一种融合蛋白及其融合蛋白表达载体

摘要

本发明提供一种融合蛋白及其融合蛋白表达载体。该融合蛋白包含人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区与人IgG1的Fc段。该融合蛋白基因序列经密码子优化。该融合蛋白表达载体包含上述的融合蛋白优化后的基因序列和pPIC3.5K质粒基因序列。该融合蛋白能与柯萨奇病毒/腺病毒产生高亲和力的结合，阻止柯萨奇病毒/腺病毒对机体细胞特别是表达CAR的细胞如心肌细胞的感染，本融合蛋白可用于柯萨奇病毒和/或腺病毒感染性疾病的治疗。

权利要求

1.一种融合蛋白的核苷酸，其特征在于，该融合蛋白包含人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区与人IgG1的Fc段，所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白的核苷酸，其特征在于，所述融合蛋白的人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白的核苷酸，其特征在于，所述融合蛋白的人IgG1的Fc段基因序列如SEQ ID NO:2所示。

4.一种融合蛋白表达载体，其特征在于，包含权利要求1所述的融合蛋白基因序列和pPIC3.5K质粒基因序列。

5.一种宿主菌，其特征在于，含有权利要求4所述的融合蛋白表达载体。

说明书

一种融合蛋白及其融合蛋白表达载体

技术领域

[0001] 本发明涉及一种融合蛋白及融合蛋白表达载体，尤其涉及包含人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区与人IgG1的Fc段的融合蛋白。

背景技术

[0002] 柯萨奇病毒(Coxsackie enterovirus)，属小RNA病毒科(Picornavirus)，为正链RNA肠道病毒(Enterovirus)。常引起小儿腹泻，能导致无菌性脑膜炎、流行性胸痛、心肌炎、心包炎、手足口病等多种疾病，妊娠期感染可引起非麻痹性脊髓灰质炎性病变，并致胎儿宫内感染和致畸。目前发现，柯萨奇B组病毒(Coxsackie B enterovirus,CVB)常引发小儿病毒性心肌炎(Viral Myocarditis,VMC)，是小儿及青少年VMC最常见的病原体，约占各种病毒所致心肌炎的50%。腺病毒(adenovirus,Ad)是一类无包膜双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)病毒，归属于哺乳动物腺病毒属。在自然界中分布较广，是引起上下呼吸道和眼部疾患的常见病原体；同时可引起人体扁桃体、腺样体和其它淋巴组织的隐性持续性感染；此外，腺病毒也是病毒性心肌炎的常见病原体。柯萨奇病、腺病毒的传染性强，尤其是在人口密集的地方，对免疫力低下的患者(如老年人、骨髓移植患者、白血病、艾滋病患者等)，通过飞沫和接触传染，在同一时期可造成区域性流行或暴发流行。柯萨奇病毒分为A和B两类，共30多个血清型；腺病毒可分为A～F6个亚属，共51个血清型，目前尚无柯萨奇病毒/腺病毒有效疫苗用于预防，针对其特异性药物还有待开发。

[0003] 因此，从新的角度研制安全、可靠的防治柯萨奇病毒/腺病毒的新型药物十分必要。

[0004] 近年来，一些学者提出了“病毒受体陷阱疗法”(virus receptor trap therapy)这一概念，所谓“病毒受体陷阱疗法”是指利用外源性的可溶性病毒受体来结合病毒,从而阻断病毒与靶细胞膜上的受体结合及随后的病毒内吞。由于外源性受体分子与细胞膜上的受体分子有相同或非常相似的空间结构，因此，多次、大剂量使用将不存在机体的免疫反应等问题。病毒受体陷阱疗法拓展了病毒性疾病的治疗策略，可成为急性病毒血症期的一个新的有效治疗手段。

[0005] 研究表明，柯萨奇病毒和腺病毒通过与细胞表面的柯萨奇病毒/腺病毒受体(Coxsackie virus and adenovirus receptor，CAR)特异性地结合完成感染最初的吸附过程，随后通过五邻体蛋白上的精-甘-天门冬氨酸(RGD)序列与细胞表面的整合素αγβ3和αγβ5结合经过胞饮作用使病毒进入细胞从而完成内化过程。因此，CAR是绝大部分柯萨奇病毒和腺病毒进入宿主细胞的关键。

[0006] 目前，CAR的基础性研究已非常深入。研究表明，CAR是分子量为46KD的跨膜糖蛋白，编码人源CAR(hCAR)的基因已明确定位于染色体21q11.2上，包含7个外显子，365个氨基酸，分3个结构域。①胞外域：含两个Ig结构域(1.2),Ad通过纤维顶球的三聚体结构与Ig1结构域结合。②跨膜段：含22个氨基酸，对细胞间相互作用起稳定调节作用。③胞内域：含107个氨基酸，其中前两位Cys残基可能是翻译后脂化修饰位点，此外，胞内域可能还存在Tyr磷酸化位点。

[0007] 基于这些已有的基础性研究，如果通过基因工程方法，获得CAR的胞外区蛋白(extracellular region of CAR,exCAR)，用于Ad的“受体陷阱疗法”，将能有效的阻止绝大部分型别的腺病毒对人体细胞的感染。

[0008] 目前，在“病毒性疾病的受体陷阱疗法”这一领域已有一些探索性研究，但仅停留在体外细胞实验和动物模型研究的初步阶段。究其原因，最主要的是活性蛋白的高效表达问题。目前的相关研究一是采用大肠杆菌原核表达系统，该系统能获得较高产量的表达蛋白，但其蛋白表达形式多为包涵体，难以获得大量可溶性活性蛋白；二是采用细胞真核表达系统，如CHO细胞和293T细胞等，此类表达系统能解决表达蛋白的正确折叠和糖基化问题，但其产量很低，成本极高，大量制备极为困难。

[0009] 所以，“病毒受体陷阱疗法”将来应用人体治疗，实现的关键是能生产制备大量可纯化的具有高生物活性的病毒受体或其亚单位。

发明内容

[0010] 本发明的目的在于提供一种融合蛋白及融合蛋白的表达载体。

[0011] 本发明所述的融合蛋白，包含人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区与人IgG1的Fc段。

[0012] 所述人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区的基因序列其序列如SEQ IDNO:1所示。

[0013] 所述人IgG1的Fc段的基因序列其序列如SEQ ID NO:2所示。

[0014] 所述融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO:3所示，其氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示。

