治疗幽门螺旋杆菌相关疾病的新方法

摘要

本发明涉及治疗幽门螺旋杆菌相关疾病的新方法。具体涉及头花蓼或其提取物在制备用于治疗和/或预防与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症的药物中的用途。本发明发现所述提取物可有效抑制幽门螺旋杆菌。

权利要求

1.头花蓼或其提取物在制备用于治疗和/或预防与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症的药物中的用途。

2.权利要求1的用途，其中所述的头花蓼是头花蓼的鲜品或干品。

3.权利要求1的用途，其中所述的头花蓼是选自头花蓼的全草、地上部分、叶、花、茎、种子或其组合。

4.权利要求1的用途，其中所述的头花蓼是头花蓼的地上部分。

5.权利要求1的用途，其中所述的头花蓼是选自头花蓼的叶、花、茎、种子或其组合。

6.权利要求1的用途，其中所述提取物是头花蓼用水、乙醇、乙醇水溶液或其组合作为溶剂，经提取获得的提取物；或者是头花蓼经二氧化碳超临界提取方法获得的提取物。

7.权利要求6的用途，其中所述乙醇水溶液是30～99%乙醇水溶液。

8.权利要求1的用途，其中所述提取物是按照包括如下步骤的方法制备的提取物：由头花蓼药材用水、乙醇、或乙醇水溶液煎煮和/或回流提取，浓缩提取液，干燥。

9.权利要求1的用途，其中所述提取物是按照包括如下步骤的方法制备的提取物：取头花蓼药材，加5～20倍的水、乙醇、或乙醇水溶液煎煮和/或回流提取1～5次，每次

0.5～5小时，合并煎液，过滤，滤液减压浓缩至相对密度为1.1～1.5(25℃)的稠膏，干燥，即得。

10.权利要求1至9任一项的用途，其中所述与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症选自：胃粘膜相关性淋巴瘤、消化性溃疡、胃溃疡、十二指肠溃疡、急慢性胃炎、浅表性胃炎、萎缩性胃炎、胃癌、心血管疾病、冠心病、动脉硬化、脑梗塞、高血压、贫血、缺铁性贫血、消化性溃疡复发、胃黏膜萎缩、肠上皮化生、以及血小板减少性紫癜，以及它们的并发症。

说明书

治疗幽门螺旋杆菌相关疾病的新方法

技术领域

[0001] 本发明涉及中药领域，具体而言，本发明涉及治疗幽门螺旋杆菌相关疾病的新方法，具体涉及一种蓼科植物及其提取物用于治疗幽门螺旋杆菌相关疾病的新方法，特别涉及中草药头花蓼或其提取物用于治疗幽门螺旋杆菌相关疾病的新方法。

背景技术

[0002] 头花蓼(Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don)是一种蓼科蓼属植物，为多年生草本，别名四季红、石莽草、石辣蓼、水绣球、红花地丁、满地红等。在中国贵州、云南、广西、四川、西藏、湖北、湖南和江西等地区均有分布，主要生长在山坡、山谷及富含煤层的沙页岩地带。全草具有清热解毒、散瘀、利尿通淋之功效。据1963年《广西中药志》第二册记载，头花蓼主要用于治疗风湿痛；1977年《中药大辞典》上册记载，头花蓼主要用于治疗痢疾、肾炎、膀胱炎和尿路结石等。民间一般将头花蓼用水煎服，治疗效果比较明显，但是服用不方便。中国专利申请公开说明书CN1054899A(中国专利申请号90107810.7，公开日1991年10月2日)中公开了一种泌感灵冲剂、糖浆生产工艺。该生产工艺是以四季草为原料用水煎煮30-60分钟，提取液过滤浓缩，，将其上清液减压浓缩成膏，再用60-70%乙醇提取，将乙醇提取液真空干燥，得四季红浸膏，进一步配制成冲剂或糖浆剂，据信该具有解毒、散瘀、利尿、通淋的功效。

[0003] 中华人民共和国卫生部药典委员会1998年编的中华人民共和国卫生部《药品标准—中药成方制剂》(第十七册)中收载了名为“热淋清颗粒”的中成药制剂，其是通过将头花蓼加水煎煮两次后过滤浓缩制成的。

[0004] CN 1481832A(中国专利申请号02129686.3，公开日2004年3月17日)和CN1483466A(中国专利申请号03146381.9，公开日2004年3月24日)公开了头花蓼提取物，其基本上是由以下步骤制备的：a.由头花蓼全草的鲜品或干品用水分两次煎煮或者用醇水混合物分二至三次回流提取，每次1-2小时，合并煎煮液，过滤浓缩至20°C时的相对密度为1.2，喷雾干燥或减压干燥得到；或者，b.由头花蓼全草及其水提药渣经二氧化碳超临界萃取得到。据信此提取物可用于抗菌、抗炎、镇痛、利尿、治疗泌尿系统结石、治疗肾盂肾炎以及前列腺炎。

