一种木聚糖酶及其编码基因和应用

摘要

本发明涉及一种木聚糖酶及其编码基因和应用。本发明还涉及含有所述编码基因的表达载体和宿主细胞。本发明还涉及利用所述木聚糖酶形成还原糖的方法。本发明的木聚糖酶具有高的酶活且在宽的pH范围内有良好的稳定性，可方便地应用于工业生产。

权利要求

1.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽是：氨基酸序列如SEQ ID NO:2的多肽。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它的核苷酸序列选自下组：(1)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。

4.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2-4任一所述的多核苷酸。

6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体，或其基因组中整合有权利要求2-4任一所述的多核苷酸。

7.一种权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：(a)培养权利要求6所述的宿主细胞；

(b)从(a)培养物中分离出权利要求1所述的多肽。

8.权利要求1所述的多肽的用途，用于形成还原糖。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的还原糖是：低聚木糖。

10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的多肽用于水解底物，从而形成还原糖，所述的底物是：木聚糖。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的木聚糖是：桦木木聚糖和山毛榉木聚糖。

12.权利要求1所述的多肽的用途，用于：作为纸浆漂白或脱墨过程中的添加物；

作为饲料添加物；

作为食品工业中面团加工、面包加工的添加物；

作为乙醇工业生产的添加物；或

纤维素的脱胶过程。

13.一种组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽以及食品学或工业上可接受的载体。

14.如权利要求13的组合物，其特征在于，还含有调节酶活性的添加物。

15.如权利要求14的组合物，其特征在于，所述的调节酶活性的添加物是提高酶活性的添加物，选自：Triton X-100或β-mercaptoethanol。

16.如权利要求14的组合物，其特征在于，所述的调节酶活性的添加物是抑制酶活性

2+ 2+

的添加物，选自：N-bromosuccinimide，SDS，Hg 或Cu 。

17.一种形成还原糖的方法，其特征在于，该方法包含：用权利要求1所述的多肽处理待水解的底物，所述的底物包括：木聚糖，或含木聚糖的物质。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，在pH3.5-9.0条件下，用权利要求1所述的多肽处理待水解的底物。

19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，在温度20-70℃条件下，用权利要求1所述的多肽处理待水解的底物。

20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，用权利要求1所述的多肽处理的同时，还加入调节酶活性的添加物。

说明书

一种木聚糖酶及其编码基因和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种新型木聚糖酶及其编码基因和应用。 [0002] 背景技术

[0003] 木聚糖约占地球上可再生有机碳总量的三分之一，是自然界中最丰富的生物质资源之一。木聚糖是植物细胞壁中半纤维素的主要成份，可占硬木材细胞壁重量的15-30%、软木材的7-10%，在一些一年生植物中甚至能占到30%。木聚糖的主链由β-D-吡喃木糖残基通过β-1,4-糖苷键连接而成，支链根据其来源在取代基种类和组成上有所不同。一些常见的侧链残基包括α-L-呋喃阿拉伯糖，4-O-甲基葡萄糖醛酸，L-阿拉伯糖等。 [0004] 木聚糖酶是能将木聚糖分解成木糖的一类酶的统称。由于组成木聚糖残基的多样性以及木聚糖支链的复杂性，完全分解木聚糖需要一系列水解酶的共同作用。其中包括内切-β-1，4-D-木聚糖酶(endo-β-1,4-D-xylanase，EC3．2．1．8)，该酶从木聚糖主链内部随机将其切断生成木二糖和木三糖等寡糖和少量木糖。β-D-木糖苷酶(β-xylosidase，EC3．2．1．37)，从寡聚木糖或木二糖的非还原端释放木糖。除了水解木聚糖主链的酶外还有一些酶参与木聚糖侧链残基的水解，它们包括α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase，E.C.3.2.1.55)、α-D-葡糖醛酸酶(α-D-glucuronidase，EC3.2.1.139)、乙酰木聚糖酯酶(acetyl xylan esterases，E.C.3.1.1.72)等。以上这些酶中，内切-β-1，4-D-木聚糖酶主要负责木聚糖主链骨架的降解，是木聚糖降解酶系中的关键酶，也是当前木聚糖酶研究的热点。

