本发明涉及一种式（1）碘海醇杂质5-[N-(2,3-二羟基丙基)乙酰胺基]-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺的制备方法。通过对碘海醇杂质的合成，为碘海醇杂质的定性及定量分析提供对照品，从而提高碘海醇的质量标准，为碘海醇的安全用药提供重要的指导意义。
1.一种式（1）所示的化合物的制备方法，其特征在于，经过以下步骤：
第一步：式（7）化合物5-氨基-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺与醋酐反应，得到式（5）化合物5-乙酰胺基-3-N-(2,3-二乙酰氧基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺；
第二步：式（5）化合物在氢氧化钠存在下水解，得到式（6）化合物5-乙酰胺基-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺；
第三步：式（6）化合物与3-氯-1，2-丙二醇反应得到式（1）化合物5-[N-(2,3-二羟基丙基)乙酰胺基]-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺粗品；
第四步：式（1）碘海醇杂质粗品经过提纯得到式（1）碘海醇杂质纯品。
第一步：酯化反应：式（7）化合物5-氨基-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺与醋酐反应，升温至65℃-70℃保温反应26小时，TLC监控原料反应完毕，减压浓缩干得黏状物式（5）化合物5-乙酰胺基-3-N-(2,3-二乙酰氧基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺；
第二步：水解反应：在式（5）化合物5-乙酰胺基-3-N-(2,3-二乙酰氧基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺中缓慢滴加20％的氢氧化钠溶液至反应液溶清并调节pH值为13-14，保温反应3h，液相监控原料反应完全，用浓盐酸调节pH值到中性，常温搅拌
12h至大量白色固体析出，抽滤出固体并用清水漂洗，烘干得水解物式（6）化合物5-乙酰胺基-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺；
第三步：烷基化反应：式（6）化合物5-乙酰胺基-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺，于乙二醇单甲醚中，加入30%甲醇钠，加热至60℃至溶清温度降至室温，加入3-氯-1，2-丙二醇，反应72h，液相监控原料反应完全，用浓盐酸调节PH值至中性，抽滤，将滤液蒸干，得目标产物式（1）粗品；
第四步：提纯：将上述粗品经活性炭脱色、弱阴阳离子树脂分别脱盐、微孔过滤，得到目标产物式（1）白色固体化合物5-[N-(2,3-二羟基丙基)乙酰胺基]-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺。
以式（7）化合物5-氨基-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺为起始原料，取该化合物30g加入250ml反应瓶中，加入醋酐120ml滴加0.1g浓硫酸温度升至
65℃-70℃保温反应26h，TLC监控原料反应完全。减压浓缩干得黏状物式（5）化合物5-乙酰胺基-3-N-(2,3-二乙酰氧基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺。无需纯化，直接进行下步反应；
将上步得到的黏状物式（5）化合物温度降至25℃-30℃，搅拌下缓慢滴加20%的氢氧化钠溶液至反应液溶清并调节pH值为13-14，保温反应3h，液相监控原料反应完全。用浓盐酸调节pH值到中性，常温搅拌12h至大量白色固体析出，抽滤出固体并用清水漂洗三次，烘干得水解物式（6）化合物5-乙酰胺基-3-N-(2,3-二羟丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺；
取水解物式（6）化合物12g加入到反应瓶中，加入乙二醇单甲醚17.4ml，加入30%甲醇钠3.68g，加热至60℃至溶清温度降至室温，加入2.25g3-氯-1，2-丙二醇，反应72h，补加0.64g甲醇钠，继续反应24h，液相监控水解物反应完全。用浓盐酸调节pH值至中性，抽滤，将滤液蒸干，用水夹带两次后加入60ml水溶清，加入活性炭搅拌30min，过滤，滤液用阴阳树脂除盐后，过滤，将滤液蒸干得白色固体式（1）化合物。