[0005] 幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,在本文中可简称为Hp或HP)是普遍存在于人胃黏膜中的一种微需氧的革兰氏阴性菌。幽门螺旋杆菌是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌，长2.5～4.0μm，宽0.5～1.0μm，在胃粘膜上皮细胞表面常呈典型的螺旋状或弧形，在固体培养基上生长时，除典型的形态外，有时可出现杆状或圆球状。幽门螺旋杆菌在全球自然人群的感染率超过50%,世界上几乎没有一种慢性传染病会使全球超过半数的人口受到感染，且发展中国家高于发达国家。我国属发展中国家，幽门螺旋杆菌感染率高。由中华医学会消化病分会幽门螺旋杆菌学组所作的一个涉及全国20个省市、40个中心的自然人群的幽门螺旋杆菌感染流行病学调查显示：我国幽门螺旋杆菌感染率为40-90%，平均为59%;现症感染率为42-64%,平均55%。据信Hp感染与多种上胃肠道疾病如消化性溃疡、胃炎、胃粘膜相关性淋巴瘤(MALT)及胃癌等的主要致病因素。已知例如下列疾病或病症直接或间接地与Hp感染有关：胃粘膜相关性淋巴瘤、消化性溃疡、胃溃疡、十二指肠溃疡、急慢性胃炎、浅表性胃炎、萎缩性胃炎、胃癌、心血管疾病、冠心病、动脉硬化、脑梗塞、高血压、贫血、缺铁性贫血、消化性溃疡复发、胃黏膜萎缩、肠上皮化生、以及血小板减少性紫癜(百度百科：http://baike.baidu.com/view/36784.htm，2011-09-15)，还可以包括伴随这些疾病或病症的并发症，抑制幽门螺旋杆菌有利于降低消化性溃疡的复发率、阻断或延缓胃黏膜萎缩和肠上皮化生的进一步发展。1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构(WHO/IARC)将幽门螺旋杆菌定为Ⅰ类致癌原。Hp抗感染治疗主要是以抗生素为基础的三联或四联疗法，但随着多种抗生素联合广泛用于抗Hp治疗，Hp对抗生素的耐药问题日益严重，已成为根除治疗失败的主要原因。

[0006] 本领域期待有用于幽门螺旋杆菌相关疾病的新治疗方法。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于为临床上提供一种治疗和/或预防与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症的方法。本发明人令人惊奇地发现，头花蓼或其提取物在抑制幽门螺旋杆菌以及治疗和/或预防与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症具有令人期待的效果。本发明基于此而得以完成。

[0008] 为此，本发明第一方面提供了头花蓼或其提取物在制备用于治疗和/或预防与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症的药物中的用途。

[0009] 根据本发明第一方面的用途，其中所述的头花蓼是头花蓼的鲜品或干品。

[0010] 根据本发明第一方面的用途，其中所述的头花蓼是选自头花蓼的全草、地上部分、叶、花、茎、种子或其组合。

[0011] 根据本发明第一方面的用途，其中所述的头花蓼是选自头花蓼的地上部分。

[0012] 根据本发明第一方面的用途，其中所述的头花蓼是选自头花蓼的叶、花、茎、种子或其组合。

[0013] 根据本发明第一方面的用途，其中所述提取物是头花蓼用水、乙醇、乙醇水溶液或其组合作为溶剂，经提取获得的提取物；或者是头花蓼经二氧化碳超临界提取方法获得的提取物。

[0014] 根据本发明第一方面的用途，其中所述提取物是头花蓼的乙醇水溶液的提取物。在一个实施方案中，所述乙醇水溶液是30~99%乙醇水溶液。在一个实施方案中，所述乙醇水溶液是50~98%乙醇水溶液。在一个实施方案中，所述乙醇水溶液是60~98%乙醇水溶液。
在一个实施方案中，所述乙醇水溶液是70~95%乙醇水溶液。

[0015] 根据本发明第一方面的用途，其中所述提取物是按照包括如下步骤的方法制备的提取物：由头花蓼药材用水、乙醇、或乙醇水溶液煎煮和/或回流提取，浓缩提取液，干燥。

[0016] 根据本发明第一方面的用途，其中所述提取物是用二氧化碳超临界萃取头花蓼得到的。在一个实施方案中，其中所述提取物是按照包括如下步骤的方法制备的提取物：用二氧化碳超临界萃取头花蓼药材，和/或用二氧化碳超临界萃取头花蓼药材经水、乙醇、或乙醇水溶液煎煮和/或回流提取得到的药渣。

[0017] 根据本发明第一方面的用途，其中所述提取物是按照包括如下步骤的方法制备的提取物：取头花蓼药材，加5~20倍(例如5~15倍，例如8~12倍)的水、乙醇、或乙醇水溶液煎煮和/或回流提取1~5次(例如2~3次)，每次0.5~5小时(例如0.5~3小时，例如1~3小时)，合并煎液，过滤，滤液减压浓缩至相对密度为1.1~1.5(25°C)(例如1.2~1.4)的稠膏，干燥，即得。

