存在时将细胞处理1至24小时。使用两毫升
的两种磁小体的混悬液,其中含有混合于细胞生长培养基中的个体磁小体或磁小体的链。
以避免过高的细胞的细胞毒性,两种磁小体混悬液的氧化铁浓度保持在较低水平~130μg.
-1
ml 。治疗后,用PBS洗涤细胞以去除包围细胞的细菌磁小体。然后细胞用5%多聚甲醛进
行固定,并在溶液存在时孵育,在铁存在时在普鲁士蓝(Prussian blue)中变得有颜色。这
种溶液含有5%亚铁氰化钾和10%盐酸盐(等量)。然后使用空气物镜(×100)观察细胞。调
整物镜的聚焦来检测细胞内而不是在细胞表面铁的存在。
在肿瘤中的蔓延是~0.5cm,其中这个距离是通过测量图10(d)所示的温度分布的半高全
宽估计的。治疗的肿瘤的大小的演变显示于图10(e)。治疗随后的30天期间,这些大小
在小鼠1至3中增加,表明没有抗肿瘤活性。还可以在小鼠3中通过检查一套三张的照片
观察到治疗的肿瘤大小的增加,照片是在治疗当天(D0)、治疗后14天(D14)和治疗后30天
(D30)拍的(图11(a))。在这些小鼠中没有抗肿瘤活性进一步通过不接受个体磁小体的肿
瘤的行为得以证实(图10(f))。这些肿瘤的大小以与经治疗的肿瘤的速度相似的速度增长
(图10(e)和10(f))。当不施加磁场注射混悬液1时(在小鼠4和两只其它小鼠中),肿瘤
大小也增加(图10(f))。这些结果共同表明既不是个体磁小体的存在也不是磁场存在时产
生的热产生抗肿瘤活性。
疗后30天肿瘤中收集的大量坏死细胞。有丝分裂很多,并表示每所选视野(大小为300μm)
平均12个有丝分裂的重要肿瘤扩增活性。获自右肿瘤的病理切片的普鲁士蓝(Berlin
Blue)染色显示出现扩散的暗点(图11(b))。假设这些点来自放大图(图11(c)和11(d))所示的磁小体的聚集。器官的组织学分析显示肝、肾和肺中没有发现个体磁小体。这些器
官中不出现个体磁小体表明它们在注射后30天仍然位于肿瘤内,可能是因为它们倾向于
聚集。
胞孵育24小时后,不存在和存在磁场时都没有观察到更多的个体磁小体的迹象。这表明,
个体磁小体不易于穿透肿瘤细胞。当它们的确穿透时,它们也不长时间维持在这些细胞内。
43℃(图12(a))。此外,红外图像显示穿过肿瘤横截面更大的温度蔓延。图12(b)显示对
于磁小体的链,温度分布的半高全宽是0.75cm,表明比个体磁小体更均匀的肿瘤内温度分
布。和个体磁小体观察到的行为相反,在这种情况下抗肿瘤活性是明确的。图12(c)显示
经治疗的肿瘤的大小没有像在未治疗的肿瘤中所观察到的明显增加(图12(d))。在小鼠5
中治疗的肿瘤完全消失,并且在小鼠6中非常显著的大小的减小(图12(c))。通过检查在
治疗当天(D0)、治疗后14天(D14)和治疗后30天(D30)拍的一套三张的照片(图13(a)),可以看到小鼠5中经治疗的肿瘤的消失。此外,组织学检查显示在小鼠5中没有肿瘤组织
2
的残留。经治疗的肿瘤的病理学检查显示观察到的有丝分裂的数目是低的(所选300μm 的
视野平均4个)表明肿瘤扩增的活性的降低。在小鼠9中以及两个其它小鼠中,当注射磁小
体的链的混悬液而不施加磁场时,第一次治疗后的30天内肿瘤大小显著增加(图12(d))。
这表明抗肿瘤活性是由于当它们暴露于交变磁场时磁小体的链所释放的热。肿瘤组织的显
微照片显示,和个体磁小体相比,磁小体的链的更均匀的分布(图11(d)和13(b))。此外,图13(b)的放大,其显示于图13(c)和13(d)中,显示细胞核周围黑色的区域。这表明,
磁小体的链已穿透至细胞内(与实施例4中得出的结论一致的结果)。器官的组织学检查也
表明存在零星的磁小体的链,在肝细胞和血管周的肝细胞中检测到,而没有在肾和肺中检
测到。尽管在肝细胞中磁小体的链的积累,肝中没有观察到病变。
24小时的细胞孵育时间,细胞内磁小体的链的存在变得更加明显。存在磁场时,磁小体的
链位于细胞核周围,而没有磁场时,磁小体的链更随机分散在不同的细胞区内。这些结果表
明,有可能用磁场使用磁小体的链靶向肿瘤细胞。
至42℃(图18(a))。通过红外测量估计的温度分布的半高全宽(0.75cm,图18(b))与磁
小体的链所观察到的相同。在这种情况下,在小鼠10和12中经治疗的肿瘤的大小非常显
著的降低(图18(c)),但是组织学检查显示癌旁淋巴结的存在,表明在这些小鼠中抗肿瘤
活性只是部分的。在小鼠11和13中,未治疗的和经治疗的肿瘤的大小以相似的速度增加,
没有显示明显的抗肿瘤活性(图18(c)和18(d))。在小鼠14中和两只其它小鼠中,当注
射SPION而不施加磁场时,注射后的30天期间肿瘤大小显著增加(图18(d))。如在第二
2
组小鼠中,其中注射磁小体的链的混悬液,有丝分裂的平均数目是低的(所选300μm 的视
野,平均5个)并且坏死的活性与对照组中观察到的相当。根据普鲁士蓝染色,染为蓝色的
SPION发现于肝中、枯氏细胞、巨噬细胞中以及肺淋巴结窦中。已经观察到SPION在肺中的
