一种耐高温铁超氧化物歧化酶及其结晶方法

摘要

本发明涉及一种耐高温铁超氧化物歧化酶及其结晶方法。本发明利用基因重组技术将耐高温FeSOD基因构建到载体pET28a上，通过将重组载体pET-28a-FeSOD导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达，利用亲和层析和离子交换层析的方法纯化重组目的蛋白，得到纯度达到95%以上的目的蛋白，再通过结晶试剂盒筛选目的蛋白的结晶条件，得到蛋白晶体。本发明所提供的结晶方法流程简单，且获得的晶体分辨率高。

权利要求

1.一种耐高温铁超氧化物歧化酶的结晶方法，其特征在于，通过基因重组技术构建重组载体pET-28a-FeSOD并导入大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达获得重组目的蛋白，再利用亲和层析和离子交换层析的方法纯化该重组目的蛋白，然后通过结晶试剂盒筛选重组目的蛋白的结晶条件，即可得到耐高温铁超氧化物歧化酶的蛋白晶体，其中耐高温铁超氧化物歧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述方法包括以下步骤：(a)通过设计引物，以嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus)基因组DNA为模板，由PCR扩增方法获取耐高温FeSOD基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示；

(b) 将步骤(a)所得耐高温FeSOD基因经Nde I和EcoR I双酶切后，连接到经同样处理的pET28a载体上，构建重组表达载体pET-28a-FeSOD，将重组载体pET-28a-FeSOD导入大肠杆菌BL21 (DE3)，获得基因重组工程菌E.coli/pET-28a-FeSOD，将重组基因工程菌于

37℃、220rpm下培养至OD600为0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度为1mM，继续培养3-5个小时，收集菌液，获得大量重组目的蛋白；

(c)将步骤(b)得到的重组目的蛋白上清通过0.45μm纤维素膜过滤，然后利用Ni柱亲和层析法和离子交换层析法纯化重组目的蛋白，得到纯度达到95%以上的重组目的蛋白；

(d)将将步骤(c)纯化后的重组目的蛋白进行浓缩，用BCA法蛋白定量试剂盒来测定重组目的蛋白浓度，当浓度达到5-8mg/ml时，用蛋白质结晶试剂盒来筛选结晶条件，得到TM蛋白晶体，其中所述蛋白质结晶试剂盒购自Hampton Research公司，结晶条件为Index TM TM TM TMHR2-14461、Index HR2-144 63、Index HR2-144 87、Index HR2-14488、Index TM TM

HR2-14494、PEG/lon2 Screen HR2-0985、PEG/lon2 Screen HR2-0987、PEG/lon2 ScreenTM TM TM HR2-09813、PEG/lon2 Screen HR2-09819、Crystal Screen2 HR2-11248；

(e)将将步骤(d)形成的蛋白晶体，利用显微镜以及Ｘ射线晶体衍射仪进行鉴定。

说明书

一种耐高温铁超氧化物歧化酶及其结晶方法

技术领域

[0001] 本发明涉及DNA重组技术和蛋白质技术领域，特别是涉及一种耐高温铁超氧化物歧化酶及其结晶方法。

背景技术

[0002] 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，简称SOD)作为一种广泛存在于生物体细胞内，具有防御氧化损伤作用的金属酶，与机体衰老、肿瘤发生、自身免疫性疾病和辐射防护等有关，且在医药、保健品、食品添加剂和化妆品等领域均具有重要的应用价值。

[0003] SOD广泛存在于生物界，最初生产的SOD的原料也是动物血，但是此来源提纯的工艺繁琐，操作困难，且得到的产品活性低，纯度也低。利用基因工程技术，许多热稳定性较好的SOD成功地在常温宿主内进行了大量表达，从而大幅度降低了生产成本，扩展了生产应用。

[0004] 蛋白质在体外较难保持其生物学活性的完整性，然而以晶体结构存在的蛋白质一般活性都是比较稳定的。收集和分析X射线衍射蛋白质晶体的数据，就能解析出该蛋白质的高级结构。本发明所述的方法是该种耐高温铁超氧化物歧化酶的首次结晶，国内外均无报道。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种耐高温铁超氧化物歧化酶及其结晶方法。

[0006] 为达到上述目的，本发明提供一种耐高温铁超氧化物歧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

