川芎内酯在制备抗血栓药物中的用途

摘要

本发明涉及川芎内酯在制备抗血栓药物中的用途。具体地，本发明涉及一种川芎提取物，其中含有30~90%的藁本内酯。该提取物是通过以下方法制备得到的：将川芎药材粉碎后，用70%~99%乙醇(例如75%~98%)浸泡并回流提取1-4次，合并提取液，浓缩，用石油醚萃取，将合并的萃取液回收溶剂至干，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅胶拌样后过正相硅胶柱，以体积比为50:0.5~5(例如50:0.5~3)的石油醚和乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，即得。

权利要求

1.川芎提取物在制备抗血栓药物中的应用，其中，所述川芎提取物中含有80～97%的藁本内酯，并且该川芎提取物是通过以下方法制备得到的：将川芎药材粉碎后，用70%～

99%乙醇浸泡并回流提取1-4次，合并提取液，浓缩，用石油醚萃取，将合并的萃取液回收溶剂至干，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅胶拌样后过正相硅胶柱，以体积比为50:0.5～5的石油醚和乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，即得。

2.根据权利要求1的应用，其中用于浸泡川芎药材的所述乙醇是75%～98%乙醇。

3.根据权利要求1的应用，其中在制备川芎提取物的方法中，以体积比为50:0.5～3的石油醚和乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行洗脱。

4.根据权利要求1的应用，其中所述川芎提取物是通过以下方法制备得到的：将川芎药材粉碎后加入70%～99%的乙醇浸泡5～12小时，加热回流提取0.8～1.2小时，提取1～3次，合并滤液得提取液，将提取液用石油醚萃取，将萃取液浓缩后用正相硅胶柱对其进行纯化，以体积比为50:1的石油醚与乙酸乙酯为洗脱剂，收集洗脱液浓缩后得到提取物。

5.根据权利要求1的应用，其中所述川芎提取物是通过以下方法制备得到的：将1000g川芎药材粉碎后，加入4000ml95%乙醇浸泡过夜，回流提取2小时，再加入4000ml95%乙醇加热回流提取3次，每次2h，合并提取液，浓缩至密度1.08；将浓缩液加至500ml水中分散成混悬液，加入500ml石油醚萃取3次，合并萃取液，回收溶剂至干；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅胶拌样后过正相硅胶柱，以体积比为50:1的石油醚和乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，经过浓缩后即得。

说明书

川芎内酯在制备抗血栓药物中的用途

技术领域

[0001] 本发明属中药化学领域，具体地说涉及一种从川芎中提取的有效组分及其制备方法，以及该组分在制备抗血栓药物中的用途。

背景技术

[0002] 血栓形成（thrombosis）是指在心脏和血管腔内，血液发生凝固或血液中的某些有形成分互相粘集，形成固体质块的过程。在病理情况下，血栓造成的血管管腔阻塞和其他影响，会对机体造成严重甚至致命的危害，成为心肌梗死、卒中、深静脉血栓、肺栓塞等心脑血管疾病的重要致病因素。

[0003] 血管内膜损伤是血栓形成的重要诱因之一。血管内皮细胞是一层分隔内皮下结缔组织和血液中凝血因子、血小板的单细胞薄膜，具有抗凝、抗血小板粘集的功能。但是当内皮细胞受损时，内皮下结缔组织内的基底膜胶原、原纤维性胶原、弹性蛋白都有强烈的促凝作用，导致血小板粘集形成血栓。在触发凝血过程中起核心作用的是血小板的活化。能激活血小板的物质包括胶原、凝血酶、ADP等，在内皮损伤后，首先激活血小板的是与血小板接触的胶原，继后凝血链锁反应被启动而产生了凝血酶，并且血小板继续地被活化又不断释出ADP和血栓素A2，随血流而来的是血小板在局部不断地被激活。因此，阻断血小板活化和防止内皮损伤是预防和治疗血栓性疾病的有效途径。