[0015] 本发明所述的融合蛋白可用于制备治疗柯萨奇病毒和/或腺病毒的药物。

[0016] 本发明提供的融合蛋白表达载体，包含上述的融合蛋白基因序列和pPIC3.5K质粒基因序列。其中所述融合蛋白基因序列如SEQ ID NO:2所示。

[0017] 本发明还提供一种宿主菌，其含有上述的融合蛋白表达载体。

[0018] 本发明将人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区(extracellularCoxsackie virus and adenovirus receptor，exCAR)基因编码序列与人IgG1的Fc段基因编码序列根据毕赤酵母遗传密码偏嗜性进行了密码子优化，对框连接而成为融合蛋白exCAR:Fc编码基因，该融合蛋白既具有与柯萨奇病毒/腺病毒的高结合力，又能利用抗体Fc端与吞噬细胞的Fc受体结合，加速对结合病毒的吞噬和清除效率。利用毕赤酵母pPIC3.5K/GS115表达系统，完成融合蛋白exCAR:Fc的高效可溶性表达，获得大量可纯化的且具有高生物活性的可溶性exCAR:Fc蛋白。

[0019] 毕赤酵母表达系统是一种成熟的真核表达系统，具有强启动子可严格调控目的蛋白的表达；并可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性。此外，其营养要求低，生长快，培养基廉价，便于工业化生产及高密度发酵培养。本发明选择了毕赤酵母pPIC3.5K/GS115表达系统表达目的蛋白，以实现目的蛋白具有与天然蛋白相似生物学活性的可溶性、高效表达。

[0020] 所述融合蛋白能与柯萨奇病毒/腺病毒产生高亲和力的结合，阻止柯萨奇病毒/腺病毒对机体细胞特别是表达CAR的细胞如心肌细胞的感染，本融合蛋白可用于柯萨奇病毒和/或腺病毒感染性疾病的治疗。

[0021] 本发明将人源性柯萨奇病毒/腺病毒受体的胞外区与IgG1的Fc段构建为融合蛋白，使融合蛋白即具有与病毒的高结合力，又能有效地与吞噬细胞膜上的抗体Fc受体结合，介导吞噬细胞对病毒的吞噬杀伤，能加速病毒在体内的清除效率。

[0022] 为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

[0023] 图1是重组工程菌pPIC3.5K-exCAR/DH5α的PCR鉴定结果，其中：M泳道：DNA marker；1、2泳道：exCAR PCR阴性对照；3、4、5泳道：exCAR PCR鉴定结果；

[0024] 图2是重组质粒pPIC3.5K-exCAR:Fc PCR鉴定结果，其中：M泳道：DNAmarker；1、3泳道：exCAR PCR结果；2泳道：exCAR PCR阴性对照；4泳道：exCAR:Fc PCR阴性对照；5泳道：exCAR:Fc PCR结果；6泳道：Fc PCR结果；7泳道：Fc PCR阴性对照；

[0025] 图3是重组质粒pPIC3.5K-exCAR:Fc/SnaB I、Not I双酶切后电泳图；其中：M泳道：DNA marker；1泳道：阳性重组质粒pPIC3.5K-exCAR:Fc/SnaB I、Not I双酶切，可见切出约1350bp DNA条带；2泳道：pPIC3.5K/SnaB I、Not I双酶切；

[0026] 图4是重组质粒pPIC3.5K-exCAR:Fc测序图谱（结果部分截图），图中标注起始密码和SnaB I酶切位点；

[0027] 图5是阳性转化子pPIC3.5K-exCAR:Fc/GS115PCR鉴定图，其中：M泳道：DNA marker；1泳道：pPIC3.5K/GS115基因组DNA采用酵母阳性转化子鉴定引物扩增结果；2泳道：pPIC3.5K-exCAR:Fc/GS115基因组DNA采用酵母阳性转化子鉴定引物扩增结果；3，6泳道：exCAR:Fc PCR阴性对照；4泳道：pPIC3.5K/GS115基因组DNA采用exCAR:Fc上下游引物扩增结果；5泳道：pPIC3.5K-exCAR:Fc/GS115基因组DNA采用exCAR:Fc上下游引物扩增结果；

[0028] 图6是exCAR:Fc蛋白的表达情况，其中：M泳道:蛋白Marker；1,2泳道：pPIC3.5K/GS115空载体菌经甲醇诱导96h后表达蛋白；3,4泳道：pPIC3.5K-exCAR:Fc/GS115经甲醇诱导96h后表达蛋白；

[0029] 图7是exCAR:Fc蛋白纯化情况，其中：M泳道:蛋白Marker；1,2泳道：exCAR:Fc经ProteinA亲和层析及凝胶层析纯化后结果；3,4泳道：exCAR:Fc经ProteinA亲和层析纯化后结果；

[0030] 图8是exCAR:Fc蛋白Western-blot结果图，其中：M泳道:蛋白Marker(170,130,95,72,55,43,34,26,17,10KDa)；1泳道：pPIC3.5K/GS115表达蛋白与一抗孵育结果；2泳道：pPIC3.5K-exCAR:Fc/GS115表达蛋白与一抗孵育结果；

[0031] 图9A至图9C分别是是exCAR:Fc蛋白阻断前、BSA对照组、阻断后的阻断腺病毒adEasy-1株感染Hela细胞结果图，其中：图9A：100MOI adEasy-1株感染Hela细胞48h图；图9B：终浓度2ug/ml BSA对照阻断adEasy-1株感染Hela细胞48h；图9C：终浓度2ug/ml exCAR:Fc蛋白阻断adEasy-1株感染Hela细胞48h图；

[0032] 图10是exCAR:Fc蛋白质N端测序结果；

[0033] 图11是exCAR:Fc蛋白阻断CoxB3病毒感染Hela细胞MTT实验结果图。

具体实施方式

[0034] 一、材料与方法

[0035] （一）菌株、质粒、病毒株和细胞株

[0036] 大肠杆菌DH5α由本实验室保存；毕赤酵母(Pichia pastoris)表达质粒pPIC3.5K、菌株GS115及pPIC3.5K/GS115购自美国Invitrogen公司；腺病毒adEasy-1株由重庆医科大学儿科医院分子诊断室黄轶博士惠赠；柯萨奇病毒（CoxB3病毒）m株购自中科院武汉病毒所；Hela细胞株由本实验室保存。