[0018] 根据本发明第一方面的用途，其中所述提取物是按照包括如下步骤的方法制备的提取物：取头花蓼药材，加5~20倍(例如5~15倍，例如8~12倍)的水，在80~100°C左右煎煮提取0.5~5小时(例如0.5~3小时，例如1~3小时)；过滤，滤液减压浓缩成膏状；用2-5倍量50~90%的乙醇回流提取2-3次，将乙醇提取液于70-90°C除乙醇，真空干燥，即得。

[0019] 根据本发明第一方面的用途，其中所述与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症包括但不限于，胃粘膜相关性淋巴瘤、消化性溃疡、胃溃疡、十二指肠溃疡、急慢性胃炎、浅表性胃炎、萎缩性胃炎、胃癌、心血管疾病、冠心病、动脉硬化、脑梗塞、高血压、贫血、缺铁性贫血、消化性溃疡复发、胃黏膜萎缩、肠上皮化生、以及血小板减少性紫癜，以及它们的并发症。

[0020] 已知与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症可采用联合用药治疗方案，例如三联或四联药物治疗方案，例如，阿莫西林+克拉霉素+甲硝唑的联合治疗方案，或者质子泵抑制剂(奥美拉唑、兰索拉唑和/或泮托拉唑)+阿莫西林+克拉霉素的联合治疗方案，或者奥美拉唑+克拉霉素+阿莫西林+雷尼替丁的联合治疗方案，或者在它们的基础上辅以胃粘膜保护剂例如但不限于硫糖铝、思密达等的联合治疗方案。而本发明发现头花蓼提取物具有优良的抑菌活性，特别是令人惊奇的是发现头花蓼提取物对某些耐阿莫西林、克拉霉素和/或甲硝唑的病原体亦是有效的，因此可以预期，本发明头花蓼提取物可以与这些抗病原体的药物组合使用或者替代它们使用。因此，根据本发明第一方面的用途，其中所述的药物中还包含一种或多种其它的药物，该其它的药物选自：抗微生物药、质子泵抑制剂、胃粘膜保护剂等。所述的抗微生物药例如但不限于：青霉素类例如阿莫西林，大环内酯类例如克拉霉素，硝咪唑类例如甲硝唑。所述的质子泵抑制剂例如但不限于：奥美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑。所述的胃粘膜保护剂例如但不限于硫糖铝、思密达等。本领域技术人员根据已有知识知晓如何对本发明所述头花蓼或其提取物与所述其它的药物进行组合。

[0021] 本发明第二方面提供了用于治疗和/或预防与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症的药物组合物，其中包含头花蓼或其提取物，以及任选的药学可接受的载体或赋形剂。

[0022] 根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述的头花蓼是头花蓼的鲜品或干品。

[0023] 根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述的头花蓼是选自头花蓼的全草、地上部分、叶、花、茎、种子或其组合。

[0024] 根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述的头花蓼是选自头花蓼的地上部分。

[0025] 根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述的头花蓼是选自头花蓼的叶、花、茎、种子或其组合。

[0026] 根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述提取物是头花蓼用水、乙醇、乙醇水溶液或其组合作为溶剂，经提取获得的提取物；或者是头花蓼经二氧化碳超临界提取方法获得的提取物。

[0027] 根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述提取物是头花蓼的乙醇水溶液的提取物。在一个实施方案中，所述乙醇水溶液是30~99%乙醇水溶液。在一个实施方案中，所述乙醇水溶液是50~98%乙醇水溶液。在一个实施方案中，所述乙醇水溶液是60~98%乙醇水溶液。在一个实施方案中，所述乙醇水溶液是70~95%乙醇水溶液。

[0028] 根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述提取物是按照包括如下步骤的方法制备的提取物：由头花蓼药材用水、乙醇、或乙醇水溶液煎煮和/或回流提取，浓缩提取液，干燥。

[0029] 根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述提取物是用二氧化碳超临界萃取头花蓼得到的。在一个实施方案中，其中所述提取物是按照包括如下步骤的方法制备的提取物：用二氧化碳超临界萃取头花蓼药材，和/或用二氧化碳超临界萃取头花蓼药材经水、乙醇、或乙醇水溶液煎煮和/或回流提取得到的药渣。

[0030] 根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述提取物是按照包括如下步骤的方法制备的提取物：取头花蓼药材，加5~20倍(例如5~15倍，例如8~12倍)的水、乙醇、或乙醇水溶液煎煮和/或回流提取1~5次(例如2~3次)，每次0.5~5小时(例如0.5~3小时，例如1~3小时)，合并煎液，过滤，滤液减压浓缩至相对密度为1.1~1.5(25°C)(例如1.2~1.4)的稠膏，干燥，即得。

[0031] 根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述提取物是按照包括如下步骤的方法制备的提取物：取头花蓼药材，加5~20倍(例如5~15倍，例如8~12倍)的水，在80~100°C左右煎煮提取0.5~5小时(例如0.5~3小时，例如1~3小时)；过滤，滤液减压浓缩成膏状；用2-5倍量50~90%的乙醇回流提取2-3次，将乙醇提取液于70-90°C除乙醇，真空干燥，即得。