4.权利要求1的方法，其特征在于，其中式（7）化合物，制备方法如下：
5.权利要求1的方法，其特征在于，其中式（7）化合物，制备方法如下：
在三口烧瓶中加入式（8）化合物3-氨基-5-（2,3-二乙酰氧基正丙胺基甲酰基）-2,4,6-三碘苯甲酸和4-6倍量氯化亚砜，加热回流至溶清，反应结束，减压浓缩回收氯化亚砜，在反应瓶中加入2-4倍量氯仿，冷却至10-20℃，加水洗涤分层，分出有机层，减压浓缩至干，加入2-4倍量THF，通入过量干燥氨气，使反应液pH值为10-12，反应完毕，加适量的氢氧化钠水溶液，调节pH=14，常温水解完毕，冷却至10-20℃析出晶体，过滤，干燥得式（7）化合物5-氨基-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺。
6.权利要求1的方法，其特征在于，其中式（7）化合物，制备方法如下：
在三口烧瓶中加入式（8）化合物3-氨基-5-（2,3-二乙酰氧基正丙胺基甲酰基）-2,4,6-三碘苯甲酸100g和氯化亚砜500ml，加热回流至溶清，反应结束，减压浓缩回收氯化亚砜，在反应瓶中加入氯仿300ml，冷却至10-20℃，加水洗涤分层，分出有机层，减压浓缩至干，加入THF300ml，通入过量干燥氨气，使反应液pH值为10-12，反应完毕，加适量的氢氧化钠水溶液，调节pH=14，常温水解完毕，冷却至10-20℃析出晶体，过滤，干燥得式（7）化合物5-氨基-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺。
式（1）化合物溶液配制：取式（1）化合物50mg，精密称取，置于50ml容量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
碘海醇纯品溶液配制：取碘海醇500mg，精密称取，置于50ml容量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
碘海醇样品溶液配制：取碘海醇样品500mg，精密称取，置于50ml容量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
步骤3，含量测定：取以上对照溶液和供试品溶液5μL注入液相色谱仪，得到色谱图；
以峰面积为含量指标，通过归一法计算供试品中式（1）化合物和碘海醇的含量；
其中的色谱条件如下：以氨基柱（250mm×4.6mm，5μm）作为色谱柱，流动相为乙腈—水=90:10，流动相流速为1.0ml/min，检测波长为254nm,柱温为20℃。
碘海醇杂质的制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于药物化学领域，更具体地说涉及一种碘海醇制备过程中的杂质成分5-[N-(2,3-二羟基丙基)乙酰胺基]-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺的制备方法。
背景技术
[0002] 碘海醇（Iohexol），属于第二代非离子型单体造影剂，商品名为“欧乃派克”（Omnipaque）,由挪威Nycomed公司于上世纪80年代初开发上市。1982年，欧乃派克首先在挪威、瑞典上市，1985年获美国FDA批准在美国上市。随着世界影像诊断仪器设备的迅速发展，以碘造影剂为主的X-CT造影剂获得前所未有的发展，碘海醇凭借安全性大、对比度高、渗透压低和人体毒性小等诸多优点，一举成为国际市场上最畅销的造影剂，并成为医学界评估各种X线造影剂所依据的“金标准”。
[0003] 然而，严重的不良反应仍时有发生，不良反应的产生除了与碘海醇本身的药理活性有关外，与碘海醇中存在的杂质也有很大关系。所以规范地进行杂质的研究，并将其控制在一个安全、合理的限度范围之内，将直接关系到碘海醇的质量及安全性。对于碘海醇杂质的合成意义重大，它可以用于碘海醇生产中杂质的定性及定量分析，从而可以提高碘海醇的质量标准，为人民群众安全用药提供重要的指导意义。
[0004] 美国专利（US5698739，1997-12-16）文献报道了有关碘海醇杂质5-[N-(2,3-二羟基丙基)乙酰胺基]-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺（1）的制备方法，该专利报道的合成路线如下：
[0005]
发明内容
[0006] 由于现有技术在制备上述式（1）化合物时采用了价格比较贵的原料和工艺，同时操作困难，收率低，因此本发明经过研究，找到一种更加有效的合成方法，解决了对照品紧缺的问题。
[0007] 本发明的另一个目的在于针对式（1）化合物对碘海醇的质量及安全性的影响，通过对碘海醇杂质式（1）化合物的合成，为碘海醇杂质的定性及定量分析提供对照品，从而提高碘海醇的质量标准，为碘海醇的安全用药提供重要的指导意义。