[0037] （二）主要试剂

[0038] KOD plus Taq DNA聚合酶及PCR试剂 日本TOYOBO公司

[0039] Ligation high 日本TOYOBO公司

[0040] SnaB I 日本Takara公司

[0041] EcoR I 日本Takara公司

[0042] Not I 日本Takara公司

[0043] Sal I 日本Takara公司

[0044] DL2000 DNA Marker 天根生物有限公司

[0045] 质粒提取试剂盒 北京博大泰克生物公司

[0046] 凝胶回收试剂盒 北京博大泰克生物公司

[0047] EB 美国Amresco分装

[0048] 琼脂糖 美国BBI

[0049] 酵母粉 英国Oxoid

[0050] 胰蛋白胨 英国Oxoid

[0051] YNB 北京鼎国

[0052] 琼脂 成都天泰生物公司

[0053] SDS 美国BBI

[0054] DTT 上海生工

[0055] 生物素 上海生工

[0056] 蜗牛酶 北京鼎国

[0057] D-山梨醇 北京鼎国

[0058] 丙烯酰胺 美国BBI

[0059] N,N′-亚甲双丙烯酰胺 加拿大BBI

[0060] 过硫酸铵 加拿大BBI

[0061] TEMED 上海生工

[0062] Tris 加拿大BBI

[0063] Sephadex G-250 美国Amersham Pharmacia[0064] DMEM/F12(DF)培养基 HighClone

[0065] 胎牛血清 四季青生物有限公司

[0066] 蛋白质分子量标准 天根生物有限公司

[0067] 葡萄球菌A蛋白层析柱 加拿大BBI公司

[0068] 山羊抗人CAR抗体 美国Santa公司

[0069] HRP-兔抗羊IgG 中杉金桥公司

[0070] （三）主要仪器设备

[0071] ISO 9001电子天平 德国Sartorius公司

[0072] Milli-Q Elix纯水器 美国Millipore公司

[0073] PB-20 pH计 德国Sartorius公司

[0074] TH2大振幅恒温摇床 江苏太仓市实验设备厂[0075] DU800分光光度计 美国Beckman公司

[0076] ERC-4型净化工作台 艺思特净化有限公司

[0077] PTC-100TM PCR仪 美国MJ Research公司[0078] Gene PulseTM电转化仪 美国Bio-Rad公司

[0079] 湿转印仪 美国Bio-Rad公司

[0080] DYY-11型电泳仪 北京六一仪器厂

[0081] MDF-382E(N)超低温冰箱 日本Sanyo公司

[0082] Mini PROTEAN 3 cell电泳装置 美国Bio-Rad公司

[0083] ChemimagerTM 5500凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司

[0084] PK-8B电热恒温水浴箱 上海精宏实验设备公司[0085] PYX-DHS-50×64S隔水式电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂

[0086] D-37520型低温高速离心机 德国Heraeus公司

[0087] TGL-16G型台式离心机 上海安享科学仪器厂

[0088] UltrasonicsVCX-750超声仪 美国Sonics

[0089] CO2培养箱 德国Heraeus公司

[0090] 荧光显微镜 德国Leica

[0091] (四)主要溶液及试剂配制

[0092] 1．LB液体培养基：

[0093] 称取胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，加800ml ddH2O溶解，用NaOH调pH值至7.4，补加ddH2O至1000ml，高压灭菌20min，4℃保存备用。配制含AMP培养基则在使用前加入终浓度为100μg/ml的AMP。

[0094] 2．LB固体培养基

[0095] 在LB液体培养基的基础上，加入终浓度为15g/L的琼脂，高压灭菌20min，倾倒平板，凝固后用塑料袋封装，4℃保存备用。配制含AMP培养基则需待温度降至65℃后，加入终浓度为100μg/ml的AMP，摇匀后倾倒平板。

[0096] 3．100mmol/L CaCl2溶液

[0097] 称取14.7g CaCl2·2H2O溶解于1000ml ddH2O中，过滤除菌，4℃保存备用。

[0098] 4．TAE电泳缓冲液(50×贮存液，pH约8.5)

[0099] 称取Tris碱242g，Na2EDTA·2H2O37.2g，加入57.1ml冰乙酸，补加ddH2O至1000ml，使用时稀释50倍。

[0100] 5．1%琼脂糖凝胶

[0101] 称取1g琼脂糖，加入100ml1×TAE缓冲液中，用微波炉加热溶解，待温度降至65℃后，加入10mg/ml的EB10μl，混匀后倾入模具中，插入梳子，凝固后使用。

[0102] 6．10×D

[0103] 即20%葡萄糖(Dextrose)溶液。称取200g葡萄糖溶于1L ddH2O中，滤过除菌，4℃保存。

[0104] 7．10×M

[0105] 即5%甲醇(Methanol)溶液。取5ml甲醇加入95ml ddH2O中，滤过除菌，4℃保存。

[0106] 8．10×GY

[0107] 即10%甘油(Glycerol)溶液。取100ml甘油加至900ml ddH2O中，15磅高压灭菌20min，4℃保存。

[0108] 9．10×YNB

[0109] 称取34g YNB，100g硫酸铵，加ddH2O溶至1L，加热溶解，滤过除菌，4℃保存。

[0110] 10．500×B

[0111] 即0.02%的生物素(Biotin)溶液。称取20mg生物素，溶于100ml ddH2O中，滤过除菌，4℃保存。

[0112] 11．1M磷酸钾缓冲液(pH6.0)

[0113] 量取132ml1M K2HPO4,868ml1M KH2PO4,pH6.0±0.1(如pH需调，用磷酸或KOH调整)，高压灭菌后，置4℃或室温保存。

[0114] 12．YPD液体培养基

[0115] 取2.0g酵母提取物，4.0g蛋白胨溶于180ml双蒸水中，121℃，30min高压灭菌，冷却后加入20ml10×D。

[0116] 13．YPD固体培养基

[0117] 取2.0g酵母提取物，4.0g蛋白胨溶于180ml双蒸水中，加入终浓度为20g/L的琼脂，121℃，30min高压灭菌，冷却后加入20ml10×D。

[0118] 14．BMGY液体培养基

[0119] 取蛋白胨20g，酵母提取物10g，加入去离子水700ml，121℃，20min高压灭菌，而后加入无菌的10×GY，10×YNB，10×磷酸盐缓冲液各100ml，冷至室温后补加500×Biotin2ml即配成BMGY培养基。

[0120] 15．BMMY液体培养基

[0121] 取蛋白胨20g，酵母提取物10g，加入去离子水700ml，121℃，20min高压灭菌，而后加入无菌的10×M，10×YNB，10×磷酸盐缓冲液各100ml，冷至室温后补加500×Biotin2ml即配成BMGY培养基。

[0122] 16．MD固体培养基

[0123] 在160ml水中加入3.0g琼脂，高压灭菌，冷却至60℃后，依次加入20ml10×YNB，20ml10×D，0.4ml500×Biotin，立即铺板。

[0124] 17．MM固体培养基

[0125] 在160ml水中加入3.0g琼脂，高压灭菌，冷却至60℃后，依次加入20ml10×YNB，20ml10×M，0.4ml500×Biotin，立即铺板。