[0032] 根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症包括但不限于，胃粘膜相关性淋巴瘤、消化性溃疡、胃溃疡、十二指肠溃疡、急慢性胃炎、浅表性胃炎、萎缩性胃炎、胃癌、心血管疾病、冠心病、动脉硬化、脑梗塞、高血压、贫血、缺铁性贫血、消化性溃疡复发、胃黏膜萎缩、肠上皮化生、以及血小板减少性紫癜，以及它们的并发症。

[0033] 根据本发明第二方面的药物组合物，其中还包含一种或多种选自下列的药物：抗微生物药、质子泵抑制剂、胃粘膜保护剂等。所述的抗微生物药例如但不限于：青霉素类例如阿莫西林，大环内酯类例如克拉霉素，硝咪唑类例如甲硝唑。所述的质子泵抑制剂例如但不限于：奥美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑。所述的胃粘膜保护剂例如但不限于硫糖铝、思密达等。

[0034] 根据本发明第二方面的药物组合物，其呈口服或注射给药的制剂形式。在一个实施方案中，所述药物组合物呈片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液剂、注射剂(水针和/或粉针)等的形式。

[0035] 本发明第三方面提供了治疗和/或预防与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症的方法，该方法包括给有需要的哺乳动物施用有效量的头花蓼或其提取物。

[0036] 根据本发明第三方面的方法，其中所述与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症包括但不限于，胃粘膜相关性淋巴瘤、消化性溃疡、胃溃疡、十二指肠溃疡、急慢性胃炎、浅表性胃炎、萎缩性胃炎、胃癌、心血管疾病、冠心病、动脉硬化、脑梗塞、高血压、贫血、缺铁性贫血、消化性溃疡复发、胃黏膜萎缩、肠上皮化生、以及血小板减少性紫癜，以及它们的并发症。

[0037] 根据本发明第三方面的方法，其中还在施用所述头花蓼或其提取物之前、同时或之后施用一种或多种选自下列的药物：抗微生物药、质子泵抑制剂、胃粘膜保护剂等。所述的抗微生物药例如但不限于：青霉素类例如阿莫西林，大环内酯类例如克拉霉素，硝咪唑类例如甲硝唑。所述的质子泵抑制剂例如但不限于：奥美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑。所述的胃粘膜保护剂例如但不限于硫糖铝、思密达等。

[0038] 根据本发明第三方面的方法，其中所述的哺乳动物是在身体的任何部位(特别是消化道内，更特别的是胃和十二指肠内)感染幽门螺旋杆菌或者有被幽门螺旋杆菌感染的倾向或可能的任何哺乳动物，包括人类，以及驯养动物(例如但不限于：猪、牛、羊、马等)，试验动物(例如但不限于：狗、猫、大鼠、小鼠、兔、猴等)，伴侣动物(例如但不限于：宠物狗、宠物猫等)，野生动物(例如但不限于：虎、猿、猴、熊猫等)；观赏动物(例如动物园饲养的哺乳动物)。

[0039] 本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

[0040] 本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

[0041] 在本发明中，除非所述及的语境明确含有另外的含义，否则提到的头花蓼是指蓼科蓼属植物头花蓼(Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.D on)，包括其鲜品或干品，包括其全草、地上部分、叶、花、茎、种子或其组合。

[0042] 在本发明中，短语“与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症”可以表示任何疾病，其成因直接或间接与幽门螺旋杆菌感染有关。另外，特别地，“与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症”多数情况下直接表现为胃病，例如胃炎、胃溃疡等，因此，本发明使用本发明所涉及的中药或其提取物治疗或预防的疾病，包括任何成因直接或间接与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或疾病；并且，只要受试个体体内因成因直接或间接与幽门螺旋杆菌感染而造成的身体疾病或病症，使用本发明所涉及的中药或其提取物治疗或预防可显示出临床效果，则均落入本发明的保护范围。例如某个体例如患者，身体出现任何(某种/某些)胃部不适症状，并且经检测其胃中感染有幽门螺旋杆菌，则使用本发明所涉及的中药或其提取物治疗或预防可显示出临床效果，并且这种治疗或预防所涉及的治疗用途和药物组合物以及治疗方法，均落入本发明的保护范围。

[0043] 在本发明中，术语“提取”可以是常温下的浸渍，或者是在升高的温度下的提取(例如煎煮和/或回流)，或者这些操作方式的结合。还可以进一步包括对提取物进行进一步处理，例如进一步进行纯化，例如除溶剂、沉淀除杂质、溶剂萃取、树脂吸附分离等。

[0044] 如本文所述的，术语“提取物”将包括可用于实现本发明目的的任何纯度的提取物，本领域技术人员根据本发明精神可以理解本发明提取物的提取纯度可以在较大的范围内变化。例如本发明头花蓼提取获得的提取物，根据不同的工艺条件的差异，1kg头花蓼经提取可得到10g至500g之间任一量(例如10g至200g，例如10g至150g，例如10g至100g)亦即不同纯度的提取物，本领域技术人员可根据不同需要，使用不同纯度的提取物来调配适合需要的组合物。在本发明的一些实施方案中，所述的提取物可以称为浸膏粉。