存在(Zhou等人,Biomaterials,2006,27,2001-2008)。它是潜在毒性的征兆,因此它是对
于发展热疗的缺点,比如本公开中所述的。
用红外测量也观察到温度的升高。在用个体磁小体治疗的组中,治疗后30天期间,经治疗
的肿瘤的大小增加。组织学检查揭示在经治疗的肿瘤中着色的区域具有高的有丝分裂活性
2
(所选300μm 的视野,平均15个有丝分裂),表明没有抗肿瘤活性。肝、肾和肺中没有发现
趋磁细菌。
布以及它们穿透到肿瘤细胞内的能力。
的混悬液所用的两倍的氧化铁浓度下获得的。对于具有相似氧化铁浓度的混悬液,对于施
用含有SPION的混悬液,观察到比含有磁小体的链的更低的加热和抗肿瘤效率(实施例6)。
体的加热效率和抗肿瘤活性,还与其它组用于实施磁过热的SPION@PEG和SPION@Citrate
的进行比较。
混悬液首先注射至位于小鼠右肋侧的肿瘤中。位于小鼠左肋侧的肿瘤用作内对照。通过施
加频率183kHz和场幅43mT的交变磁场开始热诱导的治疗。在一种情况中,即对于EDTA存
在时制备的磁小体,磁场强度降低到43mT以下来避免温度超过50℃。以3天的间隔重复3
次治疗。治疗后30天期间测量肿瘤的大小来评价治疗效率。
中所述相同的操作提取磁小体的链。通过不存在EDTA时培养的趋磁细菌制备的磁小体的
链被称为“标准磁小体的链”或CM,而那些通过存在0.4μM EDTA时培养的趋磁细菌而制备
的称为磁小体-EDTA或CM(EDTA 0.4μM)。磁小体-EDTA特征在于比实施例3中所示的
CM更大的磁小体、更长的磁小体的链以及更高的加热能力(当混合在水中时)。
在经治疗的不同小鼠之间取平均)比未治疗的肿瘤的体积的增加少得多。对于治疗得最高
效的小鼠,如在这只小鼠中肿瘤体积变化(图15(b))以及通过治疗后30天拍的该肿瘤照片
(图15(a))所指示的,肿瘤完全消失。用CM观察到清楚的抗肿瘤活性。因此,证实了实施
例5中出现的结果。当磁小体-EDTA混悬液施用至肿瘤并施加磁场时,通过比较图14(a)
和14(c)所观察到的肿瘤内温度比施用CM后升高得更迅速。这种行为与当它们混合在
溶液中时磁小体-EDTA具有比CM更高的加热能力的事实一致(实施例3)。然而,尽管磁小
体-EDTA显示比CM更好的体内加热能力的事实,它们的抗肿瘤活性更低。事实上,图14(d)
显示用磁小体-EDTA治疗的肿瘤的体积比用CM治疗的肿瘤的体积增加得多(图14(b))。
肿瘤活性。
20℃)所观察到的温度升高低得多。这种情况中,治疗后期间经治疗的肿瘤体积以和未治疗
的肿瘤体积相同的速度增加(图14(f))并且治疗后30天期间没有小鼠显示肿瘤的完全消
失。对于用SPION@Citrate治疗的典型的小鼠,治疗后30天期间肿瘤仍然在(图15(e)和
15(f))。这表明没有磁小体的链参与的高效。对于SPION@PEG的注射,如在图14(g)中
所示的施加磁场后小鼠肿瘤内的温度根本不升高,并且治疗后期间没有肿瘤在大小上减小
(图14(h)、15(g)和15(h))。
活性。
胞内过热被认为是比细胞外过热更高效的细胞破坏机制,这两种类型磁小体之间内在化的
这种差异可以解释抗肿瘤活性的差异。
究,含有1mg上述各类型纳米颗粒的各种混悬液肿瘤内注射,即直接在小鼠肿瘤内。
型的测量,对于施加交变磁场下加热的肿瘤离体测量了各种颗粒的特定吸收率(SAR)。由
于SAR与加热的颗粒的量成反比(见实施例2),这种测量使得能够估计注射于肿瘤中的颗
粒的量。
乳腺癌细胞的皮下注射(Cailleau等人,J.Natl.Cancer Inst.,1974,53,661-674)。肿
瘤移植后14天进行各种类型颗粒的注射。以10mg Fe/mL的浓度制备磁小体的链、个体
磁小体、SPION@Citrate和SPION@PEG的混悬液(Micromod,Rostock-Warnemuende,German
y)。以1mg磁赤铁矿的剂量将100μl这些混悬液直接注射于位于右肋侧的肿瘤中。在注
射当天(0天,D0)、注射后3天(3天,D3)、注射后6天(6天,D6)或注射后14天(14天,
D14)测量包含在小鼠不同器官中的磁赤铁矿的量。在不同天(D0、D3、D6或D14),通过颈
椎脱臼法处死动物,并立即收集兴趣组织或器官(血、肝、脾、肺、肾、肿瘤、排泄物),称重并在4℃时冷冻直至分析。首先,离体测试含有各种类型颗粒的并在不同天收集的不同肿瘤
的加热效率。对此,肿瘤组织插入管中,然后置于线圈中,在其中施加20分钟频率183kHz
和场强43mT的交变磁场(EasyHeat 10kW,Ambrell,Soultz,France)。使用可植入的热
电偶微探针(IT-18,Physitemp,Clifton,USA)测量肿瘤内的温度变化。然后,使用设备
确定磁赤铁矿的量,设备是由公司Magnisense开发的(Nikitin等人,2007,J.