[0126] 18.酵母感受态处理液

[0127] 100mM LiAc,10mM DTT,0.6M山梨醇,and10mM Tris-HCl,pH7.5

[0128] 19．G418-YPD平板

[0129] 取2.0g酵母提取物，4.0g蛋白胨溶于180ml双蒸水中，加入终浓度为20g/L的琼脂，121℃，30min高压灭菌，冷却后加入20ml10×D和不同浓度的G418(0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0mg/ml)，充分摇匀铺板，4℃备用。

[0130] 20.洗膜液（PBST）

[0131] 称取NaCl8.0g、KCl0.2g、KH2PO40.2g、Na2HPO4·12H2O2.9g溶于800ml ddH2O中，加入500ul Tween-20后ddH2O定容至1L。

[0132] 21.转膜缓冲液（pH8.3）

[0133] 称取Tris3.0g、甘氨酸11.3g，加入甲醇200ml后ddH2O定容至1L。

[0134] 22.CAPS电转缓冲液

[0135] 称取CAP2.2g溶于800ml ddH2O中，加入100ml甲醇，NaOH调PH至11并定容至1L。

[0136] 23.丽春红S染色液

[0137] 称取丽春红S0.5g，加入冰乙酸1ml，ddH2O定容至100ml。

[0138] 24.封闭液/一抗、二抗稀释液

[0139] 称取脱脂奶粉5g溶于100ml PBST中。

[0140] 25.柠檬酸三钠底物缓冲液

[0141] 称取柠檬酸0.51g、Na2HPO4.12H2O1.84g加入ddH2O定容至100ml。

[0142] 26.显色液

[0143] 称取DAB15mg，加入甲醇5ml、30%H20215ul和柠檬酸三钠底物缓冲液25ml。

[0144] 27.0.01mol/L PBS（pH7.4）溶液配置

[0145] NaCl8.00g，KCl0.20g，KH2PO40.20g，NaH2PO4·H2O1.56g，1000ml ddH2O溶解，高温高压灭菌，4℃保存。

[0146] 实施例1：基因及引物的合成

[0147] 1.1exCAR和IgG1Fc基因的合成

[0148] 根据GenBank中人 源性CAR胞外 区基因 编码序 列(exCAR）(Accession Number:NM_001338)和IgG1Fc段基因编码序列(Accession Number:AF237583)，同时依据毕赤酵母遗传密码偏嗜性将exCAR和IgG1Fc段基因序列进行了密码子优化，由上海生工分别合成exCAR和IgG1Fc基因并构建工程菌PUC-exCAR/DH5α、PUC-Fc/DH5α，密码子优化后的核酸序列如下：

[0149] exCAR(651bp):SEQ ID NO:1

[0150] ttgtccatcactactccagaagagatgattgagaaggctaagggtgagactgcctacttgccatgtaagttcactttgtctccagaagaccaaggtccattggacatcgagtggttgatttccccagctgacaatcagaaggttgatcaagtcattattttgtactctggtgacaagatttacgacgactactacccagacttgaagggtagagttcacttcacctccaatgacttgaagtctggtgatgcttctatcaatgtcaccaatttgcaattgtctgacattggtacttaccagtgtaaggtcaagaaggctccaggtgttgctaataagaagattcacttggtcgttttggttaagccatccggtgctagatgttacgttgacggttctgaggaaattggttccgacttcaagatcaagtgtgagccaaaggaaggttccttgccattgcagtacgagtggcaaaagttgtctgactcccagaagatgccaacttcttggttggctgagatgacttcctctgttatttctgtcaagaatgcttcttctgagtactctggtacttactcctgtaccgtcagaaacagagtcggttctgaccagtgtttgttgagattgaacgttgtcccaccatccaataaggct

[0151] IgG1Fc（696bp）:SEQ ID NO:2

[0152] gagccaaagtcttgtgacaagactcacacctgtccaccatgtccagctccagagttgttgggtggtccatccgtcttcttgttcccaccaaagccaaaggacaccttgatgatctccagaaccccagaggtcacctgcgtcgttgtcgacgtctcccacgaggacccagaggtcaagttcaactggtacgtcgacggtgttgaggtccacaatgctaagaccaagccaagagaggagcagtacaactccacctacagagtcgtctctgtcttgaccgtcttgcaccaggactggttgaatggtaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaggctttgccagctccaatcgagaagaccatctccaaggctaagggtcagccaagagagccacaggtctacaccttgccaccatccagagaggagatgaccaagaaccaggtctccttgacctgcttggtcaagggtttctacccatccgacatcgctgtcgagtgggagtctaatggtcagccagagaacaactacaagaccaccccaccagtcttggactccgacggttccttcttcttgtactccaagttgaccgttgacaagtctagatggcagcagggtaacgtcttctcctgctccgtcatgcacgaggctttgcacaaccactacactcagaagtccttgtccttgtccccaggtaag

[0153] 毕赤酵母表达的融合蛋白exCAR-Fc核酸序列（框内为加入的EcoR I酶切位点，atg为起始密码子，tga为终止密码）：SEQ ID NO:3

[0154] atggtgtccatcactactccagaagagatgattgagaaggctaagggtgagactgcctacttgccatgtaagttcactttgtctccagaagaccaaggtccattggacatcgagtggttgatttccccagctgacaatcagaaggttgatcaagtcattattttgtactctggtgacaagatttacgacgactactacccagacttgaagggtagagttcacttcacctccaatgacttgaagtctggtgatgcttctatcaatgtcaccaatttgcaattgtctgacattggtacttaccagtgtaaggtcaagaaggctccaggtgttgctaataagaagattcacttggtcgttttggttaagccatccggtgctagatgttacgttgacggttctgaggaaattggttccgacttcaagatcaagtgtgagccaaaggaaggttccttgccattgcagtacgagtggcaaaagttgtctgactcccagaagatgccaacttcttggttggctgagatgacttcctctgttatttctgtcaagaatgcttcttctgagtactctggtacttactcctgtaccgtcagaaacagagtcggttctgaccagtgtttgttgagattgaacgttgtcccaccatccaataaggct gagccaaagtcttgtgacaagactcacacctgtccaccatgtccagctccagagttgttgggtggtccatccgtcttcttgttcccaccaaagccaaaggacaccttgatgatctccagaaccccagaggtcacctgcgtcgttgtcgacgtctcccacgaggacccagaggtcaagttcaactggtacgtcgacggtgttgaggtccacaatgctaagaccaagccaagagaggagcagtacaactccacctacagagtcgtctctgtcttgaccgtcttgcaccaggactggttgaatggtaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaggctttgccagctccaatcgagaagaccatctccaaggctaagggtcagccaagagagccacaggtctacaccttgccaccatccagagaggagatgaccaagaaccaggtctccttgacctgcttggtcaagggtttctacccatccgacatcgctgtcgagtgggagtctaatggtcagccagagaacaactacaagaccaccccaccagtcttggactccgacggttccttcttcttgtactccaagttgaccgttgacaagtctagatggcagcagggtaacgtcttctcctgctccgtcatgcacgaggctttgcacaaccactacactcagaagtccttgtccttgtccccaggtaagtga