[0004] 抗血栓治疗一直是脑卒中、冠状动脉血栓引起心肌梗塞、血栓闭塞性脉管炎等疾病预防和治疗的有效手段。常用的抗血栓药物主要包括三类，即抗凝血剂、抗血小板药及溶栓药，分别以肝素、阿司匹林和尿激酶为代表。现代药理研究表明，一些活血化瘀类中药如血府逐瘀汤等能够改善血液流变学特性，减少血小板的黏附和聚集，降低血小板的表面活性，同时通过抑制血小板聚集、保护受损内皮细胞等多个途径预防和治疗血栓性疾病。因此，从传统中药寻找具有抗血小板聚集和内皮保护活性的有效组分成为开发抗血栓药物的新来源。

[0005] 川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，其性味辛，温。归肝、胆、心包经。活血祛瘀作用广泛，适宜瘀血阻滞各种病症；祛风止痛，效用甚佳，可治头风头痛、风湿痹痛等症。现代药理学研究表明，川芎提取物对离体豚鼠心脏有剂量依赖性抑制作用，对离休大鼠或豚鼠心脏均具有显著的增加冠脉流量作用，其主要活性成分川芎嗪能扩张大鼠肺血管，抑制缺氧性肺血管收缩反应和右心室肥大。此外，川芎还具有中枢神经系统抑制作用，对动物大脑的活动具有抑制作用，而对延脑呼吸中枢、血管运动中枢及脊髓反射中枢具有兴奋作用。川芎中主要化合物川芎嗪可抑制血栓素A2（TXA2）的合成，其作用与TXA2合成酶抑制剂作用相类似。但目前研究大都集中在川芎嗪和阿魏酸等成分，对于川芎内酯类组分是否具有抗血栓活性及其作用机制尚不清楚。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种川芎有效组分，该有效组分主要含有藁本内酯，含量为30~90%。

[0007] 本发明的另一目的是提供该川芎有效组分的制备方法，通过以下步骤实现：将川芎药材粉碎后加入20%~90%的乙醇浸泡5~12小时，加热回流提取0.8~1.2小时，提取1~3次，合并滤液得提取液，将提取液用石油醚萃取，将萃取液浓缩后用正相硅胶柱对其进行纯化，以体积比为50:1的石油醚与乙酸乙酯为洗脱剂，收集洗脱液浓缩后得到有效组分。

[0008] 本发明的再一个目的是提供该川芎有效组分在制备抗血栓药物中的应用。

[0009] 本发明第一方面提供了一种川芎提取物，其中含有30~90%的藁本内酯。

[0010] 根据本发明第一方面的川芎提取物，其中含有80~97%(例如85%-95%)的藁本内酯。

[0011] 根据本发明第一方面的川芎提取物，其是通过以下方法制备得到的：将川芎药材粉碎后，用70%~99%乙醇(例如75%~98%)浸泡并回流提取1-4次，合并提取液，浓缩，用石油醚萃取，将合并的萃取液回收溶剂至干，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅胶拌样后过正相硅胶柱，以体积比为50:0.5~5(例如50:0.5~3)的石油醚和乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，即得。

[0012] 根据本发明第一方面的川芎提取物，其是通过以下方法制备得到的：将川芎药材粉碎后加入20%~90%的乙醇浸泡5~12小时，加热回流提取0.8~1.2小时，提取1~3次，合并滤液得提取液，将提取液用石油醚萃取，将萃取液浓缩后用正相硅胶柱对其进行纯化，以体积比为50:1的石油醚与乙酸乙酯为洗脱剂，收集洗脱液浓缩后得到提取物。