[0005] 木聚糖在造纸、饲料、食品、纺织等工业中有着广泛应用。第一，近年来，制浆造纸工业成为应用木聚糖酶最多的行业，在漂白过程中使用木聚糖酶能够保证在不降低纸浆强度的条件下减少碱用量和后续的氯用量。减少了废液中有机氯的含量，降低造纸业对环境的污染程度。在废纸回收利用的脱墨阶段，木聚糖酶的应用能够促进新闻废纸浆的脱油脱墨。与传统化学法脱墨相比，酶法脱墨能提高白度和降低残留油墨量。第二，在饲料工业中，通过在饲料中添加 木聚糖酶可以降解食料中的阿拉伯木聚糖分子，降低消化道中的食糜粘度，从而促进营养物质的消化吸收。此外，木聚糖水解所产生的低聚木糖还能够调节动物肠道微环境、增强动物的抗病性和减少兽药的使用量。第三，在食品工业中木聚糖酶可以改善面团的机械加工性能，改善面包的弹性以及延缓面包的老化。木聚糖酶可以降解粮食淀粉层外围的木聚糖包被，有利于淀粉层暴露在淀粉酶下，提高淀粉利用率，增加酒精的产率。第四，在纺织工业中，木聚糖酶被应用于亚麻、大麻、苎麻等纤维素的脱胶过程，以减少或替代化学混麻方法。

[0006] 木聚糖在工业上的广泛应用促进了各国研究者对高酶活，特异性木聚糖酶的研究。目前已从多种生物中分离纯化出具有不同特性的木聚糖酶，已报道的产木聚糖酶的微生物包括细菌、放线菌、真菌以及藻类，但是昆虫及其共生生物来源的木聚糖酶现在还鲜有报道。白蚁虽然给人类造成很大的损失，但它同时也是生态系统中非常重要的一员，在生物圈碳循环中发挥着重要作用。白蚁能同化超过90％的食物，降解半纤维素的效率达到65-87％。白蚁及其肠道原虫形成的共生系统被认为是地球上高效降解木质纤维素的生物反应器之一。白蚁的消化道一般分为三个部分，前肠、中肠和后肠。通过对白蚁肠道木聚糖
3 5
酶活的分析发现，其木聚糖酶活主要集中在后肠。后肠栖息着10-10 个原虫，这些原虫占后肠体积的90％以上。这些生物参与木质纤维素的消化过程并为白蚁提供营养，与宿主形成紧密的共生关系。白蚁肠道共生生物是筛选可用于工业生产的功能基因的潜在来源。 [0007] 传统的木聚糖酶发掘方法包括利用选择性培养基富集微生物，总蛋白的分离纯化等方法，但这些方法受微生物能否培养以及样品数量的制约。元基因组、元转录组技术的应用为从不可培养微生物中发掘功能基因提供了方法。元转录组学将环境微生物的所有转录本作为一个整体来研究，不受基因组信息是否已知的限制，能够从基因表达谱层面获取生物体代谢的全部功能基因集合。通过转录组的功能注释就能够获得相关功能基因的序列。
结合全长cDNA文库，利用序列特异性引物进行PCR筛选，就能获得新的功能基因。 发明内容

[0008] 本发明的目的在于提供一种新功能基因的克隆方法。

[0009] 本发明的目的在于提供一种新型木聚糖酶及其编码基因和应用。 [0010] 本发明的目的在于提供包括木聚糖酶基因的表达载体和宿主细胞，基因的 表达和蛋白纯化方法，以及重组蛋白的酶学特性和功能特征。

[0011] 在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组： [0012] (a)如SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

[0013] (b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；

[0014] (c)具有(a)多肽功能的SEQ ID NO：2的蛋白片段(较佳地，其与SEQ IDNO：2的序列相同性高于72％；更佳地高于75％；更佳地高于80％；更佳地高于85％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％或99％)。

[0015] 在一个优选例中，所述的多肽来源于白蚁肠道共生原虫。

[0016] 在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

[0017] (1)编码所述多肽的多核苷酸；

[0018] (2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。

[0019] 在另一优选例中，该多核苷酸编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。 [0020] 在另一优选例中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。 [0021] 在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。 [0022] 在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

[0023] 在本发明的另一方面，提供一种所述的多肽的制备方法，该方法包含： [0024] (a)培养所述的宿主细胞；

[0025] (b)从培养物中分离出所述的多肽。

[0026] 在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于形成还原糖(简单糖)。 [0027] 在另一优选例中，所述的还原糖是：低聚木糖或木寡糖。