[0155] 毕赤酵母表达的融合蛋白exCAR-Fc氨基酸序列（451AA,M.W50.3kD,pI6.43）：SEQ ID NO:4

[0156] VSITTPEEMIEKAKGETAYLPCKFTLSPEDQGPLDIEWLISPADNQKVDQVIILYSGDKIYDDYYPDLKGRVHFTSNDLKSGDASINVTNLQLSDIGTYQCKVKKAPGVANKKIHLVVLVKPSGARCYVDGSEEIGSDFKIKCEPKEGSLPLQYEWQKLSDSQKMPTSWLAEMTSSVISVKNASSEYSGTYSCTVRNRVGSDQCLLRLNVVPPSNKA EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK[0157] 1.2引物合成及PCR反应体系

[0158] exCAR的扩增引物：上游引物5’-tatatacgta gtgtccatcactactccag-3’–SEQID NO:5(下 划 线 部 分 为 SnaB I位 点，框 内 为Kozak序 列 )；下 游 引 物5’-tatagaattcagccttattggatggtg-3’–SEQ ID NO:6(下 划 线 部 分 为 EcoR I 位点)。IgG1Fc的扩增引物：上游引物5’-tatagaattcgagccaaagtcttgtgac-3’–SEQ ID NO:7(下划线部 分为EcoR I位点)；下游 引物：5’-tatttattgcggccgctcacttacctggggacaagg-3’–SEQ ID NO:8(下划线部分为Not I位点)。酵母阳性转化子鉴定引物：上游引物5’-gactggttccaattgacaagc-3’–SEQ ID NO:9；下游引物
5’-gcaaatggcattctgacatcc-3’–SEQ ID NO:10。引物由上海生工合成。

[0159] ①exCAR或Fc基因PCR反应体系如下：

[0160]

[0161] 热循环参数：94℃3分钟；(94℃30秒，55℃30秒，72℃60秒)×32循环；72℃5分钟。

[0162] ②exCAR-Fc基因或酵母阳性转化子鉴定的PCR反应体系如下：

[0163]

[0164] 热循环参数：94℃3分钟；(94℃30秒，55℃30秒，72℃90秒)×32循环；72℃5分钟。

[0165] 实施例2：重组工程菌pPIC3.5K-exCAR/DH5α的构建及鉴定

[0166] 2.1exCAR基因EcoR I/SnaB I酶切

[0167] 将实施例1.2中构建的PUC-exCAR/DH5α菌液接种于LB(AMPr)培养基中，37℃、180rpm过夜培养，质粒提取试剂盒提取PUC-exCAR质粒，并作EcoR I、SnaB I分步酶切。

[0168] ①EcoR I酶切反应体系如下：

[0169]

[0170] 置37℃，反应3小时后体系中直接加入SnaB I及相应缓冲液进行第二步酶切。

[0171] ②SnaB I酶切反应体系如下：

[0172]

[0173] 置37℃，反应3小时，酶切产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，回收exCAR酶切后基因片段。

[0174] 2.2pPIC3.5K质粒EcoR I/SnaB I酶切

[0175] 质粒提取试剂盒从pPIC3.5K/GS115菌中提取pPIC3.5K质粒并作EcoR I、SnaB I分布酶切，酶切反应体系及步骤参照实施例2.1进行，酶切产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，回收酶切后质粒pPIC3.5K。

[0176] 2.3连接反应

[0177] 将实施例2.1和2.2中酶切产物按下面体系作连接反应:

[0178]

[0179] 连接产物置16℃反应过夜。

[0180] 2.4大肠杆菌DH5α感受态的制备

[0181] 参照分子克隆实验指南（第三版，科学出版社2002[美],J.萨姆布鲁克，D.W拉塞尔著，黄培堂等译）进行：将大肠杆菌DH5α接种于2ml的LB液体培养基，37℃，160rpm振摇培养过夜。次日按1%比例转种于200ml LB液体培养基中，37℃，240rpm培养至对数生长早期(OD600=0.3～0.5)。取出摇瓶，4℃水平离心机5000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀中加入20ml冰预冷的100mmol/LCaCl2溶液重悬细菌，冰浴30分钟后再次离心，再用20ml冰预冷的100mmol/LCaCl2溶液重悬细菌，并按15％的比例加入甘油，将制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞分装成100μl，于-70℃保存备用。

[0182] 2.5连接产物转化DH5α感受态

[0183] 取12μl连接产物加入到100μl DH5α感受态细胞中，冰浴30分钟；置42℃热休克90秒，取出后冰浴2分钟；将其加入900μl不含AMP的LB液体培养基中，37℃，180rpmr振摇培养1小时，取200μl转化产物涂布于LB(AMP)平板，37℃过夜孵育,挑取平板上的克隆进行鉴定。

[0184] 2.6重组工程菌pPIC3.5K-exCAR/DH5α的PCR鉴定

[0185] 挑取LB(AMPr)平板上长出的菌落于LB(AMPr)的培养基中，37℃、180rpm振摇培养过夜，取1μl菌液进行PCR鉴定，PCR引物及反应体系参照实施例1.2中扩增exCAR基因条件进行。

[0186] 结果：重组工程菌pPIC3.5K-exCAR/DH5α经PCR鉴定，扩增出了与预期大小相符的目的条带（exCAR为651bp），结果见图1。

[0187] 实施例3：重组工程菌pPIC3.5K-exCAR:Fc/DH5α的构建

[0188] 3.1pPIC3.5K-exCAR质粒EcoR/Not I双酶切

[0189] 采用质粒提取试剂盒提取经实施例2.6中PCR鉴定为阳性的重组工程菌质粒pPIC3.5K-exCAR，并作EcoR I/Not I双酶切。

[0190] 酶切体系如下：

[0191]

[0192] 置37℃，反应3小时。酶切产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，回收酶切后质粒pPIC3.5K-exCAR。

[0193] 3.2Fc基因Not I/EcoR I双酶切

[0194] 将实施例1.2中构建的PUC-Fc/DH5α菌液接种于LB(AMPr)培养基中，37℃、180rpm过夜培养，质粒提取试剂盒提取PUC-Fc质粒，并作Not I/EcoR I双酶切，反应体系如下：

[0195]

[0196] 置37℃，反应3小时。酶切产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，回收酶切后IgG1Fc基因片段。