[0007] 为达到上述目的，本发明提供一种上述耐高温铁超氧化物歧化酶的结晶方法，所述方法通过构建重组载体pET-28a-FeSOD并导入大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达获得重组目的蛋白，再利用亲和层析和离子交换层析的方法纯化该重组目的蛋白，然后通过结晶试剂盒筛选重组目的蛋白的结晶条件，即可得到耐高温铁超氧化物歧化酶的蛋白晶体。

[0008] 上述方法包括以下步骤：

[0009] (a)通过设计引物，以嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus)基因组DNA为模板，由PCR扩增方法获取耐高温FeSOD基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示；

[0010] (b)将步骤(a)所得耐高温FeSOD基因连接到pET28a载体上，构建重组表达载体pET-28a-FeSOD，并导入大肠杆菌BL21 (DE3)中，诱导表达获得大量重组目的蛋白；

[0011] (c)将步骤(b)得到的重组目的蛋白上清通过0.45μm纤维素膜过滤，然后利用Ni柱亲和层析法和离子交换层析法纯化重组目的蛋白，得到纯度达到95%以上的重组目的蛋白(具有极高的耐热性，耐热温度可达90℃)；

[0012] (d)将将步骤(c)纯化后的重组目的蛋白进行浓缩，用BCA法蛋白定量试剂盒来测定重组目的蛋白浓度，当浓度达到5-8mg/ml时，用蛋白质结晶试剂盒来筛选结晶条件，得到蛋白晶体；

[0013] (e)将将步骤(d)形成的蛋白晶体，利用显微镜以及Ｘ射线晶体衍射仪进行鉴定。

[0014] 优选地，其中所述步骤(b)的具体操作为：将步骤(a)所得耐高温FeSOD基因经Nde I和EcoR I双酶切后，连接到经同样处理的pET28a载体上，构建重组表达载体pET-28a-FeSOD，将重组载体pET-28a-FeSOD导入大肠杆菌BL21 (DE3)，获得基因重组工程菌E.coli/pET-28a-FeSOD，将重组基因工程菌于37℃、220rpm下培养至OD600为0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度为1mM，继续培养3-5个小时，收集菌液，获得大量重组目的蛋白。

[0015] 优选地，其中所述步骤(d)的蛋白质结晶试剂盒购自Hampton Research公司，TM TM TM结晶条件为Index HR2-14461、Index HR2-144 63、Index HR2-144 87、Index TM TM TM
HR2-14488、Index HR2-14494、PEG/lon2 Screen HR2-0985、PEG/lon2 ScreenTM TM TM
HR2-0987、PEG/lon2 Screen HR2-09813、PEG/lon2 Screen HR2-09819、Crystal
TM
Screen2 HR2-11248。

[0016] 本发明具有以下有益效果：本发明所提供的结晶方法流程简单，且获得的晶体分辨率高，为研究该种蛋白质的三维结构和功能提供重要的条件。

附图说明

[0017] 图1是耐高温铁超氧化物歧化酶的诱导表达图；M：低分子质量蛋白质标准；1：只含pET28a载体的重组菌诱导；2：未诱导重组菌；3；诱导后重组菌；

[0018] 图2是耐高铁超氧化物歧化酶纯化后的电泳分析图；M：低分子质量蛋白质标准；1：诱导表达后的大肠杆菌超声破碎后上清溶液；2：纯化后的目的蛋白；

[0019] 图3 A是耐高温铁超氧化物歧化酶的一级鉴定质谱图；

[0020] 图3 B是耐高温铁超氧化物歧化酶的二级鉴定质谱图；

[0021] 图4是可见光下耐高温铁超氧化物歧化酶的晶体图；

[0022] 图5是紫外光照射下耐高温铁超氧化物歧化酶的晶体图；

[0023] 图6是耐高温铁超氧化物歧化酶晶体的Ｘ射线衍射图。

具体实施方式

[0024] 应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的发明。除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义，本说明书中未注明具体条件的实验方法是按常规实验方法；本说明书中所用的试验材料如无特别说明均为市售购买产品，各种试剂和培养基的成分和配制方法可参见常规实验手册中的操作。

[0025] 下面结合实施例详细阐述本发明的具体内容。

[0026] 实施例1：耐高温FeSOD基因的获得

[0027] 为了去除基因中的内含子，根据NCBI上P.vivax SalI的序列(基因登录号：HM992934.1)设计两对引物。

[0028] 上游引物：5’-TTACATATGCGTGGGGCAAGCACGGA-3’

[0029] 下游引物：5’-GCGAATTCTTAAAACGGCTGCCAACG-3’