[0028] 在另一优选例中，所述的多肽用于水解底物，从而形成还原糖，所述的底物是：木聚糖，或含木聚糖的物质(如半纤维素)。

[0029] 在另一优选例中，所述的木聚糖是：桦木木聚糖和山毛榉木聚糖。 [0030] 在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于：

[0031] 作为纸浆漂白或脱墨过程中的添加物(用以在不降低纸浆强度的条件下减少碱用量和后续的氯用量，减少废液中有机氯的含量，降低造纸业对环境的污 染程度)； [0032] 作为饲料添加物(用以降解食料中的木聚糖分子，降低消化道中的食糜粘度，从而促进营养物质的消化吸收)；

[0033] 作为食品工业中面团加工、面包加工的添加物(用以改善面团的机械加工性能、改善面包的弹性或延缓面包的老化)；

[0034] 作为乙醇工业生产的添加物(用以降解粮食淀粉层外围的木聚糖包被、提高淀粉利用率、增加乙醇产率)；或

[0035] 纤维素的脱胶过程(用以减少或替代化学混麻方法)。

[0036] 在本发明的另一方面，提供一种组合物，它含有安全有效量的所述的多肽以及食品学或工业上可接受的载体。

[0037] 在另一优选例中，所述的组合物还含有调节酶活性的添加物。

[0038] 在另一优选例中，所述的调节酶活性的添加物是提高酶活性的添加物；较佳地选自：Triton X-100或β-mercaptoethanol；或

[0039] 所述的调节酶活性的添加物是抑制酶活性的添加物；较佳地选自：2+ 2+ 2+ 2+
N-bromosuccinimide，SDS，Hg 或Cu ；或在添加至底物后可水解形成Hg 或Cu 的物质。 [0040] 在本发明的另一方面，提供一种形成还原糖的方法，该方法包含：用所述的多肽处理待水解的底物，所述的底物包括：木聚糖，或含木聚糖的物质。

[0041] 在一个优选例中，所述的木聚糖是：桦木木聚糖和山毛榉木聚糖。 [0042] 在另一优选例中，在pH3.5-9.0(较佳地是PH4.0-8.5；更佳地是PH5.0-7.5；更佳地是PH5.5-7.0；最佳地是PH6.0)条件下，用所述的多肽处理待水解的底物。 [0043] 在另一优选例中，在温度20-70℃(较佳地是45-55℃；最佳地是50℃)条件下，用所述的多肽处理待水解的底物。

[0044] 在另一优选例中，用所述的多肽处理的同时，还加入调节酶活性的添加物。 [0045] 在另一优选例中，用所述的多肽处理的同时，还加入调节酶活性的添加物。 [0046] 在另一优选例中，所述的调节酶活性的添加物是提高酶活性的添加物；较佳地选自：Triton X-100或β-mercaptoethanol；或所述的调节酶活性的添加物是抑制酶活性的2+ 2+
添加物；较佳地选自：N-bromosuccinimide，SDS，Hg 或Cu ；或在添加至底物后可水解形
2+ 2+
成Hg 或Cu 的物质。

[0047] 在另一优选例中，加入所述的Triton X-100或β-mercaptoethanol的浓度是5±0.5mM；较佳地5+0.2mM；更佳地5+0.1mM；最佳地为5mM。

[0048] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

[0049] 图1为cDNA文库序列筛选流程图。

[0050] 图2为cDNA文库序列筛选PCR电泳图。其中，泳道H3，H4和G3分别为96孔板中对应的孔，仅从H4孔中扩增出目的基因片段。

[0051] 图3为重组毕赤酵母KM71H-xyl5235菌体PCR后的电泳图。泳道1-4分别代表4个阳性克隆。

[0052] 图4为木聚糖酶基因xyl5235在甲醇条件下诱导表达(左图)、表达产物的纯化(右图)SDS-PAGE图。其中左图泳道1为蛋白分子量标准，泳道2-7分别为诱导1-6天发酵液上清中的蛋白；右图泳道1为蛋白分子量标准，泳道2为诱导6天后上清，泳道3为200mM咪唑洗脱液。

