一种核苷多肽组合物、其制备方法及用途

摘要

本发明提供一种核苷多肽组合物、其制备方法及用途。本发明将鱼精、啤酒酵母、海参经前处理后直接利用蛋白酶酶解制备活性多肽，依据DNA和RNA磷酸二酯键及磷酸单酯键的特性进一步加入富含磷酸二酯酶和磷酸单酯酶的麦芽根提取物，将DNA和RNA在一个反应体系中同时酶解，制备小分子的核糖核苷和脱氧核糖核苷，这样，在一个体系中制备出核苷多肽组合物。整个组合物的制备过程简便，工艺时间大幅缩短(常规的一般是将RNA和DNA单独酶解)，降低了工业化生产成本。制备的产物中核苷品类齐全，既含有组成人体RNA的核糖核苷，也含有组成人体DNA的脱氧核苷，同时富含多种活性多肽。鱼精、啤酒酵母和海参来源的活性多肽的存在也提升了复合核苷在人体的吸收和分布，核苷和多肽相互协同，提升了核苷多肽组合物的保健效果。

权利要求

1.一种制备核苷多肽组合物的方法，其特征在于，步骤如下：A.将酵母泥用碳酸氢钠浸泡洗涤15-20分钟，过筛，利用酵母粉分离机洗涤二次，分离，收集重相备用；

B.鲜海参速冻后切片，胶体磨胶体化，备用；

C.将鱼精捣碎，加入等体积的水，打成匀浆，胶体磨胶体化，备用；

D.将麦芽根，粉碎至120-200目，加入8-10倍重量份数的水，调整pH为6.0-6.5，浸泡

3-5小时，过滤，滤液备用；

E.将步骤A处理后的酵母、步骤B处理后的海参和步骤C处理后的鱼精按照重量比为

1：1：1混合，用水配成8％-15％的固含量浆料，均质二次；

F.加入步骤E所得浆料的体积的0.012％的蛋白酶，酶解10小时，再加入酶量为

7000U／g胰酶，水解2小时得待酶解液；

G.加入步骤D中的麦芽根酶液，加入量为待酶解液体积的1／10，搅拌，在55℃恒温反应4.5小时后，用分离机分离；

H.轻相液升温至95℃，恒温20分钟灭酶，干燥得核苷多肽组合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中过120目振荡筛。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中采用3‰-5‰含量碳酸氢钠。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C中鱼精包括鲑鱼、鲱鱼、鳟鱼。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤D中升温至40℃浸泡。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤F中加入蛋白酶后酶解的条件是

55℃，pH为6.0-7.0。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤F中加入胰酶后酶解的条件是50℃下，pH为8.5。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤G中加入麦芽根酶液调节pH为6.5。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤D中滤渣和步骤G中重相用于制备饲料。

10.一种核苷多肽组合物，其特征在于采用如权利要求1所述的方法制备。

11.权利要求10的核苷多肽组合物在制备增强免疫力及抗疲劳保健食品中的用途。

12.权利要求10的核苷多肽组合物在制备增强免疫力及抗疲劳的药物制剂中的用途。

说明书

一种核苷多肽组合物、其制备方法及用途

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种核苷多肽组合物、其制备方法及用途。

背景技术

[0002] 肽的分子量一般在180-5000之间，一般将分子量在180-1000的小分子活性多肽统称为“生物活性肽”，生物活性肽具有很多生理功能，包括免疫调节作用、抗菌作用、抗肿瘤作用等。人们研究发现，人类摄入的蛋白质经消化酶作用后，并不是仅以氨基酸的形式吸收，更多的是以小肽的形式吸收，以游离氨基酸形式吸收的比例很小，且肽比游离氨基酸消化更快、吸收率更高。