[0197] 3.3连接反应

[0198] 将实施例3.1和3.2中酶切产物按实施例2.3连接反应条件进行连接。

[0199] 3.4连接产物转化DH5α感受态

[0200] 转化方法参照实施例2.5进行，并挑取经37℃过夜孵育后LB(AMPr)平板上的克隆进行鉴定。

[0201] 实施例4：重组质粒pPIC3.5K-exCAR:Fc的鉴定

[0202] 4.1重组质粒的PCR鉴定

[0203] 挑取LB(AMPr)平板上长出的菌落于LB(AMPr)的培养基中，37℃180rpm振摇培养过夜，质粒提取试剂盒提取重组质粒并行PCR鉴定，PCR引物及反应体系按实施例1.2中扩增exCAR、Fc和exCAR:Fc基因条件进行。

[0204] 4.2重组质粒的双酶切鉴定

[0205] 将经PCR鉴定为阳性的重组质粒行SnaB I、Not I双酶切鉴定，反应体系如下：

[0206]

[0207] 置37℃，反应3小时，酶切产物行1%琼脂糖凝胶电泳分析。

[0208] 4.3阳性重组质粒的测序鉴定

[0209] 将阳性重组质粒送上海生工测序。根据序列分析重组质粒有无读框移位和氨基酸突变。

[0210] 结果：重组质粒pPIC3.5K-exCAR:Fc经PCR鉴定扩增出了与预期大小相符的目的条带（exCAR:Fc为1359bp），结果见图2；采用SnaB I/Not I双酶切重组质粒pPIC3.5K-exCAR:Fc（并设pPIC3.5K/SnaB I、Not I双酶切作对照），切出了与预期大小相符的插入片段(exCAR:Fc为1359bp和载体片段pPIC3.5K大小为9.0kb)，酶切结果见图3。进一步对重组质粒进行核苷酸测序鉴定，结果表明，目的基因exCAR:Fc的核酸序列与SEQ ID NO:3完全符合。测序结果见图4。

[0211] 实施例5：重组质粒pPIC3.5K-exCAR:Fc转化毕赤酵母GS115感受态[0212] 5.1重组质粒pPIC3.5K-exCAR:Fc的Sal I线性化

[0213] 重组质粒需经线性化后方能以单交换或双交换的方式整合到毕赤酵母菌的基因组中，根据Invitrogen公司操作手册用Sal I对重组的质粒进行单酶切，反应体系如下：

[0214]

[0215]

[0216] 反应条件：37℃，过夜。

[0217] 酶切产物行1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒回收经Sal I线性化的pPIC3.5K-exCAR:Fc质粒，-20℃保存备用。

[0218] 5.2酵母GS115感受态细胞的制备

[0219] GS115感受态细胞的制备参照文献进行（S.X.Wu,G.J.Letchworth,High efficiency transformation by electroporation of pichia pastoris pretreated with lithium acetate and dithiothreitol,Bio Techiques.2004,(36)：152-154.）：从毕赤酵母GS115的YPD平板上挑取单个菌落，接种于5ml YPD培养基中，225r/min，28℃振荡培养8小时。取500μl菌液接种于含150ml YPD培养基的培养瓶中，225r/min，28℃振荡培养过夜，待其OD600达到2.0时，4℃，2000g离心5分钟收集菌体。菌体重悬于酵母感受态处理液中室温放置30分钟，4℃，1500g，离心5分钟，弃上清菌体用1M的冰山梨醇洗涤三次后，
4℃，1500g，离心5分钟收集沉淀，并用预冷的1M山梨醇重悬细胞沉淀使其细胞浓度约为
10
10 个/mL，每管80μl分装-80℃保存待用。

[0220] 5.3线性化质粒转化GS115

[0221] 线性化质粒转化GS115按Invitrogen公司操作手册进行：取80μl上述GS115感受态细胞与5～10μg经Sal I线性化的pPIC3.5K-exCAR:Fc质粒混合，移入0.1cm电转化杯，冰浴5分钟后进行电转化，电转参数：1500V，200Ω，25μF。电击后立即加入1ml冰冷的1M山梨醇，取400μl转化后的菌液涂布于不含组氨酸的MD平板，于28℃培养箱培养3～4天，观察转化子的生长情况。

[0222] 实施例6：酵母转化子的PCR鉴定

[0223] 挑取实施例5.3中MD平板上长出的菌落，提取基因组DNA做PCR鉴定，方法为：挑取菌落于5ml YPD培养液中，28℃恒温225rpm振摇12h；各取菌液100ul离心收集细胞并加入50ul ddH2O重悬细胞沉淀，于液氮和沸水中反复冻融煮沸5次，10000rpm离心5min取上清进行PCR鉴定，反应体系及引物参照实施例1.2中扩增exCAR:Fc及酵母阳性转化子鉴定的条件进行。

[0224] 结果：采用exCAR:Fc的上下游引物及酵母阳性转化子鉴定引物同时进行转化菌株筛选，共筛选到了约200个重组菌，且两对引物均能从pPIC3.5K-exCAR:Fc/GS115转化菌株中扩增出与预期大小相符的基因片段（采用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8可扩增出1359bp的exCAR:Fc片段；采用SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10可扩增出220bp的酵母基因片段及1359bp的exCAR:Fc片段，即1579bp长度的基因片段），其阳性转化子PCR鉴定结果见图5。

[0225] 实施例7：高拷贝转化子的筛选及表型鉴定

[0226] 7.1G418筛选高拷贝转化子

[0227] 将经实施例6PCR鉴定为阳性的转化子，点种于含200ulYPD培养基的96孔细胞培养板中（每个转化子设一个复孔），于28℃培养2天后每孔取10ul菌液于另一个含190ulYPD培养基的细胞培养板中，混匀并于28℃培养2天后取10ul菌液入第三块含190ulYPD培养基的细胞培养板中，28℃培养1天后各孔分别取菌液1ul点种于含不同浓度的G418-YPD平板上(G418含量为0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0mg/ml)，28℃培养3～5天，观察菌落生长情况（一般认为菌落耐受G418的浓度越高，所含的拷贝数就越高，一个拷贝能耐受0.25mg/ml G418，依次类推）。

[0228] 7.2高拷贝转化子的表型鉴定

[0229] 将经G418筛选出的高拷贝转化子及Mut+、Muts对照于28℃YPD培养基中振摇培养12h后，点种于MM和MD平板上。28℃培养3～5天并观察转化子与对照间生长速度差s异：若在MD平板上生长较快而MM平板上生长缓慢或不生长的转化子为Mut ；在MD和MM平+
板上生长速度相当的转化子为Mut。

[0230] 结果：在经PCR鉴定为阳性的约200个重组菌经G418多拷贝数筛选后，最终获得了2株能耐受2.0mg/ml G418的重组酵母菌，命名为pPIC3.5K-exCAR:Fc-1/GS115、pPIC3.5K-exCAR:Fc-2/GS115；这2株转化子有8个串联的目的基因拷贝数。