[0008] 本发明在碘海醇制备过程中，分离出一种杂质化合物，5-[N-(2,3-二羟基丙基)乙酰胺基]-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺，并提供了一种制备该杂质的合成方法。本发明分离的式（1）化合物其结构式如下：
[0009]
[0010] 为对该化合物进行进一步深入研究，本发明还对其合成方法进行了研究，为此本发明提供了一种式（1）化合物的合成方法。
[0011] 本发明的合成方法，合成路线如下：
[0012]
[0013] 本发明的合成方法，包括以下步骤：
[0014] 第一步：式（7）化合物5-氨基-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺，与醋酐反应，得到式（5）化合物5-乙酰胺基-3-N-(2,3-二乙酰氧基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺；
[0015] 第二步：式（5）化合物在氢氧化钠存在下水解，得到式（6）化合物5-乙酰胺基-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺；
[0016] 第三步：式（6）化合物与3-氯-1，2-丙二醇反应得到式（1）化合物5-[N-(2,3-二羟基丙基)乙酰胺基]-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺（碘海醇杂质粗品）；
[0017] 第四步：式（1）碘海醇杂质粗品经过提纯得到式（1）碘海醇杂质纯品。
[0018] 优选的，本发明的合成方法，包括以下步骤：
[0019] 第一步：酯化反应：式（7）化合物5-氨基-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺与醋酐反应，升温至65℃-70℃保温反应26小时，TLC监控原料反应完毕。减压浓缩干得黏状物式（5）化合物5-乙酰胺基-3-N-(2,3-二乙酰氧基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺；
[0020] 第二步：水解反应：在式（5）化合物5-乙酰胺基-3-N-(2,3-二乙酰氧基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺中缓慢滴加20％的氢氧化钠溶液至反应液溶清并调节pH值为13-14，保温反应3h，液相监控原料反应完全。用浓盐酸调节pH值到中性，常温搅拌12h至大量白色固体析出，抽滤出固体并用清水漂洗，烘干得水解物式（6）化合物5-乙酰胺基-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺；
[0021] 第三步：烷基化反应：式（6）化合物5-乙酰胺基-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺，于乙二醇单甲醚中，加入30%甲醇钠，加热至60℃至溶清温度降至室温，加入3-氯-1，2-丙二醇，反应72h，液相监控原料反应完全。用浓盐酸调节PH值至中性，抽滤，将滤液蒸干，得目标产物式（1）粗品；
[0022] 第四步：提纯：将上述粗品经活性炭脱色、弱阴阳离子树脂分别脱盐、微孔过滤，得到目标产物式（1）白色固体化合物5-[N-(2,3-二羟基丙基)乙酰胺基]-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺。
[0023] 本发明提纯步骤中使用了大孔吸附树脂分离，优选的使用XAD-1600的大孔树脂，具体操作步骤如下：用大孔吸附树脂吸附反应液，再用不同浓度的甲醇溶液梯度洗脱，HPLC跟踪检测，截取含量大于95%的馏份，减压蒸馏，得目标产物粗品。取粗品经活性炭脱色、弱阴阳离子树脂分别脱盐、微孔过滤，得到式（1）化合物碘海醇杂质纯品。
[0024] 以上本发明的制备方法中，式（7）化合物5-氨基-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺的合成未见文献报道，
[0025] 式（7）化合物的合成路线为：
[0026]
[0027] 可按以下方法制备：
[0028] 在三口烧瓶中加入式（8）化合物3-氨基-5-（2,3-二乙酰氧基正丙胺基甲酰基）-2,4,6-三碘苯甲酸和4-6倍量氯化亚砜，加热回流至溶清，反应结束，减压浓缩回收氯化亚砜，在反应瓶中加入2-4倍量氯仿，冷却至10-20℃，加水洗涤分层，分出有机层，减压浓缩至干，加入2-4倍量THF，通入过量干燥氨气，使反应液pH值为10-12，反应完毕，加适量的氢氧化钠水溶液，调节pH=14，常温水解完毕，冷却至10-20℃析出晶体，过滤，干燥得式（7）化合物5-氨基-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺。