[0053] 图5为Xyl5235在不同pH条件下的酶活力曲线。

[0054] 图6为Xyl5235的pH耐受性测定结果。

[0055] 图7为Xyl5235在不同温度条件下的酶活力曲线。

[0056] 图8为Xyl5235对不同温度的耐受性测定结果。

[0057] 图9为不同化学试剂及金属离子对Xyl5235酶活的影响。

具体实施方式

[0058] 本发明人通过对白蚁肠道原虫进行大规模转录本测序和注释，获得了原虫参与木聚糖降解代谢活动的功能基因信息，从中筛选到一个来源于原虫的木聚糖酶基因。体外表达并纯化后证实这个酶具有木聚糖酶活性，在酸性pH范围内具有较高酶活且在较宽pH范围内有较好稳定性，可方便地应用于工业生产。所述的木聚糖酶的氨基酸序列与已知氨基酸序列均不同，证明其是一种新的蛋白。

[0059] 转录本测序和cDNA文库序列筛选技术的结合，能有效克服极端环境微生物难于培养的缺陷，获得微生物群落中的功能基因。这些遗传信息就包括了群落中所有参与生物转化的基因，这些基因编码的酶在克隆宿主中的表达可以用于各种与生物转化相关的酶的筛选，从而有可能获得新的基因。

[0060] 众所周知，针对不同用途需要使用不同性质的木聚糖酶，而不同性质的木聚糖酶极有可能蕴藏于自然界不同生态环境下的微生物基因组中。白蚁作为自然生态系统中木质纤维素的重要降解者，其肠道共生微生物群落在纤维素物质转化过程中起到了关键作用。鉴于白蚁肠道生态系统的高效性、独特性和复杂性，本发明以白蚁作为木聚糖酶筛选的对象，利用元转录组学结合cDNA文库序列筛选技术进行筛选，对其基因和转录本信息进行挖掘，最终找到了本发明的木聚糖酶。

[0061] 本发明的木聚糖酶可作用于木聚糖长链分子的内部，作用于木聚糖主链内部的β-1，4-木糖苷键，将大分子多聚木糖水解为还原糖(如木寡糖)。

[0062] 如本文所用，术语“本发明的多肽”、“本发明的蛋白”、“本发明的木聚糖酶”、“Xyl5235蛋白”、“Xyl5235多肽”或“木聚糖酶Xyl5235”可互换使用，都指具有木聚糖酶Xyl5235氨基酸序列(SEQ ID NO：2或其变异形式或衍生物)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的木聚糖酶Xyl5235。

[0063] 如本文所用，术语“本发明的基因”、“xyl5235基因”、“xyl5235”指具有木聚糖酶编码基因序列(SEQ ID NO：1或其变异形式或衍生物)的多核苷酸。

[0064] 如本文所用，所述的“还原糖”广义地指木聚糖链被切割后形成的一类糖的总称，其链长度低于被切割前。例如，所述的还原糖含有1-50个木糖，较佳的，含有1-30个木糖；更佳的，含有1-15个木糖；更佳地含有1-10个木糖，如2，3，4，5，6，7，8，9个木糖。所述的还原糖包括：木二糖、木三糖、木四糖等。本发明中，所述的还原糖又指：低聚木糖、少量木糖。

[0065] 如本文所用，所述的“木糖”指一种含有五个碳原子的单糖。分子式C4H9O4CHO。所述的“木聚糖”是“木糖”的聚合体。

[0066] 如本文所用，所述的“低聚木糖”指由少数单体木糖由β-1，4-糖苷键连接形成的低聚体；所述的“木聚糖”是由大量单体木糖由β-1，4-糖苷键连接形成的高聚体。 [0067] 如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其 他物质中分开，则为分离纯化的。

[0068] 如本文所用，“分离的Xyl5235蛋白或多肽”是指Xyl5235多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化Xyl5235蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。Xyl5235多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

[0069] 本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

[0070] 本发明还包括Xyl5235蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然Xyl5235蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。 [0071] 在本发明中，术语“Xyl5235多肽”指具有Xyl5235蛋白活性的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与Xyl5235蛋白相同功能的、SEQ ID NO：2序列编码多肽的片段的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地
1-30个，更佳地1-20个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。因此该术语还包括Xyl5235蛋白的活性片段和 活性衍生物。

[0072] 该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与xyl5235DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗Xyl5235多肽的抗体获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含Xyl5235多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了Xyl5235多肽的可溶性片段。通常，该片段具有Xyl5235多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

[0073] 发明还提供Xyl5235蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然Xyl5235多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

[0074] 修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

[0075] 在本发明中，“Xyl5235蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

[0076] 表1

[0077]最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu

[0078] 本发明的Xyl5235蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HAl，C-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。表2列出了其中的一些标签及其序列。