[0231] 经G418-YPD平板筛选出的2株转化子点种MM和MD平板进行表型鉴定发现，于+ s28℃培养3～5天转化子与Mut、Mut 对照在MD和MM平板上生长速度相当，说明所获的2+
株转化子表型均为Mut。

[0232] 实施例8：高拷贝阳性转化子的摇瓶诱导表达

[0233] 分别挑取经实施例7获取的2株Mut＋高拷贝转化子接种于2ml YPD培养基中，28℃振荡培养24小时，取1ml该种子液接种于100ml BMGY培养基中，28℃振荡培养24小时，至OD600达2.0～6.0后静置并弃去培养基，收集细胞沉淀，并以等体积(100ml)BMMY重悬细胞沉淀，28℃振荡培养诱导表达5天左右。在诱导过程中，每24h补充一次甲醇至终浓度1%。每天收集菌体用于目的蛋白表达情况检测。

[0234] 结 果：2 株 Mut＋ 高 拷 贝 转 化 子 pPIC3.5K-exCAR:Fc-1/GS115、pPIC3.5K-exCAR:Fc-2/GS115经BMGY培 养增 菌、BMMY培 养及 甲 醇诱 导表 达 后，pPIC3.5K-exCAR:Fc-2/GS115株诱导表达物中出现了与目的蛋白分子量吻合的蛋白条带（exCAR:Fc蛋白分子量为50.3kDa）。蛋白表达结果见图6。

[0235] 实施例9：表达蛋白exCAR:Fc的检测和纯化

[0236] 9.1表达蛋白的SDS-PAGE分析

[0237] 将经实施例8诱导表达的重组酵母菌pPIC3.5K-exCAR:Fc-2/GS115取样进行SDS-PAGE分析，电泳方法参照分子克隆实验指南（第三版，科学出版社2002[美]J.萨姆布鲁克，D.W拉塞尔著，黄培堂等译）进行，积层较浓度为5%，分离胶浓度为10%，100V恒压跑约2小时。

[0238] 9.2表达蛋白的纯化

[0239] 将经实施例8诱导表达后的重组酵母菌pPIC3.5K-exCAR:Fc-2/GS115于4℃、4500rpm，离心5分钟收集菌体，并用缓冲液（20mM Na2HPO4,0.15mM NaCl,pH8.0）重悬菌体置于冰上超声，超声条件为：超5s、停10s，超声10分钟。超声后4500rpm离心收集破菌上清，复红染色并观察破菌率；破菌上清采用Protein A亲和层析法初步纯化，方法按说明书进行。粗纯蛋白于4℃0.1M PBS（pH7.4）中透析48小时后，超滤浓缩至浓度约为1mg/mL再采用Sephadex G-250进行凝胶层析进一步纯化。纯化蛋白经超滤浓缩、过滤除菌后-80℃保存。

[0240] 结果：重组菌pPIC3.5K-exCAR:Fc-2/GS115经超声破菌其破菌率大于95%；破菌上清经ProteinA亲和层析及凝胶层析后，蛋白纯度可达96%。纯化结果见图7。

[0241] 实施例10：表达蛋白的Western-blot鉴定

[0242] 10.1电泳：按实施例9.1进行表达蛋白的SDS-PAGE电泳。

[0243] 10.2蛋白的转膜：采用湿转印法转膜，方法为：将含表达蛋白泳道的凝胶、NC膜和滤纸放入电转缓冲液中浸泡10～20分钟后，按负极-垫层-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-垫层-正极顺序安装转膜夹板（放置各层均用玻璃棒擀平排除气泡），100V恒压，于4℃电转1.5小时。

[0244] 10.3转膜效果检查：将电转后NC膜放入丽春红S染液中染色5分钟，水中脱色至蛋白条带可见，继续冲洗至完全脱色。

[0245] 10.4封闭：将经染色鉴定蛋白转膜成功的NC膜放入5%脱脂奶粉的PBST中，37℃振摇封闭1h，PBST振摇洗膜三次，每次10分钟。

[0246] 10.5孵育一抗：加入羊抗人CAR抗体，37℃振摇孵育1h，PBST振摇洗膜三次，每次10分钟。

[0247] 10.6孵育二抗：加入HRP-兔抗羊IgG，37℃振摇孵育1h，PBST振摇洗膜三次，每次10分钟。

[0248] 10.7显色：DAB显色确定膜上有无特异性蛋白条带，水冲洗终止显色反应。

[0249] 10.8将膜置37℃烤干，用干净滤纸夹放保存。

[0250] 结果：经Western-blot鉴定，表达蛋白能特异的与人源性CAR抗体结合，并考虑到其能与葡萄球菌A蛋白结合的特性，以及表达蛋白分子量与融合蛋白的分子量完全一致，可明确认定表达蛋白为融合蛋白exCAR:Fc。表达蛋白的Western-blot结果见图8。

[0251] 实施例11：纯化蛋白N端测定

[0252] 11.1纯化蛋白电泳：参照实施例9.1进行纯化蛋白的SDS-PAGE电泳。

[0253] 11.2蛋白的转膜：采用湿转印法转膜，方法为：将PVDF膜放入100%甲醇中浸泡15s后，将含纯化蛋白泳道的凝胶、PVDF膜和滤纸放入CAPS电转缓冲液中浸泡20分钟分钟后，按负极-垫层-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-垫层-正极顺序安装转膜夹板（每放置一层后用玻璃棒擀平排除气泡），100V恒压，4℃电转1.5小时。

[0254] 11.3PVDF膜染色和脱色：将电转后的PVDF放入超纯水中清洗2次，丽春红S染色液中染色30～50s后，用50%甲醇脱色至背景清晰，去离子水洗涤并晾干。

[0255] 11.4蛋白质N端测序：将处理好后的PVDF膜封装并送中国科学院上海生命科学研究院蛋白质组学研究分析中心测序。

[0256] 结果：经蛋白质N端测序鉴定，表达蛋白N端的15位氨基酸残基与推导的蛋白质氨基酸残基（SEQ ID NO:4）完全一致，证明表达蛋白确为目的蛋白exCAR:Fc且其N端未发生降解，纯化蛋白N端测序结果见图9A至图9C。

[0257] 实施例12：纯化表达蛋白产量的初步估算

[0258] 蛋白浓度测定采用Bradford法，具体步骤按天根生物有限公司Bradford法测定蛋白质浓度试剂盒说明书进行。据推算在未上发酵罐的情况下，摇瓶培养诱导的重组蛋白产量约为35mg/L。