[0013] 根据本发明第一方面的川芎提取物，其是通过以下方法制备得到的：将1000g川芎药材粉碎后，加入4000ml 95%乙醇浸泡过夜，回流提取2小时，再加入4000ml用95%乙醇加热回流提取3次，每次2h，合并提取液，浓缩至密度1.08；将浓缩液加至500ml水中分散成混悬液，加入500ml石油醚萃取3次，合并萃取液，回收溶剂至干。取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅胶拌样后过正相硅胶柱，以体积比为50:1的石油醚和乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，经过浓缩后即得。

[0014] 本发明第二方面提供了制备川芎提取物的方法，其包括以下步骤：将川芎药材粉碎后，用70%~99%乙醇(例如75%~98%)浸泡并回流提取1-4次，合并提取液，浓缩，用石油醚萃取，将合并的萃取液回收溶剂至干，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅胶拌样后过正相硅胶柱，以体积比为50:0.5~5(例如50:0.5~3)的石油醚和乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，即得。

[0015] 根据本发明第二方面的方法，其包括以下步骤：将川芎药材粉碎后加入20%~90%的乙醇浸泡5~12小时，加热回流提取0.8~1.2小时，提取1~3次，合并滤液得提取液，将提取液用石油醚萃取，将萃取液浓缩后用正相硅胶柱对其进行纯化，以体积比为50:1的石油醚与乙酸乙酯为洗脱剂，收集洗脱液浓缩后得到提取物。

[0016] 根据本发明第二方面的方法，其包括以下步骤：将1000g川芎药材粉碎后，加入4000ml 95%乙醇浸泡过夜，回流提取2小时，再加入4000ml用95%乙醇加热回流提取3次，每次2h，合并提取液，浓缩至密度1.08；将浓缩液加至500ml水中分散成混悬液，加入
500ml石油醚萃取3次，合并萃取液，回收溶剂至干。取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅胶拌样后过正相硅胶柱，以体积比为50:1的石油醚和乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，经过浓缩后即得。

[0017] 根据本发明第二方面的方法，其所得川芎提取物中含有30~90%的藁本内酯。

[0018] 根据本发明第二方面的方法，其所得川芎提取物中含有80~97%(例如85%-95%)的藁本内酯。

[0019] 本发明第三方面提供了本发明第一方面的川芎提取物在制备抗血栓药物中的应用。

[0020] 本发明第四方面提供了一种药物组合物，其中包括本发明第一方面的川芎提取物以及药学可接受的载体或赋形剂。

[0021] 本发明的川芎有效组分可以作为活性部位，加入药剂学上接受的药物赋形剂或载体，按照药剂学上记载的方法制成制剂。

[0022] 所述药物的制剂形式包括液体制剂、固体制剂、胶囊剂、胶丸剂。包括注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂 、崩解剂、口崩片、微丸等。

[0023] 在本发明中，术语“川芎有效组分”亦可称为“川芎组分”、“川芎提取物”、“川芎内酯”等，这些术语可以互换使用。

[0024] 本发明的有益效果为：

[0025] 1.本发明的提取分离工艺简单，能快速准确地得到有效组分。

[0026] 2.本发明提供的川芎有效组分化学成分简单明确，在药理研究上更易于阐明其作用机制，在生产中更易于药物的质量控制。

[0027] 3.本发明首次在模型上，评价了川芎内酯类提取物抗血小板聚集和保护炎性损伤内皮细胞的作用，得到较好的药理活性，为其在制备抗血栓药物中的用途提供了依据。

附图说明

[0028] 图1.为本发明川芎提取物的高效液相色谱分析图。

[0029] 图2.不同浓度川芎提取物对花生四烯酸诱导的血小板聚集的影响。

[0030] 图3.不同浓度川芎提取物对ADP诱导的血小板聚集的影响。

[0031] 图4.不同浓度川芎提取物对胶原诱导的血小板聚集的影响。

[0032] 图5.不同浓度川芎提取物对TNF-α损伤内皮细胞分泌黏附因子的影响。

[0033] 图6.不同浓度川芎提取物对TNF-α损伤内皮细胞核因子NF-κB蛋白表达的影响。

具体实施方式

[0034] 本发明结合附图和下面实施例进一步详细说明本发明的实质内容，该实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。