[0003] 近年，相当多学者报道了饮食核酸类物质对机体免疫功能具有调节及增强作用。Sanderson等对核酸在肠道上皮细胞的吸收及代谢研究表明，进食核酸后在肠道内消化降解为核苷酸、核苷，并主要以核苷的形式进行吸收，核苷通过异化扩散和Na+依赖性载体介导的方式吸收至肠道上皮细胞。王镜岩等编著的《生物化学》第三版下册P387《核酸的降解和核苷酸代谢》章节中指明：核酸的基本结构是核苷酸，核酸降解生产核苷酸，核苷酸还能进一步分解成核苷和磷酸，这是核酸的分解代谢，反之，核苷和磷酸组成核苷酸，核苷酸进一步聚合成核酸。核苷是人体的正常组成物质，是人体的天然组分。核酸营养的本质就是核苷酸和核苷营养，核苷酸营养的本质就是核苷营养。如《外源核苷酸的利用途径和生理作用》丁诗华等提出核酸降解成核苷酸后经肠道水解酶转变成核苷、碱基后被肠细胞吸收，其中核苷是主要的吸收形式。因此核酸的降解物核苷更利于吸收和利用。 [0004] 研究发现，多肽具有促进肠道内核酸分解产物核苷的吸收作用，并对核苷的转运及在某些脏器的分布、利用产生影响。

[0005] 鱼类的精巢又叫鱼白，是鱼制造和贮存精子的器官，约占鱼活体重的7％左右。鱼精可制备活性多肽，其制备的多肽有多种用途，如中国专利申请号：200710059272.9，鱼精多肽中的抗氧化二肽的具有抗氧化、抗疲劳、性功能等方面的作用。鱼精中富含脱氧核糖核酸(DNA)，利用麦芽根中含有的磷酸二酯酶和磷酸单酯酶可将脱氧核糖核酸降解成利于人体直接吸收的脱氧核糖核苷。如脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和胸苷。 [0006] 海参属棘皮动物门、海参纲、盾手目动物，海参体壁中含蛋白质高达90％(折干计)， 还有氨基酸、多糖以及多种微量元素，被人们视为滋补佳品，具有极高的营养价值。近年来，人们发现海参含有许多重要的生物学活性物质，如多肽、海参多糖、海参皂甙等。其中海参肽还具有提高免疫力、抗肿瘤、抗疲劳、延缓衰老、降血压等功效。 [0007] 啤酒酵母的营养成分十分丰富，利用价值很高，其中蛋白质含量很高，达到45％-60％。近年来啤酒酵母来源的生物活性肽的保健作用日益被揭开。如提高免疫多肽、抗氧化多肽、还有护肝的谷胱甘肽等。啤酒酵母中还含有5％-10％左右的核糖核酸(RNA)，将核糖核酸利用麦芽根中含有的磷酸二酯酶和磷酸单酯酶可将核糖核酸降解成利于人体直接吸收的核糖核苷，如腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷等。

发明内容

[0008] 本发明提供一种核苷多肽组合物、其制备方法及用途。本发明提供一种制备核苷多肽组合物的方法，包括如下步骤：

[0009] A.将酵母泥用碳酸氢钠浸泡洗涤，用分离机洗涤分离，收集重相备用； [0010] B.鲜海参切片，胶体磨胶体化，备用；

[0011] C.将鱼精捣碎，加入水，打成匀浆，胶体磨胶体化，备用；

[0012] D.将麦芽根，粉碎，加入8-10倍重量份数的水，浸泡过滤，滤液备用； [0013] E.将步骤A处理后的酵母和步骤B处理后的海参和步骤C处理后的鱼精按照重量比为1∶1∶1混合，用水配成固含量浆料，均质；

[0014] F加入蛋白酶，酶解，再加入胰酶，水解得待酶解液；

[0015] G.加入步骤D中的麦芽根酶液，搅拌，然后酶解反应后，分离； [0016] H.轻相液升至高温后，灭酶，干燥得核苷多肽组合物。

[0017] 根据本发明的实施例，本发明提供的方法进一步包括如下步骤： [0018] A.将酵母泥用碳酸氢钠浸泡洗涤15-20分钟，过筛，利用酵母粉分离机洗涤二次，分离，收集重相备用；