Magn.Mater.311,445)。这种技术使得能够在生物靶中对磁性纳米颗粒进行灵敏的检测和
准确的定量。对于用 的测量,在超纯水中通过机械匀浆制备组织(16%排泄物湿重,
即100mlPBS中16g排泄物,25%肿瘤湿重,50%肾,肺、脾湿重以及100%肝脏湿重)。100μl
以这种方式制备的组织置于检测系统中 通过测量含有混合于水中的磁小体的
链、个体磁小体、SPION@Citrate和SPION@PEG的混悬液的 信号,作为这些混悬液
的磁赤铁矿浓度(浓度从15μg/mL至125μg/mL之间不等)的函数进行校准。为了验证用
对磁赤铁矿浓度的估计,在含有最高磁赤铁矿百分比的样本上(肿瘤和排泄物)进
行SQUID测量。对此,估计了含有各种类型颗粒的不同肿瘤和排泄物的饱和磁化强度。根
据这种估计,使用体磁赤铁矿的饱和磁化强度(80emu/g)我们可以推导出现在不同样本中
磁赤铁矿的量。从 测量推导的估计与根据SQUID测量推导的那些比较。最后,对含
有各种类型颗粒的不同肿瘤在施加频率183kHz和场强43mT的交变磁场下进行离体加热。
根据加热曲线,我们可以通过测量25°C处的斜率推导SAR,因此包含在不同肿瘤中磁赤铁
矿的量(实施例2)。
的颗粒的量的五分之一。这导致测量中大的误差条,并且在一些情况中,检测肿瘤中比注射
的量更多的颗粒。然而,尽管这些不确定性,在本研究中得出的主要结论仍然有效。
型的测量( SAR和SQUID)显示基本上相同的趋势:注射后期间包含在肿瘤中的磁
小体的链的百分比快速降低(图16(a))。实际上磁小体的链的90%以上在注射后14天已
被排除。磁小体的链基本上在排泄物中发现,注射后第一天排泄物中10-15%以及注射后3
天、6天、14天15至20%(图16(b))。磁小体的链,排除途径显示为基本上是排泄物。注
射后的第三和第六天,只有很少迹象的磁小体的链(<0.1%ID/g组织)发现于肺、肾、肝和脾
中。血中未发现磁小体的链。这些结果表明,磁小体的链迅速以其天然形式迅速排出。
相对较好的一致性。治疗后期间包含在肿瘤中的个体磁小体的百分比似乎降低得没有磁小
体的链的显著(图16(a)和16(c))。对于磁小体的链,个体磁小体发现于排泄物中但是百
分比更低(在D3、D6和D14,5至10%)。个体磁小体排除的途径似乎(至少部分)也是排泄物
排泄。
肿瘤中的百分比不像磁小体的链那样显著的降低。此外,SPION@Citrate和SPION@PEG没有
在小鼠排泄物中检测到。这些结果可以解释为这样的事实SPION@Citrate和SPION@PEG以
游离铁的形式代谢因此在排泄物中不以纳米颗粒的形式排除。和磁小体相比,宁愿这是这
些化学合成的纳米颗粒的缺点,因为游离铁可引起氧化压力(Puntarulo等人,2005,Mol.
Aspects,Med.,299-312)。
与磁小体的链相反,注射后14天大比例的个体磁小体仍留在肿瘤中,表明有机体可能发现
更难将它们迅速排除。我们可以通过这样的事实常识性地解释这种行为,即个体磁小体聚
集。注射后14天大比例的化学合成纳米颗粒(SPION@Citrate和SPION的@PEG)仍留在肿
瘤中,并且排泄物中没有发现它们。表明这些化学合成纳米颗粒不迅速离开肿瘤,并且它们
以铁的形式代谢和/或它们在尿液中排除。这些特征潜在地使得它们不如磁小体的链成为
更具吸引力的药物候选者。