[0045] 在本发明中，可以使用有效量的本发明组合物施用于有需要的受试个体。如本文所述的，术语“有效量”是指可在受试者中实现预防和/或治疗本发明所述状况、障碍、病症或疾病的目的剂量。本领域技术人员根据本发明上下文，可以容易地确定本发明组合物的使用剂量。特别地，本据本发明，术语“有效量”可以理解为本发明组合物以适用于任何医学治疗和/或预防的合理效果/风险比治疗和/或预防所述状况、障碍、病症或疾病的足够量。但应认识到，本发明组合物的总日用量可以由本领域技术人员在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的受试者，具体的预防有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体组合物；与本发明组合物组合使用或同时使用的其它治疗活性物质；及医疗领域公知的类似因素。

[0046] 本发明提供包含与一种或多种无毒生理学可接受的载体配制在一起的组合物。所述组合物可特别专门配制成以固体或液体形式供口服施用或供直肠施用，或者配制成供注射施用。

[0047] 供口服施用的固体剂型包括但不限于胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性的生理学可接受赋形剂或载体如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下物质混合：a)填充剂或增量剂如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；b)粘合剂如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；c)保湿剂如甘油；d)崩解剂如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶液阻滞剂如石蜡；f)吸收加速剂如季铵化合物；g)湿润剂如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；h)吸附剂如高岭土和膨润土以及i)润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠和它们的混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述剂型中也可包含缓冲剂。

[0048] 供口服施用的液体剂型包括生理学可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。液体剂型除含有活性组分外还可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及它们的混合物。

[0049] 自从1983年Marshall等人分离出Hp以来，国内外许多学者对Hp进行了大量的研究，发现根除Hp的感染可治疗慢性胃炎，降低消化性溃疡的复发率、阻断或延缓胃黏膜萎缩和肠上皮化生的进一步发展。抑杀Hp成为消化科医生治疗Hp相关病的基本原则。多年来发展了多种针对Hp的治疗方案，目前标准方案是PPI加两种抗生素的三联疗法。但是用抗生素治疗Hp感染的同时，体内正常菌群也被杀灭或抑制，导致胃肠道、口咽部、阴道和皮肤各部位的菌群失调，引发二重感染。常规三联疗法对其根除率逐渐下降。因此寻找合适的药物替代三联疗法显得尤为重要。

[0050] 头花蓼是少数民族地区的常用中药，2000年进入国家基本药物目录。是贵州省中药现代化2010年前重点发展的“六大苗药”和贵州“十五”期间重点培育发展的“七大中药产业链”中的品种之一。目前从头花蓼全草中分离出的有机化合物共六十多个，主要有黄酮类、醛、酮、醇类及萜类化合物，主要有效成分是没食子酸和黄酮类。目前主要用于清热解毒、利尿通淋、肾盂肾炎、尿路结石、膀胱炎、痢疾、风湿痛、跌打损伤、尿道感染、疮疡湿疹等症状。

[0051] 尽管人们已经知晓，头花蓼的水提物在体内外均有一定的抗菌活力，尤其是对淋球菌有较强的抗菌活力，(最小抑菌浓度范围为8-32g/L，平均值为11.2g/L)。其次对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌和肺炎克雷伯菌也有较强的抗菌活力。对部分真菌及厌氧菌中的脆弱杆菌、消化球菌、消化链球菌和痤疮丙酸杆菌、颗粒丙酸杆菌等均具有一定的抗菌作用。然而本发明人令人意外地发现，头花蓼对于幽门螺旋杆菌这种顽固性病原微生物及其所引起的相关病症是有效的。

[0052] 本发明采用琼脂稀释法进行抗菌活性实验。为了实验结果稳定可靠，本实验设立严格的实验对照、重复和平行实验，即每个样品均连续进行三次相同实验，每次实验均对每个浓度至少接种两个平板。结果显示，三次结果一致，阴性对照(即不加菌)无生长、生长对照(即不加药)生长良好、溶剂对照(仅加溶剂不加样品))未见生长抑制现象。我们通过头花蓼提取物的体外抑菌实验发现，其对两株幽门螺旋杆菌ATCC700392和ATCC700824抑菌效果明显(MIC为4mg/mL)。头花蓼提取物对临床分离菌株Hp B-1型(对阿莫西林耐药)、Hp B-2型(对克拉霉素耐药)、Hp B-3型(对甲硝唑耐药)、Hp B-4型(对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑三种药均耐药的菌株)、Hp B-5型(对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑三种药均敏感的菌株)各3株临床株的抗菌活性实验中，为了实验结果稳定可靠，本实验设立严格的实验对照、重复和平行实验，每个样品均连续进行三次相同实验，每次实验均对每个浓度至少接种两个平板。结果显示，三次结果一致，阴性对照(即不加菌)无生长、生长对照(即不加药)生长良好、溶剂对照(即仅加溶剂)未见生长抑制现象、菌株对照(即同时做Hp国际标准测序株ATCC700392)与前期试验结果一致。