[0019] B.鲜海参速冻后切片，胶体磨胶体化，备用；

[0020] C.将鱼精捣碎，加入等体积的水，打成匀浆，胶体磨胶体化，备用； [0021] D.将麦芽根，粉碎至120-200目，加入8-10倍重量份数的水，调整PH为6.0-6.5，浸泡3-5小时，过滤，滤液备用；

[0022] E.将步骤A处理后的酵母、步骤B处理后的海参和步骤C处理后的鱼精按照重量比为1∶1∶1混合，用水配成8％-15％的固含量浆料，均质二次；

[0023] F.加入步骤E所得浆料的体积的0.012％的蛋白酶，酶解10小时，再加入酶量为7000U/g胰酶，水解2小时得待酶解液；

[0024] G.加入步骤D中的麦芽根酶液，加入量为待酶解液体积的1/10，搅拌，在55℃恒温反应4.5小时后，用分离机分离；

[0025] H.轻相液升温至95℃，恒温20分钟灭酶，干燥得核苷多肽组合物。 [0026] 根据本发明的具体示例，步骤A中酵母泥选用啤酒厂5代以内的酵母泥，10℃保温备用。

[0027] 根据本发明的实施例，步骤A中过120目振荡筛。

[0028] 根据本发明的具体示例，步骤A中碳酸氢钠浸泡洗涤的时间为15分钟。 [0029] 根据本发明的实施例，步骤A中采用3‰-5‰含量碳酸氢钠，进一步的为5‰含量碳酸氢钠。

[0030] 根据本发明的具体示例，步骤A中酵母粉分离机洗涤的频率为1600-1800rpm。 [0031] 根据本发明的具体示例，步骤B中鲜海参在-70℃速冻，采用剪切机切片。 [0032] 根据本发明的实施例，步骤C中鱼精包括体型较大的海产和淡水鱼类，进一步的包括鲑鱼、鲱鱼、鳟鱼。

[0033] 根据本发明的具体示例，步骤C中采用均浆机打成均浆。

[0034] 根据本发明的具体示例，步骤D中麦芽根选用啤酒麦芽厂现产新鲜的金黄色(酶活较高)的麦芽根。

[0035] 根据本发明的实施例，步骤D中升温至40℃浸泡。

[0036] 根据本发明的具体示例，步骤D中粉碎至200目。

[0037] 根据本发明的具体示例，步骤D中调整PH为6.0。

[0038] 根据本发明的具体示例，步骤E中利用均质机50MP均质二次。

[0039] 根据本发明的具体示例，步骤E中用水配成10％的固含量浆料。 [0040] 根据本发明的实施例，步骤F中加入蛋白酶后酶解的条件是55℃，pH为6.0-7.0，进一步的为6.5。

[0041] 根据本发明的实施例，步骤F中加入胰酶后酶解的条件是50℃下，pH为8.5。 [0042] 根据本发明的实施例，步骤G中加入麦芽根酶液调节pH为6.5。 [0043] 根据本发明的具体示例，步骤G中麦芽根酶液优选预先预热到55℃。 [0044] 根据本发明的具体示例，步骤G中搅拌的方法采用先迅速搅拌，然后每隔半小时搅拌一次，每次搅拌时间为2分钟。

[0045] 根据本发明的具体示例，步骤G中分离的方法采用酵母粉分离机1600-1800rpm下分离。

[0046] 根据本发明的具体示例，步骤H中轻相液经板式换热器升温至95℃。 [0047] 根据本发明的具体示例，步骤H中干燥的方法采用三效降膜浓缩蒸发器浓缩后经喷雾干燥器干燥。

[0048] 根据本发明的实施例，步骤D中滤渣和步骤G中重相可用于制备饲料。 [0049] 本发明另一方面提供一种采用上述方法制备的核苷多肽组合物。 [0050] 本发明另一方面还提供上述核苷多肽组合物在制备增强免疫力及抗疲劳保健食品中的用途。