[0079] 表2

[0080]

[0081] 为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在所述Xyl5235的氨基酸氨基末端添加上信号肽序列，如α-factor信号肽等。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。

[0082] 本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

[0083] 编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

[0084] 术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

[0085] 本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

[0086] 本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

[0087] 本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段” 的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码Xyl5235蛋白的多聚核苷酸。

[0088] 本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。 [0089] 本发明的xyl5235核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA文库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA文库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

[0090] 一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。 [0091] 此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

[0092] 目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

[0093] 应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

[0094] 本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或Xyl5235蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。 [0095] 通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的Xyl5235多肽。一般来说有以下步骤：

[0096] (1).用本发明的编码Xyl5235多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核 苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

[0097] (2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

[0098] (3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

[0099] 本发明中，xyl5235多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。 [0100] 本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含Xyl5235编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PI启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

[0101] 此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

[0102] 包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

[0103] 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

[0104] 本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。 [0105] 本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主 细胞。 [0106] 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

[0107] 获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

[0108] 在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

[0109] 重组的Xyl5235的用途包括(但不限于)：水解木聚糖，将木聚糖长链切割为短链，或形成还原糖。预期通过蛋白分子改造等手段可以进一步提高Xyl5235的酶活力、或扩大Xyl5235适用的PH值范围、温度范围及热稳定性，因此其应用前景良好。一些蛋白的分子改造技术是本领域人员熟知的，因此采用这些技术改造Xyl5235后生成的木聚糖酶也包含在本发明中。

[0110] 用表达的重组Xyl5235蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激Xyl5235蛋白功能的多肽分子。

[0111] 另一方面，本发明还包括对xyl5235DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于xyl5235基因产物或片段。较佳地，指那些能与xyl5235基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制Xyl5235蛋白的分子，也包括那些并不影响Xyl5235蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的Xyl5235基因产物结合的抗体。

[0112] 本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的xyl5235基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达Xyl5235蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。抗Xyl5235蛋白的抗体可用于检测样本中的Xyl5235蛋白。

[0113] 利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与Xyl5235蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

[0114] 本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的本发明的Xyl5235多肽以及食品学上或工业上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。

[0115] 所述的组合物中还可添加调节本发明的Xyl5235酶活性的物质。任何具有提高酶活性功能的物质均是可用的。较佳地，所述的提高本发明的Xyl5235酶活性的物质选自：Triton X-100或β-mercaptoethanol。此外，一些物质可以降低酶活性，选自：2+ 2+
N-bromosuccinimide，SDS，Hg 或Cu 。

[0116] 在获得了本发明的Xyl5235酶后，根据本发明的提示，本领域人员可以方便地应用该酶来发挥水解底物(特别是木聚糖)的作用。作为本发明的优选方式，还提供了一种形成还原糖的方法，该方法包含：用本发明所述的Xyl5235酶处理待水解的底物，所述的底物包括桦木木聚糖和山毛榉木聚糖等。较佳地，在pH3.5-9.0条件下，用所述的Xyl5235酶处理待水解的底物。较佳地，在温度20-70℃条件下，用所述的Xyl5235酶处理待水解的底物。较佳地，用所述的Xyl5235酶处理的同时，还加入Triton X-100或β-mercaptoethanol；
更佳地，加入所述的Triton X-100或β-mercaptoethanol的浓度是5±0.5mM。 [0117] 在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从白蚁肠道共生原虫系统构建的cDNA文库中分离出的。其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为915个碱基，编码全长为304个氨基酸的Xyl5235蛋白(SEQ ID NO：2)。所述的Xyl5235蛋白(SEQ ID NO：
2)序列中，自氨基端的第35-297位氨基酸为糖基水解酶第10家族(Glycosyl Hydrolase Family 10)保守功能域。所述的Xyl5235蛋白与已知氨基酸序列的相似性为70％，证明是一种新的木聚糖酶。