[0259] 实施例13：表达蛋白阻断腺病毒感染Hela细胞效应

[0260] 13.1细胞准备

[0261] 复苏冻存的Hela细胞株，用完全培养基DMEM/F12（DF）+10%FBS于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞生长至80%时，以0.25%的胰酶消化下细胞后以完全培养基调节细5
胞密度为1×10/ml，接种于24孔培养板，1ml/孔；置37℃，5%CO2培养箱中培养待细胞长至
70～80%。

[0262] 13.2纯化蛋白exCAR:Fc阻断腺病毒感染Hela细胞效应实验

[0263] 将腺病毒与不同浓度的融合蛋白exCAR:Fc共孵育并作用于Hela细胞，通过观察细胞荧光强度来初步检测融合蛋白阻断腺病毒感染的效应（一般24小时后已经开始出现荧光，荧光强度即以细胞的绿色荧光蛋白（EGFP）表达阳性率判定）。

[0264] 13.2.1实验分组：将24孔板上培养长至70～80%的Hela细胞进行分组：

[0265] ①对照组：为正常条件下培养的Hela细胞。

[0266] ②腺病毒感染组：Hela细胞每孔加入6μl含100MOI的adEasy-1腺病毒，37℃，5%CO2孵育1h，弃上清，加含5%FBS的DF培养液1ml/孔；37℃，5%CO2培养。

[0267] ③BSA对照组：Hela细胞每孔分别加入含BSA的DF培养液，使其终浓度分别为0.01ug/ml，0.1ug/ml，0.5ug/ml，1ug/ml,2ug/ml，4ug/ml,8ug/ml,16ug/ml，然后各孔加入
6μl含100MOI的adEasy-1腺病毒，37℃，5%CO2孵育1小时，弃上清，加含5%FBS的DF培养液1ml/孔，37℃，5%CO2培养，每浓度梯度作2孔平行。

[0268] ④融合蛋白exCAR:Fc阻断组：Hela细胞每孔加入含exCAR:Fc蛋白的DF培养液，使其终浓度梯度分别为0.01ug/ml，0.1ug/ml，0.5ug/ml，1ug/ml,2ug/ml，4ug/ml,8ug/ml,16ug/ml，然后各孔加入6μl含100MOI的adEasy-1腺病毒，37℃，5%CO2孵育1h，弃上清，加含5%FBS的DF培养液1ml/孔，37℃，5%CO2培养，每浓度梯度作2孔平行。

[0269] 13.2.2最佳荧光观测时相点的选择：以病毒感染后12h、24h、48h、72h为时相点观察细胞荧光强度，并选择其中最佳观测时相点判定融合蛋白对病毒的阻断效果。

[0270] 结果：采用纯化蛋白exCAR:Fc阻断adEasy-1腺病毒感染Hela细胞的实验，发现在所选择的最佳荧光观察时相点48h时，所选取的蛋白浓度在2～16ug/ml，与BSA对照组相比细胞荧光强度（即EGFP表达水平）明显降低，表明该融合蛋白exCAR:Fc能明显阻断腺病毒对Hela细胞的感染，具有很高的生物活性。详见图10。

[0271] 实施例14：表达蛋白阻断柯萨奇病毒感染Hela细胞效应

[0272] 14.1细胞的准备步骤同实施例13.1。

[0273] 14.2实验分组：将24孔板上培养的Hela细胞进行分组：

[0274] ①正常细胞对照组：将经培养长至孔底70～80%的Hela细胞弃培养基，每孔加入200μl DF培养基，37℃，5%CO2孵育2h后加入200μl含2%FBS的DF培养基，37℃，5%CO2孵育。

[0275] ②CoxB3病毒感染组：将经培养长至孔底70～80%的Hela细胞弃培养基，每孔加-5入200μl含0.2μl CoxB3病毒（TCID50为10 /0.1ml）的DF培养基，37℃，5%CO2孵育2小时后加入200μl含2%FBS的DF培养基，37℃，5%CO2孵育。

[0276] ③BSA对照组：将经培养长至孔底70～80%的Hela细胞弃培养基，每孔分别加入含不同BSA浓度（0.01ug/ml，0.1ug/ml，0.5ug/ml，1ug/ml,2ug/ml，4ug/ml,8ug/ml,16ug/-5ml）和含0.2μl CoxB3病毒（TCID50为10 /0.1ml）的DF培养基200μl，37℃，5%CO2孵育
2h后加入200μl含2%FBS的DF培养基，37℃，5%CO2孵育，每浓度梯度作2孔平行。

[0277] ④融合蛋白exCAR:Fc阻断组：将经培养长至孔底70～80%的Hela细胞弃培养基，每孔分别加入含不同exCAR:Fc蛋白浓度（0.01ug/ml，0.1ug/ml，0.5ug/ml，1ug/ml,2ug/-5ml，4ug/ml,8ug/ml,16ug/ml）和含0.2μl CoxB3病毒（TCID50为10 /0.1ml）的DF培养基
200μl，37℃，5%CO2孵育2小时后加入200μl含2%FBS的DF培养基，37℃，5%CO2孵育，每浓度梯度作2孔平行。

[0278] 14.3MTT法测细胞活性

[0279] 待CoxB3病毒感染组细胞出现约80%细胞病变而正常组细胞状态良好时，观察BSA对照组和exCAR:Fc蛋白阻断组各孔细胞病变情况，并加入100μlMTT(5mg/ml)37℃避光孵育4h，弃尽上清每孔加入500μl DMSO振荡混匀10min使结晶物充分融解，每孔各吸100μl入96孔板，酶标仪测定A570光吸收值。

[0280] 14.4计算蛋白对病毒的抑制率（IR）

[0281] 蛋白对病毒的抑制率公式：

[0282]

[0283] 结果：采用纯化蛋白exCAR:Fc阻断CoxB3病毒对Hela细胞的感染，各浓度BSA对照组对病毒感染均无保护作用，而蛋白保护组当蛋白浓度达2ug/ml时对病毒的抑制率可达62.3%左右，表明该融合蛋白exCAR:Fc能明显阻断CoxB3病毒对Hela细胞的感染，具有很高的生物活性。蛋白浓度及相应抑制率详见表1、图11。

[0284] 表1蛋白exCAR:Fc对CoxB3病毒感染Hela抑制率

[0285]

[0286] 该蛋白能与柯萨奇病毒/腺病毒产生高亲和力的结合，阻止柯萨奇病毒/腺病毒对机体细胞特别是表达CAR的细胞如心肌细胞的感染，本融合蛋白可用于柯萨奇病毒和/或腺病毒感染性疾病的治疗。

[0287] 本发明将人源性柯萨奇病毒/腺病毒受体的胞外区与IgG1的Fc段构建为融合蛋白，使融合蛋白即具有与病毒的高结合力，又能有效地与吞噬细胞膜上的Fc受体结合促进病毒的吞噬和清除。

[0288] 虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。