[0051] 本发明另一方面还提供上述核苷多肽组合物在制备增强免疫力及抗疲劳的药物制剂中的用途。

[0052] 本发明将鱼精、啤酒酵母、海参经前处理后直接利用蛋白酶酶解制备活性多肽，依据DNA和RNA磷酸二酯键及磷酸单酯键的特性进一步加入富含磷酸二酯酶和磷酸单酯酶的麦芽根提取物，将DNA和RNA在一个反应体系中同时酶解，制备小分子的核糖核苷和脱氧核糖核苷，这样，在一个体系中制备出核苷多肽组合物。整个组合物的制备过程简便，工艺时间大幅缩短(常规的一般是将RNA和DNA单独酶解)，降低了工业化生产成本。制备的产物中核苷品类齐全，既含有组成人体RNA的核糖核苷，也含有组成人体DNA的脱氧核苷，同时富含多种活性多肽。鱼精、啤酒酵母和海参来源的活性多肽的存在也提升了复合核苷在人体的吸收和分布，核苷和多肽相互协同，提升了核苷多肽组合物的保健效果。 [0053] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

具体实施方式

[0054] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。 [0055] 实施例1：

[0056] 鲜啤酒酵母选用啤酒厂5代以内的酵母泥，10℃保温槽车运抵车间，用5‰含量碳酸氢钠浸泡搅拌洗涤15分钟后过120目振荡筛，利用D424酵母粉分离机1600-1800rpm下洗涤分离二次，收集重相备用。

[0057] 鲜海参-70℃速冻后剪切机切片，胶体磨胶体化，备用。

[0058] 将经过筛选除杂后的鲑鱼鱼精洗净沥干，捣碎机捣碎，加入等体积蒸馏水，放于匀浆机中打成匀浆，胶体磨胶体化，备用。

[0059] 选择啤酒麦芽厂现产新鲜的金黄色(酶活较高)的麦芽根，常温下将其粉碎至200目左右，加入8-10倍重量的自来水，用6摩尔/升的盐酸调整pH为6.0，然后在40℃浸泡3-5h，不锈钢滤网过滤，滤液备用。

[0060] 将经洗涤脱苦后的鲜酵母和经胶体磨处理后的海参和鲑鱼鱼精(1∶1∶1，折干重量比)，用自来水配成10％的固含量浆料，利用均质机50MP均质二次。 [0061] 加入0.012％(V/V)37071蛋白酶(诺维信公司)，55℃，pH6.5酶解10h，然后加入用来源于猪胰脏的胰酶(加酶量7000U/g)，用6摩尔/升的氢氧化钠调节pH8.5，50℃下，水解2h得待酶解液。

[0062] 加入预热到55℃的麦芽根酶液，加入量为待酶解液体积的1/10(V/V)，用6摩尔/升的盐酸调整pH为6.5，迅速搅拌，然后每隔半小时搅拌一次，每次搅拌时间为2分钟。在55℃恒温搅拌反应4.5小时，利用D424酵母粉分离机1600-1800rpm下分离。 [0063] 轻相液经板式换热器升温到95℃，保温20分钟灭酶(重相液经滚筒干燥为饲料)，然后进入三效降膜浓缩蒸发器(温州泰康蒸发器有限公司RNJM3-6000型)浓缩后经喷雾干燥器干燥即得核苷多肽组合物。

[0064] 该复合核苷多肽原料水解度(DH)约为(57.38±6.24)％，总氮含量(凯式定氮法)大于13％，含水量小于10％，其中蛋白水解产物分子量在100-1000D之间约为48.3％(HPLC法测定)。可直接以本原料或者辅助其他具有相关功能的原料制备增强免疫力及抗疲劳的制剂，如胶囊或者片剂等。

[0065] 实施例2：

[0066] 鲜啤酒酵母选用啤酒厂5代以内的酵母泥，10℃保温槽车运抵车间，用5‰含量碳酸氢钠浸泡搅拌洗涤15分钟后过120目振荡筛，利用D424酵母粉分离机1600-1800rpm下洗涤分离二次，收集重相备用。