[0030] 以嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus)基因组DNA(中国农业科学院赠送)为模板，进行PCR扩增，具体程序和反应体系如下：

[0031] 反应程序：

[0032]

[0033] 反应体系：

[0034]

[0035] 将PCR产物用Nde I(Fermentas公司)和EcoR I (Fermentas公司)两种酶进行双酶切，回收酶切后产物。

[0036] 实施例2：重组表达载体pET-28a-FeSOD的构建

[0037] 将PCR产物与pET-28a载体同时双酶切(Nde I、EcoRI)，将酶切回收的片段用T4 DNA高效连接酶( Fermentas公司)连接，连接产物转化大肠杆菌TG1感受态细胞(购自Invitrogen公司)，挑取单菌落摇菌培养后提取重组表达载体pET-28a-FeSOD，利用PCR和双酶切鉴定，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

[0038] 实施例3：基因重组工程菌E.coli/pET-28a-FeSOD 的诱导表达以及产物的纯化[0039] 将实施例2鉴定成功的重组表达载体pET-28a-FeSOD转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞(购自Invitrogen公司)，挑斑至LB培养基中摇菌培养至OD600约为0.6(37℃，220rpm)时，加IPTG(购自Promega公司，终浓度为1mM)诱导表达。收集的蛋白经SDS-PAGE电泳检测是否表达(图1)。大量诱导重组菌体，离心收集菌体，每100ml菌体用5mlPBS重悬后进行超声破碎。12000rpm离心收集上清，经0.45μm滤膜过滤后利用Ni柱亲和层析法和离子交换层析法纯化重组目的蛋白(图2)。将纯化后的重组目的蛋白进行LTQ质谱鉴定(图3A及图3B)，结果表明该蛋白是耐高温铁超氧化物歧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

[0040] 实施例4：蛋白质结晶

[0041] 将实施例3纯化后的重组目的蛋白浓缩，用BCA法蛋白定量试剂盒(购自BioTake公司)来测定重组目的蛋白浓度，当浓度达到5-8mg/ml时，用结晶试剂盒(购自Hampton Research公司)来筛选结晶条件。总共1008个蛋白质结晶条件。具体步骤如下：

[0042] 1)对16孔晶体培养板上的小孔进行编号，每一个编号小孔对应一个蛋白质试剂盒筛选的条件；

[0043] 2)向16孔晶体培养板上的每个孔中依次加入200μL不同试剂盒中不同条件的结晶缓冲液；

[0044] 3)在上述加入结晶缓冲液的小孔边缘上均匀涂满一圈封闭液(凡士林)；

[0045] 4)用结晶专用移液器吸取1μL的蛋白样品，然后滴在硅化盖玻片上，每个盖玻片上点2-3个不同浓度的蛋白样品；

[0046] 5)向上述盖玻片上的蛋白样品滴入1μＬ的晶体缓冲液，将其混匀，并做好标记；

[0047] 6)将上述滴有蛋白样品和结晶缓冲液的盖玻片翻转垂直盖于16晶体孔培养板的相应小孔上；

[0048] 7)用灭菌的小枪头将盖玻片轻轻压于小孔的边缘，确保盖玻片与小孔之间密封；

[0049] 8)等加完所有的蛋白质样品和结晶缓冲液之后，将16孔板的板盖盖上，然后将蛋白晶体培养板放于16℃的晶体培养室中培养；

[0050] 9)每天在显微镜下观察晶体是否形成，第十五天时，发现有晶体状物质形成，TM TM TM结晶条件为Index HR2-14461、Index HR2-144 63、Index HR2-144 87、Index TM TM TM
HR2-14488、Index HR2-14494、PEG/lon2 Screen HR2-0985、PEG/lon2 ScreenTM TM TM
HR2-0987、PEG/lon2 Screen HR2-09813、PEG/lon2 Screen HR2-09819、Crystal
TM
Screen2 HR2-11248。

[0051] 实施例5：蛋白质晶体的鉴定

[0052] 将实施例4形成的蛋白晶体在可见光下观察，看到规则的晶体状物质(图4)，然后在紫外光的照射下观察，蛋白质晶体泛白光(图5)，为了进一步证明所形成的晶体是蛋白质结晶，将该蛋白晶体用吸附棒捞出，放到RigakuX射线晶体衍射仪中进行衍射。结果证明是FeSOD蛋白晶体，X射线衍射分辨率为2.5Å(图6)。

[0053] 以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术中的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些润饰和改进也应属于本发明的专利保护范围。