[0053] 本发明的结果表明，头花蓼提取物对幽门螺旋杆菌国际标准测序株ATCC700392和ATCC700824两株菌都具有较强的体外抑制Hp效果。此外，头花蓼提取物对临床分离菌株Hp B-1型(对阿莫西林耐药)、Hp B-2型(对克拉霉素耐药)、Hp B-3型(对甲硝唑耐药)、HpB-4型(对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑三种药均耐药的菌株)、Hp B-5型(对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑三种药均敏感的菌株)的实验中具有较强的体外抑制Hp效果。

[0054] 本发明通过对头花蓼提取物体外抗菌活性实验，令人惊奇地发现其具有抗幽门螺旋杆菌的活性。例如在一个实施方案中，将头花蓼提取物分别对两株幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，简称H．pylori,或Hp)ATCC700392和ATCC700824进行体外抑菌实验，在阴性对照(即不加菌)无生长、生长对照(即不加药)生长良好、溶剂对照(即仅加溶剂)未见生长抑制现象的条件下，以完全无菌生长的样品最高稀释度为该菌株对相应样品的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。在另一实施方案中，将头花蓼提取物分别对这五种类型各3株临床分离株进行体外抑菌实验，在阴性对照(即不加菌)无生长、生长对照(即不加药)生长良好、溶剂对照(即仅加溶剂)未见生长抑制现象、样品对照(即同时做第一阶段H-2-65样品)与第一阶段实验结果一致、菌株对照(即同时做Hp国际标准测序株ATCC700392)与前期试验结果一致条件下，以完全无菌生长的样品最高稀释度为该菌株对相应样品的最低抑菌浓度。本发明人发现：(1)头花蓼提取物作用于Hp ATCC700392和ATCC700824时抑菌效果明显(MIC为≤4mg/mL)。(2)头花蓼提取物对Hp B-1型(对阿莫西林耐药)临床分离3株菌的抑菌效果明显(MIC为4μg/mL)；对Hp B-2型(对克拉霉素耐药)临床分离3株菌的抑菌效果明显(MIC为4μg/mL)；Hp B-3型(对甲硝唑耐药)临床分离3株菌的抑菌效果明显(MIC为≤2μg/mL)；Hp B-4型(对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑三种药均耐药的菌株)临床分离3株菌的抑菌效果明显(MIC为≤8μg/mL)，Hp B-5型(对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑三种药均敏感的菌株)临床分离3株菌的抑菌效果明显(MIC为≤4μg/mL);(3)DH-2-65、DH-2-24对Hp临床分离株的抑菌效果明显(MIC为≤4μg/mL)。由此，头花蓼提取物对两株幽门螺旋杆菌国际标准测序株ATCC700392和ATCC700824两株菌都具有较强的体外抑菌效果；头花蓼提取物对临床分离菌株的实验中具有较强的体外抑制Hp效果，从而有望成为一种全新的抗菌药物特别是可以用于治疗和/或预防与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症。

附图说明

[0055] 图1显示了头花蓼提取物对幽门螺旋杆菌体外抑菌的结果。

[0056] 图2显示了头花蓼提取物处理幽门螺旋杆菌后细菌显微形态的电镜图。

具体实施方式

[0057] 下面通过具体的实施例/实验例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例和实验例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

[0058] 本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

[0059] A、制备实施例部分

[0060] 实施例1：制备头花蓼地上部分水提取物

[0061] 取头花蓼地上部分(干品)220kg，洗净，加入7倍量水，加热煮沸1.5小时，过滤，药渣中加入6倍量水，煮沸1.0小时，过滤。合并滤液，浓缩至相对密度为1.2(20℃)得到浸膏，喷雾干燥得到浸膏粉23.1kg(收率10.4%)，为本实施例的头花蓼提取物：棕色粉末；每g样品相当于原生药8.7g；采用分光光度计法测定，黄酮含量：18.21mg/g，没食子酸含量：17.82mg/g。

[0062] 取以上浸膏粉1份，加2份淀粉、2份微晶纤维素，混合均匀，装胶囊，即为本发明的药物组合物。

[0063] 实施例2：制备头花蓼全草水提取物(喷雾干燥)

[0064] 参考实施例1的方法，不同之处是用头花蓼全草(鲜品)代替头花蓼地上部分进行提取，得本实施例的头花蓼提取物。收率8.12%。

[0065] 实施例3：制备头花蓼根95%乙醇提取物

[0066] 取头花蓼干燥根10kg，洗净，置不锈钢浓缩罐内，加入7.5倍量的95%乙醇，回流提取1.5小时，过滤。药渣加入7.5倍量95%乙醇，回流提取1.0小时，过滤。合并两次滤液，浓缩得浸膏，减压干燥，得到本实施例提取物，0.34kg。