[0067] 鲜海参-70℃速冻后剪切机切片，胶体磨胶体化，备用。

[0068] 将经过筛选除杂后的鲱鱼鱼精洗净沥干，捣碎机捣碎，加入等体积蒸馏水，放于匀浆机中打成匀浆，胶体磨胶体化，备用。

[0069] 选择啤酒麦芽厂现产新鲜的金黄色(酶活较高)的麦芽根，常温下将其粉碎至200目，加入8-10倍重量的自来水，用6摩尔/升的盐酸调节pH为6.0，然后在40℃浸泡3-5小时，不锈钢滤网过滤，滤液备用。

[0070] 将经洗涤脱苦后的鲜酵母和经胶体磨处理后的海参和鲱鱼鱼精(1∶1∶1，折干重量比)，用 自来水配成10％固含量浆料，利用均质机50MP均质二次。 [0071] 加入0.012％(V/V)37071蛋白酶(诺维信公司)，55℃，PH6.5左右酶解12h，然后加入用来源于猪胰脏的胰酶(加酶量7000U/g)，用6摩尔/升的氢氧化钠调节pH8.5，50℃下，水解2h得待酶解液。

[0072] 加入预热到55℃的麦芽根酶液，加入量为待酶解液体积的1/10(V/V)，用6摩尔/升的盐酸调整pH为6.5，迅速搅拌，然后每隔半小时搅拌一次，每次搅拌时间为2分钟。在55℃恒温搅拌反应4.5小时后，利用D424酵母粉分离机1600-1800rpm下分离。 [0073] 轻相液经板式换热器升温到95℃，保温20分钟灭酶(重相液经滚筒干燥为饲料)，然后进入三效降膜浓缩蒸发器(温州泰康蒸发器有限公司RNJM3-6000型)浓缩后经喷雾干燥器干燥即得核苷多肽组合物。

[0074] 该复合核苷多肽原料水解度(DH)约为(57.38±6.24)％，总氮含量(凯式定氮法)大于13％，含水量小于10％，其中蛋白水解产物分子量在100-1000D之间约为48.3％(HPLC法测定)。可直接以本原料或者辅助其他具有相关功能的原料制备增强免疫力及抗疲劳的制剂，如胶囊或者片剂等。

[0075] 实施例3：

[0076] 本发明对上述制备所得的复合核苷多肽进行了增强免疫力功效测试。 [0077] 选择清洁级(II级)昆明种健康雄性小白鼠200只，体重18-20g。试验设三个剂量组即：0.2g/kg体重组，0.4g/kg体重组，0.6g/kg体重组，低中高三个剂量组分别相当于发明人人体日推荐量的10倍、20倍、30倍，阴性对照组动物给予蒸馏水，每天灌胃一次，灌胃体积为体重的2％，共30天。然后进行各项指标的观测。末次灌胃1h后参照《保健食品检验与评价技术规范》中的方法对小鼠进行脏器/体重比值测定、迟发型DTH试验、血清溶血值的测定、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验、小鼠NK细胞活性测定等免疫功能的测定。实验所得数据采用SAS软件进行分析。

[0078] 复合核苷多肽对小鼠体重的影响结果见表1-表5

[0079] 表1脏器/体重试验前后动物体重记录(X±S)

[0080]

[0081]

[0082] 表2DTH试验前后动物体重记录(X±S)

[0083]

[0084] 表3HC50试验前后动物体重记录(X±S)

[0085]

[0086] 表4吞噬试验前后动物体重记录(X±S)

[0087]

[0088] 表5NK细胞活性试验前后动物体重记录(X±S)

[0089]

[0090] 经方差分析P＞0.05，复合核苷多肽三个剂量组与对照组之间实验前后体重以及增重均无显著性差异。

[0091] 本发明所述的复合核苷多肽对小鼠脏器/体重比值影响结果见表6 [0092] 表6复合核苷多肽对小鼠脏器/体重比值影响(X±S)

[0093]

[0094] 脾脏/体重比值经方差分析，P＜0.001，复合核苷多肽人体推荐量的10倍剂量组与对照组比较，P＜0.05，有显著性差异。20倍与30倍剂量组与对照组比较P＜0.01，有极显著性差异。胸腺/体重比值经方差分析，P＜0.05，20倍与30倍剂量组与对照组比较P＜0.05，有显著性差异。