[0029] 优选的，在三口烧瓶中加入式（8）化合物3-氨基-5-（2,3-二乙酰氧基正丙胺基甲酰基）-2,4,6-三碘苯甲酸和5倍量（V/W）氯化亚砜，加热回流至溶清，反应结束，减压浓缩回收氯化亚砜，在反应瓶中加入3倍量（V/W）氯仿，冷却至10-20℃，加水洗涤分层，分出有机层，减压浓缩至干，加入3倍量（V/W）THF，通入过量干燥氨气，使反应液pH值为10-12，反应完毕，加适量的氢氧化钠水溶液，调节pH=14，常温水解完毕，冷却至10-20℃析出晶体，过滤，干燥得式（7）化合物5-氨基-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺。
[0030] 式（8）化合物3-氨基-5-（2,3-二乙酰氧基正丙胺基甲酰基）-2,4,6-三碘苯甲酸为已知化合物，并按现有出版物中已知的方法可容易地制得（US:5073362，1991-12-17）。
[0031] 由于式（1）化合物是合成有用的碘海醇中的杂质，因此该化合物可以作为碘海醇检测过程中的对照品，而碘海醇的检测具有控制该产品质量的意义。
[0032] 碘海醇的检测一般采用HPLC法，检测的内容主要是对碘海醇以及已知或未知的杂质含量进行定性和定量，以便了解该产品的纯度状况以及杂质的成分和含量。
[0033] 本发明利用式（1）化合物作为对照品，采用HPLC法，研究出一种碘海醇的检测方法
[0034] 为此，本发明还提供碘海醇杂质式（1）化合物在测定碘海醇样品内式（1）化合物杂质中作为对照品化合物的应用。
[0035] 本发明所述的检测方法包括以下步骤：
[0036] 步骤1，对照溶液的配制：
[0037] 式（1）化合物溶液配制：取式（1）化合物50mg，精密称取，置于50ml容量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0038] 碘海醇纯品溶液配制：取碘海醇500mg，精密称取，置于50ml容量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0039] 步骤2，供试品溶液的配制：
[0040] 碘海醇样品溶液配制：取碘海醇样品500mg，精密称取，置于50ml容量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0041] 步骤3，含量测定：取以上对照溶液和供试品溶液5μL注入液相色谱仪，得到色谱图。
[0042] 通过归一法以峰面积为含量，计算式（1）化合物和碘海醇的含量。
[0043] 其中的色谱条件如下：以氨基柱（250mm×4.6mm，5μm）作为色谱柱，流动相为乙腈—水=90:10，流动相流速为1.0ml/min，检测波长为254nm,柱温为20℃。
附图说明
[0044] 图1是式（1）化合物的HPLC图。
[0045] 图2是碘海醇对照品品的HPLC图。
[0046] 图3是碘海醇样品的HPLC图。
具体实施方式
[0047] 实施例1：式（7）化合物5-氨基-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺的制备
[0048] 在三口烧瓶中加入式（8）化合物3-氨基-5-（2,3-二乙酰氧基正丙胺基甲酰基）-2,4,6-三碘苯甲酸（100g）和5倍量（V/W）氯化亚砜（500ml），加热回流至溶清，反应结束，减压浓缩回收氯化亚砜，在反应瓶中加入3倍量（V/W）氯仿（300ml），冷却至10-20℃，加水洗涤分层，分出有机层，减压浓缩至干，加入3倍量（V/W）THF（300ml），通入过量干燥氨气，使反应液pH值为10-12，反应完毕，加适量的氢氧化钠水溶液，调节pH=14，常温水解完毕，冷却至10-20℃析出晶体，过滤，干燥得式（7）化合物5-氨基-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺（58.5g，收率66.5%，HPLC含量98.5%）。1
HNMR(400MHz,DMSO+D2O)δ:4.11-4.14(m,1H),3.87-3.91(m,1H),3.75-3.79(m,1H),3.62-+
3.68(m,1H),3.50-3.75(m,1H)。MS-ESI(m/z):631.8[M+H]。
[0049] 实施例2：式（5）化合物5-乙酰胺基-3-N-(2,3-二乙酰氧基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺的制备