[0067] 实施例4：制备头花蓼茎75%乙醇提取物

[0068] 参考实施例3相同的方法，不同之处是将头花蓼干燥茎用75%乙醇进行提取，得本实施例提取物。收率5.74%。

[0069] 实施例5：制备头花蓼叶60%乙醇提取物

[0070] 参考实施例3相同的方法，不同之处是将头花蓼干燥叶用60%乙醇进行提取，得本实施例提取物。收率8.62%。

[0071] 实施例6：制备头花蓼种子30%乙醇提取物

[0072] 参考实施例3相同的方法，不同之处是将头花蓼干燥种子用30%乙醇进行提取，得本实施例提取物。收率13.4%。

[0073] 实施例7：制备头花蓼糖浸物

[0074] 取头花蓼地上部分(干品)，粉碎成细粉，与饱和蔗糖溶液混合(1：1，重量)混合(注意防止微生物生长)，放置3个月以上。放置3个月的混合物经挤压使固液分离，并使固形物水份含量低于15%，所得浸取液作为本发明提取物用于本发明的生物学试验例部分。下文试验例中结果显示该浸取液的有效性，表明头花蓼药材即可直接(例如直接与糖混合制成蜜丸)用于本发明期望的用途。

[0075] 实施例8：制备头花蓼全草7％乙醇提取物

[0076] 取头花蓼全草10kg，洗净，置不锈钢浓缩罐内，加入7-8倍量80%乙醇，回流提取1.5小时，过滤。药渣加入5倍量60%乙醇，回流提取1.5小时，过滤。合并两次滤液，浓缩得浸膏，减压干燥得到提取物0.74kg。

[0077] 实施例9：制备头花蓼全草水煎醇沉溶液粉

[0078] 取头花蓼全草10kg，洗净，加入350kg水，加热煮沸1.5小时，转移上清液，残渣中加入150kg水，煮沸1.0小时。合并煎煮液，过滤浓缩至相对密度为1.04(24℃)得浸膏16kg。加入95%乙醇调至含醇量为60%，静至24小时，分取溶液。向沉淀加入95%乙醇调至含醇量为60%，静至24小时，分取溶液，合并两次溶液，挥去乙醇，80℃减压干燥得头花蓼全草水煎醇沉溶液粉0.78kg，作为本实施例的提取物。

[0079] 实施例10：制备头花蓼全草水煎醇沉沉淀粉

[0080] 取头花蓼全草10kg，洗净，加入350kg水，加热煮沸1.5小时，转移上清液，残渣中加入150kg水，煮沸1.0小时。合并煎煮液，过滤浓缩至相对密度为1.04(24℃)得浸膏16kg。加入95%乙醇调至含醇量为60%，静至24小时，分取溶液。向沉淀加入95%乙醇调至含醇量为60%，静至24小时，分取溶液，合并两次溶液，挥去乙醇，80℃减压干燥得头花蓼全草水煎醇沉溶液粉0.78kg；由16kg浸膏以后处理步骤所得沉淀于80℃减压干燥，得头花蓼全草水煎醇沉沉淀粉0.49kg，作为本实施例的提取物。

[0081] 实施例11：制备头花蓼原药粉二氧化碳超临界萃取提取物

[0082] 取头花蓼地上部分原药粉10kg，洗净，投入超临界萃取釜中，对萃取釜和两个解析釜加热，对贮罐进行冷却，当温度达到预定的温度时，打开二氧化碳气瓶送气，当压力达到预定压力时，开始循环萃取，调节流量，并加入夹带剂，恒温恒压萃取2小时。将得到的液体减压浓缩得到浸膏0.17kg，作为本实施例的提取物。

[0083] 实施例12：制备头花蓼药渣二氧化碳超临界萃取提取物

[0084] 取头花蓼药渣(实施例1所得总药渣与实施例8所得总药渣以重量比1:1的混合物)10kg，投入超临界萃取釜中，对萃取釜和两个解析釜加热，对贮罐进行冷却，当温度达到预定的温度时，打开二氧化碳气瓶送气，当压力达到预定压力时，开始循环萃取，调节流量，并加入夹带剂，恒温恒压萃取2小时。将得到的液体减压浓缩得到浸膏0.131kg。

[0085] 实施例13：制备头花蓼药渣二氧化碳超临界萃取提取物

[0086] 取头花蓼地上部分(干品)30kg，加8倍量的水，在80-100°C间煎煮60分钟，提取液排入沉淀缸，再向煎煮锅内加入药材4倍量的水，在80-100°C间煎煮60分钟，提取液排入沉淀缸并与前次提取液合并，待澄清后取上清液送入真空浓缩锅，在60-80°C下减压浓缩至膏状，然后将此膏状物送入乙醇提取锅内，用3倍量65%乙醇提取2次，再将乙醇提取液送入真空浓缩锅内，在70-90°C下除去乙醇，减压浓缩，干燥，即得本实施例提取物，收率3.82%。

[0087] 实施例14：制备头花蓼提取物

[0088] 头花蓼地上部分(干品)10kg，加水80升，回流提取2次，每次2h，合并提取液，静置过夜，离心。滤液上大孔吸附树脂AB-8(10kg)，先用水洗2个柱体积，弃去洗脱液，再用85%乙醇洗3个柱体积，收集洗脱液，常压干燥，得头花蓼提取物。