[0118] 实验证明本发明的木聚糖酶在酸性pH范围内具有较高酶活且在较广pH范围内有较好稳定性，因而具有巨大的应用前景。

[0119] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

[0120] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

[0121] 实施例1、木聚糖酶及其编码基因的分离

[0122] 利用转录本测序技术从白蚁肠道原生动物系统中注释得到一个木聚糖酶基因Contig5235。根据该基因序列设计特异性引物(5235f5’-ATTATCCCATCAAGTGTTCC-3’(SEQ ID NO：5)，5235r5’-CATTTCATTGCAGCTCGTTC-3’(SEQ ID NO：6))在cDNA文库中进行PCR序列筛选，对阳性克隆进行测序验证，流程如图1所示，PCR电泳结果如图2所示。用DNAStar软件寻找ORF，用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的BlastP搜寻GenBank数据库，得到木聚糖酶的编码基因，该基因具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列，命名为xyl5235。自SEQ ID NO：1的5’端第1-915位核苷酸为xyl5235的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，自SEQ ID NO：1的5’端的第1-3位核苷酸为xyl5235基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO：1的5’端的第913-915位核苷酸为xyl5235基因的终止密码子TAG。

[0123] 木聚糖酶基因xyl5235编码一个含有304个氨基酸的蛋白质Xyl5235，具有SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为33.1Kd，等电点pI为5.61。自SEQ ID NO：2的氨基端的第35-297位氨基酸 为糖基水解酶第10家族(Glycosyl Hydrolase Family 10)保守功能域。

[0124] 经比对，Xyl5235同已知序列的蛋白的同源性最高为70％，表明该木聚糖酶为新酶。

[0125] 经鉴定，Xyl5235能够高效地作用于木聚糖主链内部的β-1，4-木糖苷键，将大分子多聚木糖水解为木糖。

[0126] 实施例2、xyl5235在毕赤酵母中的表达

[0127] 1.重组表达载体的构建

[0128] 通过PCR以上述筛选到的cDNA阳性克隆为模板扩增预测到的木聚糖酶ORF编码基因，所用正向引物为：5’AAACTCGAGAAGAGAGAGGCTGAAGCA GCAGCGATCTTCCTT 3’(SEQ ID NO：3)，其5’端添加Xho I识别位点：CTCGAG；反向引物为5’AATCTAGAAAATTAGAAGACATGTATTGCTTGAG 3’(SEQ ID NO：4)，其5’端添加Xba I识别位点：TCTAGA。 [0129] 将PCR产物纯化后用Xba I和Xho I酶切，应用Axgen PCR产物柱回收试剂盒回收酶切的DNA片段，将该DNA片段和经同样双酶切的回收的载体pPICZαC(Invitrogen公司)，用T4DNA连接酶在16℃下连接过夜，得到重组表达载体pPICZαC-xyl5235。其中，起始密码子和终止密码子由表达载体pPICZαC提供(载体中的ATG在基因扩增产物的前端，蛋白翻译时用的是载体中的ATG，还利用载体ATG后面的信号肽进行分泌表达)。表达产物的C末端有由表达载体提供的His标签(6×His-Tag)，便于后续纯化和用于Western检测的C-myc抗原表位。C末端的这些附属结构使得表达的蛋白分子量较预测的增加了2.7Kd，为35.8Kd。

[0130] 2.xyl5235基因在毕赤酵母KM71H中的表达

[0131] 将上述构建好的质粒pPICZαC-xyl5235转化入毕赤酵母KM71H(Invitrogen公司)中，得到的KM71H/pPICZαC-xyl5235转化子。随机挑取4个单克隆，以单克隆为模板，通过载体上的AOX位点PCR鉴定阳性克隆。结果如图3所示，4个单克隆中均有目的片段扩增出来。

[0132] 3.xyl5235的表达和表达产物Xyl5235的纯化

[0133] (1)xyl5235的表达

[0134] 挑取单克隆，接种至含40ml BMGY(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，100mM -5Ka3P04，pH 6.0，1.34％(w/v)酵母氮源，4×10 ％(w/v)生物素，1％(w/v)甘油)的摇瓶中。在摇床中30℃，250rpm生长至OD600＝4。室温3000g离心5min收集细胞，去除上清，用5ml BMMY重悬细胞，置于100ml摇瓶中，用透气封口膜盖住瓶口，放入摇床继续培养。每隔24小时，加入甲醇至终浓度为0.5％以继续诱导。在下列的各个时间点，取1ml培养基至1.5ml离心管并补加1ml至摇瓶中。室温用水平离心机最大转速离心2-3min。这些样品用于分析表达水平及确定诱导后收集细胞的最佳时间。时间点：1天，2天，3天，4天，5天，
6天。将上清转移至单独管中，上清及细胞沉淀存于-80℃直至开始检测。诱导表达后各时间点的SDS-PAGE如图4左图。