[0035] 实施例一 川芎有效组分的制备

[0036] 将1000g川芎药材粉碎后，加入4000ml 95%乙醇浸泡过夜，回流提取2小时，再加入4000ml用95%乙醇加热回流提取3次，每次2h，合并提取液，浓缩至密度1.08。将浓缩液加至500ml水中分散成混悬液，加入500ml石油醚萃取3次，合并萃取液，回收溶剂至干。取石油醚萃取部分浸膏，加入正相硅胶拌样后过正相硅胶柱，以体积比为50:1的石油醚和乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，经过浓缩后得到淡黄色液体11.3g，为本发明川芎提取物，其在本发明中亦可称为川芎内酯，并且用于下文生物学试验例。

[0037] 实施例二　川芎有效组分的分析

[0038] 称取如实施例1所示川芎提取物溶解，取适量转移至棕色液相进样瓶，用于液相色谱分析。

[0039] 分析条件如下：Agilent 1100型液相色谱仪，进样量10μl；流速1ml/min, 柱温30℃。色谱分析的流动相梯度为：0~40min：水（0.1%甲酸）：70%~20%，乙腈：30%~80%；40-50min：水（0.1%甲酸）：20%~5%，乙腈：80%~95%；50~55min：水（0.1%甲酸）：5%，乙腈：95%；
检测波长271nm。分析谱图如图1所示(横坐标为分钟)。液相色谱分析显示川芎提取物在26.5min有1个明显色谱峰，经与标准品比对后鉴定该峰代表的化合物为藁本内酯。分析结果显示，川芎内酯提取物中主要成分为藁本内酯，其含量约为90%。出人意料地发现，在实施例1中，如果用浓度低于70%的乙醇提取，或者用石油醚为洗脱剂，或者所用洗脱剂中乙酸乙酯份量大于5，即50份石油醚与5份以上的乙酸乙酯混合液为洗脱剂时，藁本内酯获得量比实施例1的获得量低30%以上。用75%以上乙醇提取，或者用石油醚：乙酸乙酯为50：
0.5~3的比例的混合液作为洗脱液时，藁本内酯获得量是实施例1的获得量的90%~115%，并且提取物中藁本内酯含量均在80~97%。

[0040] 实施例三 川芎有效组分制剂

[0041] 取实施例1所得的川芎有效组分0.5g与10.5g聚乙二醇-6000混合均匀，加热熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至6~8℃液体石蜡中，除油，制得滴丸400粒。

[0042] 实施例四 川芎有效组分制剂

[0043] 取实施例1所得的川芎有效组分0.5g，磨成细粉，与约1/3的淀粉混匀，加淀粉浆混匀制成软材，16目筛制粒，70℃干燥，干粒过14目筛整粒，加剩余淀粉（预先在100－105 ℃干燥）与吸附有液状石蜡的滑石粉（将轻质液状石蜡喷于滑石粉中混匀），再通过14目筛，压片，即得。

[0044] 实施例五 川芎内酯提取物抗血小板聚集活性评价

[0045] 血小板可以被多种物质激活，但是主要通过以下途径：ADP途径，AA环氧酶途径和2+
PAF（血小板激活因子）途径。这三条途径最终均通过升高血小板内Ca 浓度而激活血小板。外源性胶原主要通过PAF途径。本实施例考察了如实施例1所得川芎内酯内酯提取物对花生四烯酸（AA）、二磷酸腺苷（ADP）和胶原(COLL)诱导的血小板聚集的影响。