[0050] 以式（7）化合物5-氨基-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺为起始原料，取该化合物30g（47.55mmol）加入250ml反应瓶中，加入醋酐120ml滴加0.1g浓硫酸温度升至65℃-70℃保温反应26h，TLC监控原料反应完全。减压浓缩干得黏状物式（5）化合物5-乙酰胺基-3-N-(2,3-二乙酰氧基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺。无需纯化，直接进行下步反应。
[0051] 实施例3：式（6）化合物5-乙酰胺基-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺的制备
[0052] 将实施例2制备得到的黏状物式（5）化合物温度降至25℃-30℃，搅拌下缓慢滴加20%的氢氧化钠溶液至反应液溶清并调节pH值为13-14，保温反应3h，液相监控原料反应完全。用浓盐酸调节pH值到中性，常温搅拌12h至大量白色固体析出，抽滤出固体并用清水漂洗三次，烘干得水解物式（6）化合物5-乙酰胺基-3-N-(2,3-二羟丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺（22g，62.5%/二步收率）。
[0053] 实施例4：式（1）化合物5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰胺基]-3-N-(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-1,3-苯二甲酰胺的制备
[0054] 取水解物式（6）化合物12g（17.83mmol）加入到反应瓶中，加入乙二醇单甲醚17.4ml，加入30%甲醇钠3.68g（20.47mmol），加热至60℃至溶清温度降至室温，加入2.25g（20.36mmol）3-氯-1，2-丙二醇，反应72h，补加0.64g甲醇钠，继续反应24h，液相监控水解物反应完全。用浓盐酸调节pH值至中性，抽滤，将滤液蒸干，用水夹带两次后加入60ml水溶清，加入活性炭搅拌30min，过滤，滤液用阴阳树脂除盐后，过滤，将滤液蒸干得
1
白色固体式（1）化合物（9.8g，摩尔收率79.8%,HPLC纯度97%）。HNMR(500MHz,CD3OD)δ:
4.12(m,1H),3.95(m,1H),3.72(m,1H),3.55(m,5H),3.48(m,2H),1.90(s,3H)。HRMS-ESI(m/+
z):747.8505[M+H]。
[0055] 实施例5：式（1）化合物在HPLC中作为对照品的应用
[0056] 溶液配制：
[0057] 供试溶液：取碘海醇样品500mg，精密称取，置于50ml容量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0058] 碘海醇对照品溶液：取碘海醇对照品品500mg，精密称取，置于50ml容量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0059] 式（1）化合物对照品溶液：取式（1）化合物50mg，精密称取，置于50ml容量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0060] 色谱条件：
[0061] 液相色谱使用254nm的检测器和以氨基柱（250mm×4.6mm，5.0μm）作为检测用色谱柱。流速1.0ml/min，柱温20℃。
[0062] 流动相：乙腈—水=90:10
[0063] 试验步骤：
[0064] 分别将相同体积（5μL）的供试溶液和对照品溶液进样，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图1、附图2和附图3。
[0065] 试验结果：
[0066] 附图1是式（1）化合物的HPLC图，式（1）化合物的保留时间为8.897分钟和10.216分钟。附图2是碘海醇对照品的HPLC图，碘海醇的保留时间为17.803分钟和20.779分钟。附图3是碘海醇样品的HPLC图，保留时间为18.014分钟和21.204分钟，是碘海醇的保留时间，其中保留时间为8.823分钟的峰与对照品式（1）化合物的保留时间8.897一致，保留时间为10.108分钟的峰与对照品式（1）化合物的保留时间10.216一致，说明,8.823分钟和10.108的峰为式（1）化合物的峰。
[0067] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