[0095] 本发明所述复合核苷多肽对小鼠免疫功能[小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响]见表7

[0096] 表7本发明所述复合核苷多肽对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响(X±S)[0097] 复合核苷多肽三个剂量组与对照组比较P＜0.01，有极显著性差异。 [0098]组别 动物数(只) 耳肿程度(mg)
正常对照组 10 5.00±0.67
复合核苷多肽低剂量组 10 6.65±0.86
复合核苷多肽中剂量组 10 6.78±0.93
复合核苷多肽高剂量组 10 6.87±0.89

[0099] 本发明所述复合核苷多肽对体液免疫(小鼠半数溶血值)的影响见表8 [0100] 表8本发明所述复合核苷多肽对体液免疫(小鼠半数溶血值)的影响(X±S)[0101]组别 动物数(只) 小鼠半数溶血值
正常对照组 10 130.1±21.6
复合核苷多肽低剂量组 10 142.1±18.8
复合核苷多肽中剂量组 10 174.8±16.1
复合核苷多肽高剂量组 10 176.0±17.9

[0102] 复合核苷多肽20倍与30倍剂量组与对照组比较P＜0.01，均有极显著性差异。

[0103] 本发明所述复合核苷多肽对小鼠巨噬细胞能力的影响见表9

[0104] 表9本发明所述复合核苷多肽对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响(X±S)[0105]组别 动物数(只) 吞噬率/％ 吞噬指数
正常对照组 10 20.6±2.6 0.33±0.06
复合核苷多肽低剂量组 10 24.8±5.0 0.34±0.05
复合核苷多肽中剂量组 10 24.9±3.6 0.36±0.07
复合核苷多肽高剂量组 10 29.7±6.1 0.43±0.06

[0106] 人体日推荐量的30倍剂量组吞噬率与吞噬指数与对照比有极显著性差异。 [0107] 本发明所述复合核苷多肽对小鼠NK细胞活性的影响见表10

[0108] 表10本发明所述复合核苷多肽对小鼠NK细胞活性的影响(X±S)

[0109]组别 动物数(只) 小鼠NK细胞活性％
正常对照组 10 6.60±1.21
复合核苷多肽低剂量组 10 8.78±1.48
复合核苷多肽中剂量组 10 8.98±1.32
复合核苷多肽高剂量组 10 9.81±1.29

[0110]

[0111] 复合核苷多肽三个剂量组与对照相比P＜0.01，均有极显著性差异。

[0112] 由此说明复合核苷多肽具有良好的增强免疫力作用，可作为开发增强免疫力的保健食品原料。

[0113] 本发明对上述制备所得的复合核苷多肽进行了抗疲劳功效测试。 [0114] 剂量选择

[0115] 试验设三个剂量组即：0.1g/kg体重组，0.2g/kg体重组，0.6g/kg体重组，低中高三个剂量组分别相当于发明人人体日推荐量的5倍、10倍、30倍，阴性对照组动物给予蒸馏水，负重游泳试验及生化指标(血清尿素氮、乳酸、肝糖原)所用动物均随机分成4组，每组10只，每天灌胃一次，灌胃体积为体重的2％，共30天。然后进行各项指标的观测。 [0116] 负荷游泳时间测定

[0117] 末次给予受试物30min后，置小鼠于游泳箱中，水深35cm，水温(25±0.5)℃，小鼠尾根部负荷5％体重的铅皮，记录小鼠游泳开始至死亡的时间作为小鼠游泳时间。 [0118] 血清尿素氮含量的测定

[0119] 末次灌胃给予受试物30min后，在温度为30℃的水中不负重游泳90min，摘眼球采血，2000r.min-1离心15min，取血清用日立7020全自动生化仪测定尿素氮含量。 [0120] 肝糖原含量的测定

[0121] 末次灌胃给予受试物30min后，在温度为30℃的水中游泳90min，立即处死，取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，精确称取肝脏200mg，加入4ml三氯乙酸，每管匀浆1min，将匀浆液倒入离心管，以3000r.min-1离心15min，将上清液转移至另一个试管内，在沉淀