[0135] (2)表达产物Xyl5235蛋白的提取纯化

[0136] 用购自Qiagen公司的Ni柱(Ni-NTA Column)纯化粗酶液，纯化时所用洗涤液(wash buffer)：NaH2PO450mmol/L，NaCl 300mmol/L，imidazole(咪唑)60mmol/L，pH8.0；洗脱液(elution bufer)：NaH2PO450mmol/L，NaCl 300mmol/L，imidazole 250mmol/L，pH 8.0。用10μl洗脱液进行蛋白SDS-PAGE电泳检测，如图4中右图所示。电泳后可以看到单条带，说明此时已经得到高纯度的目的蛋白，将所有含有目的蛋白的洗脱液合并，用GE公司10Kd截留的vivaspin6超滤管浓缩透析，同时用20mM pH7.4NaH2PO4的置换缓冲液，以去除咪唑。 [0137] 实施例3、重组Xyl5235蛋白酶学性质的分析

[0138] 木聚糖酶的酶活测定采用DNS法，具体操作如下：

[0139] (1)DNS配制

[0140] 称取10克NaOH，溶解于大约400ml ddH2O中，再称取10g二硝基水杨酸、2g苯酚、0.5g无水亚硫酸钠、200g四水酒石酸钾钠，将其溶解于大约300ml ddH2O中，两种溶液混合，定容到1升，避光保存。

[0141] (2)标准曲线制备

[0142] 取6支薄壁离心管，按表3加入溶液。

[0143] 表3

[0144]标样编号 1 2 3 4 5 6
木糖总量(μg) 0 20 40 60 80 100
木糖体积(μl) 0 2 4 6 8 10
补充纯水(μl) 100 98 96 94 92 90

[0145] 木糖浓度为10mg/ml。表3每份标样加DNS 100μl，沸水浴5min显色，酶标仪测540nm光吸收，标样1为空白对照。各样品值减空白后制备标线。

[0146] (3)标准酶活测定

[0147] 在100μl反应体系中，加入终浓度为1％(w/w)的桦木木聚糖，终浓度为100mM的pH6.0Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液，然后加入用该缓冲液稀释至一定稀释度的适量酶液2μl(0.1μg/μl)50℃反应10分钟，再加入100μl DNS终止反应(对照为在上述反应体系中先加入100μl DNS后再加酶液)，沸水浴中反应5分钟显色，用酶标仪测540nm光吸收值，样品测定值减去对照后利用标准曲线计算酶活单位(U)。

[0148] 酶活单位(U)定义：1U为每分钟催化水解木聚糖产生1μmol还原糖所需的酶量。 [0149] 比活力单位的定义：每毫克蛋白质所含的酶活力(U/mg)。

[0150] 结果表明，Xyl5235对桦木木聚糖在pH6.0，50℃下的比活力为80.3±3.1U/mg。 [0151] (4)Xyl5235最适pH测定

[0152] pH范围为3.5-9.0，每0.5个单位为一个梯度，不同pH值的缓冲液配制为：pH3.5-5.5用终浓度为100mM的NaAc；pH 6.0-8.0用终浓度为100mMNa2HPO4/NaH2PO4；pH
8.5-9.0用终浓度为100mM CAPSO。将酶液加入各pH缓冲液的体系中，按如前所述标准酶活测定步骤测定酶活。在50℃反应条件下，Xyl5235在pH6.0的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液中的比活力最高，以此为100％，换算各pH值下的相对酶活力。

[0153] 结果如图5所示，Xyl5235最适pH为6.0，且在pH 4.5～7.0之间均具有最高活力50％以上的活力，说明Xyl5235的反应pH范围较宽，能够适应酸性 条件。 [0154] (5)Xyl5235pH耐受性测定

[0155] 将酶液与pH范围为3.5-9.0的上述各缓冲液(每0.5个单位为一个梯度)在4℃保存24小时，再按如前所述标准酶活测定步骤测定酶活。以Xyl5235在pH6.0中保存0min，在50℃反应10min的比活力为100％，换算Xyl5235在各pH值缓冲液中保存24小时后的相对酶活力。

[0156] 结果如图6所示，Xyl5235在较广范围内具有较好的pH耐受性：在pH3.5～9.0之间均能够保持最高活力的50％以上，其中，对于pH4.5～8.0范围具有更为明显的耐受性，能够保持最高活力的80％以上。