[0046] 采用利多卡因颈部局部麻醉新西兰大耳白兔，分离左侧颈总动脉，颈总动脉取血后加入3.8%枸橼酸钠溶液抗凝。1000rmp离心12min，取上清部分即富血小板血浆（PRP），剩余部分3000rmp离心10min，取上清部分即贫血小板血浆（PPP）。用全自动血细胞分析仪9
计数血小板，用PPP调整PRP，使血小板计数为(3.0-5.0)×10 个/L。以不同类型诱导剂ADP、AA 及COLL诱导凝血后，测定川芎内酯提取物(实施例1所得)在0.05、0.1、0.2、0.4、
0.6、0.8mg/ml浓度下的抗血小板聚集活性，分别采用0.05mg/ml的阿司匹林和0.2mg/ml的氯吡格雷作为阳性药，用570-VS血小板聚集仪测定血小板聚集率。

[0047] 结果表明，经AA诱导后，迅速聚集，最大聚集率平均为68.04。在阳性药阿司匹林(Aspirin)干预下，最大聚集率显著下降（p<0.01）。实施例1所得川芎内酯提取物在0.05 mg/ml、0.1 mg/ml剂量组与空白对照组比较无明显差异，在0.2-0.8 mg/ml各剂量组聚集率显著下降，与空白对照组比较差异显著（p<0.01），并且呈剂量依赖关系，如附图2所示(图中control表示对照组，aspirin表示阿司匹林组)。

[0048] 富血小板血浆经ADP诱导后，迅速聚集，最大聚集率平均为48.15。在阳性药氯吡格雷干预下，最大聚集率显著下降（p<0.01）。实施例1所得川芎内酯提取物在0.6-1.4mg/ml浓度范围内使ADP诱导的血小板聚集率显著下降，与空白对照组比较差异显著（p<0.01），并且呈剂量依赖关系，如附图3所示(图中contr…表示对照组，clopi…表示氯吡格雷组)。

[0049] 富血小板血浆经经胶原诱导后，迅速聚集，最大聚集率平均为70.77。在阿司匹林及氯吡格雷干预，最大聚集率显著下降（p<0.01）。川芎内酯0.05 mg/ml、0.1 mg/ml剂量组与空白对照组比较无明显差异，0.2-0.8 mg/ml各剂量组聚集率显著下降，与空白对照组比较差异显著（p<0.01），并且呈剂量依赖关系，如附图4所示(图中control表示对照组，aspirin表示阿司匹林组，clopido…表示氯吡格雷组)。

[0050] 实施例六 川芎内酯提取物抗内皮细胞损伤活性评价

[0051] 考察实施例1所得川芎内酯提取物对炎性损伤内皮细胞的保护作用。体外分离培养人脐静脉内皮细胞，TNF-α损伤造模，同时加以不同浓度（6.25、12.5、25ug/ml）的川芎内酯提取物进行共孵育24h，酶联免疫法（Elisa法）测定细胞培养液中黏附分子sICAM-1和sVCAM-1的含量，Western blot测定细胞核中NF-κB蛋白表达。 结果表明，MTT结果显示TNF-α10ng/ml可以明显造成细胞损伤，川芎内酯剂量依赖性的保护内皮细胞免受TNF-α损伤；TNF-α显著性地升高内皮细胞黏附分子ICAM-1 和sVCAM-1的表达（p<0.01），川芎内酯高剂量可以显著性地降低其表达；同时Western blot结果显示川芎内酯可以剂量依赖性的减少人脐静脉内皮细胞NF-kB的蛋白表达。川芎内酯提取物可以保护内皮细胞免受TNF-α的损伤，其作用机制可能是通过抑制NF-κB的蛋白表达，进而减少内皮细胞黏附分子ICAM-1的含量有关。结果见图5，其中显示了不同浓度川芎提取物对TNF-α损伤内皮细胞分泌黏附因子的影响纵坐标表示人sICAM-1和sVCAM-1浓度(ug/ml)。另外，图6显示了不同浓度川芎提取物对TNF-α损伤内皮细胞核因子NF-κB蛋白表达的影响，图中纵坐标表示NF-κB表达(与对照相比)。