[0157] (6)Xyl5235最适温度测定

[0158] 在最适pH6.0条件下，在温度范围为20-70℃之间，按如前所述标准酶活测定方法步骤测定最适温度。

[0159] 结果如图7所示，Xyl5235的最适温度为50℃，故以此温度下的酶活力为100％，换算各个温度下的相对酶活力。Xyl5235在20-55℃的温度范围内可保持最高活力40％以上的活力，说明Xyl5235的反应温度范围较宽。

[0160] (7)Xyl5235温度耐受性测定

[0161] 将Xyl5235酶液保存于最适pH缓冲液中，在不同温度(55℃、50℃、45℃、40℃)保持不同时间(5min、10min、15min、20min、25min、30min)后，在pH6.0，50℃下测定酶活力。其对照是未热处理的酶液在pH6.0，50℃下所测定的活力，以此为100％，换算在不同温度下保温不同时间后的剩余相对活力。

[0162] 结果如图8所示，Xyl5235在上述各温度下保存10min时，活力下降较快，基本下降到最大活力的50％以下，在随后的时间中下降速度则趋于平缓，到30min时，活力基本保持在最大活力的5％左右。

[0163] (8)不同化学试剂及金属离子对Xyl5235酶活的影响

[0164] 各种化合物(终浓度为5mmol/L)与酶液在4℃下保温30min，然后按常规方法测定酶活力，以未加任何化学试剂(浓度5mM)及金属离子(离子浓度5mM)并在4℃下保温30min的酶活力为100％(图中PC)。

[0165] 不同化学试剂及金属离子对Xyl5235酶活的影响结果如图9所示，TritonX-1002+ 2+
或β-mercaptoethanol对Xyl5235有激活作用；N-bromosuccinimide，SDS，Hg 或Cu 对Xyl5235有显著的抑制作用，均可使酶丧失70％以上活力；其余金属离子对Xyl5235没有显著作用。

[0166] (8)Xyl5235对不同底物的水解情况

[0167] 将各种底物(终浓度为1％(w/w))与适量酶(0.2μg)在pH6.0及50℃下作用10min，测定酶活力。结果如表4所示：Xyl5235对桦木木聚糖及山毛榉木聚糖具有显著酶活，对其他测定底物没有检测到酶活。

[0168] 表4、Xyl5235对不同底物的酶活

[0169]

[0170] ND*，未检测到活性。

[0171] 实施例4、重组Xyl5235蛋白变异体的活性分析

[0172] 用一编码序列替换表达载体pPICZαC-xyl5235中的Xyl5235编码区，所述编码序列编码的蛋白具有SEQ ID NO：2类似的序列，不同处仅在于第6位为Ile(Xyl5235野生型蛋白中为Leu)。Ile和Leu同属于脂肪族中性氨基酸且结构相似，该位点变异对酶活性影响不大。

[0173] 用一编码序列替换表达载体pPICZαC-xyl5235中的Xyl5235编码区，所述编码序列编码的蛋白具有SEQ ID NO：2类似的序列，不同处仅在于第284位为Ala(Xyl5235野生型蛋白中为Val)。Ala和Val同属于脂肪族中性氨基酸且结构相似，该位点变异对酶活性影响不大。

[0174] 用一编码序列替换表达载体pPICZαC-xyl5235中的Xyl5235编码区，所述 编码序列编码的蛋白具有SEQ ID NO：2类似的序列，不同处仅在于第301位后面插入为一个氨基酸Gly。Gly为氨基酸中最小的且为中性，插入位点靠近蛋白羧基端，该位点插入对蛋白的三维结构基本没有变化，不会影响酶活。

[0175] 用一编码序列替换表达载体pPICZαC-xyl5235中的Xyl5235编码区，所述编码序列编码的蛋白具有SEQ ID NO：2序列中第18-304位氨基酸。SEQ ID NO：2序列中第18-304位氨基酸为Xyl5235自带的信号肽，删除这一段序列不会影响酶的催化活力，只会影响蛋白的细胞定位。但因为在载体中存在酵母系统的信号肽，故不影响蛋白的异源表达。 [0176] 将上述获得的纯化的重组Xyl5235蛋白变异体M1-M5如实施例3进行酶活测定，结果发现，它们的水解桦木木聚糖的酶活力与Xyl5235野生型蛋白基本相同，酶在pH7.5，55℃下的比活力为40-100U/mg。

[0177] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。