[0089] 经检测，该提取物含总黄酮为15%，没食子酸为2.5%。

[0090] 实施例15：制备头花蓼提取物

[0091] 头花蓼地上部分(干品)10kg，加10倍量50%乙醇，回流提取3次，每次1.5h，合并提取液，减压回收乙醇至乙醇含量低于10%，上大孔吸附树脂NKA-9，先用水洗2个柱体积，弃去洗脱液，再用10%乙醇洗脱2个柱体积，弃去洗脱液，再用80%乙醇洗3个柱体积，收集洗脱液，减压干燥，得头花蓼提取物。

[0092] 经检测，该提取物含总黄酮为41%，没食子酸为11%。

[0093] 实施例16：制备头花蓼提取物

[0094] 头花蓼地上部分(干品)10kg，加10倍量95%乙醇，回流提取2次，每次2h，合并提取液，减压回收乙醇至乙醇含量低于10%，上大孔吸附树脂HPD400，先用水洗2个柱体积，弃去洗脱液，再用90%乙醇洗2个柱体积，收集洗脱液，喷雾干燥，得头花蓼提取物。

[0095] 经检测，该提取物含总黄酮为39%，没食子酸为7%。

[0096] 实施例17：制备头花蓼提取物

[0097] 头花蓼地上部分(干品)10kg，加10倍量95%乙醇，回流提取2次，每次2h，合并提取液，减压回收乙醇至乙醇含量低于10%，上大孔吸附树脂HPD100，先用水洗2个柱体积，弃去洗脱液，再用90%乙醇洗2个柱体积，收集洗脱液，减压干燥，得头花蓼提取物。

[0098] 经检测，该提取物含总黄酮为32%，没食子酸为8%。

[0099] 实施例18：制备头花蓼提取物

[0100] 头花蓼地上部分(干品)10kg，加8倍量水，回流提取2次，每次2h，合并提取液，静置过夜，离心。滤液上大孔吸附树脂ADS-17，先用水洗2个柱体积，弃去洗脱液，再用10%乙醇洗脱2个柱体积，弃去洗脱液，再用90%乙醇洗2个柱体积，收集洗脱液，减压干燥，得头花蓼提取物。

[0101] 经检测，该提取物含总黄酮为37%，没食子酸为9%。

[0102] B、生物学试验例部分

[0103] 试验例1：头花蓼提取物(实施例1)对幽门螺旋杆菌标准株及临床分离菌株的抗菌活性检测

[0104] 1)实验菌株

[0105] 标准菌株：所用的两株菌株为幽门螺旋杆菌ATCC700392和幽门螺旋杆菌ATCC700824国际标准测序株，购自ATCC(美国菌种保藏中心)，传代次数在10代以内。

[0106] 临床分离菌株：为幽门螺旋杆菌临床分离菌株，均是贵阳医学院消化内科将做胃镜检查证实为消化性溃疡和慢性胃炎，同时镜下活检粘膜快速尿素酶测定为阳性的病人，将其活检的胃窦部粘膜分离Hp菌株。Hp菌株的鉴定采用国际公认幽门螺旋杆菌的鉴定方法，分为形态学、尿素酶、氧化酶、过氧化氢试验、血清学试验。临床分离到五种菌株(命名)及其特性分别为：

[0107] Hp B-1型：其对阿莫西林耐药，

[0108] Hp B-2型：其对克拉霉素耐药，

[0109] Hp B-3型：其对甲硝唑耐药，

[0110] Hp B-4型：其对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑三种药均耐药的菌株，[0111] Hp B-5型：其对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑三种药均敏感的菌株。

[0112] 2)试验使用的一些主要试剂

[0113] 哥伦比亚血琼脂和脑心浸液粉得自英国OXOID，无菌脱纤维羊血得自北京燕生政博生物科技有限公司，氧化酶试剂、尿素酶试剂、触酶试剂和E-test试条得自生物梅里埃公司，盐酸万古霉素、两性霉素、磺胺(TMP)和多黏菌素B得自美国Sigma公司。

[0114] 3)试验样品

[0115] 本发明一部分实施例所得头花蓼提取物。

[0116] 4)主要试剂和材料的制备：

[0117] 4.1)混合抗生素：按说明书的方法配制

[0118] 盐酸万古霉素30mg，TMP25mg，多黏菌素B20mg，两性菌素20mg、灭菌蒸馏水100ml。

[0119] 4.2)普通哥伦比亚血平板的制备：

[0120] 按说明书方法配制，于三角瓶中称取哥伦比亚琼脂基础8g，置于250ml锥形瓶中，加入180ml单蒸水，经121℃20min高压蒸汽灭菌后，冷却至56℃左右，在超净工作台中加入混合抗生素2ml和无菌脱纤维羊血20ml，调PH值为7.2，振荡混匀后快速倾倒平板，每皿约20ml，琼脂冷却凝固后放入4℃冰箱保存，3天内使用，同时随机选择一皿放入37℃温箱培养24h，确保无菌生长该批培养皿方可使用。

[0121] 4.3)含样品血平板的制备：

[0122] 不同浓度的样品血平板配制：于三角烧瓶中称取哥伦比亚血琼脂粉3.9g，加入89ml单蒸水，高压蒸汽灭菌后，冷却至50℃左右，每个样品不同梯度浓度的血平板按照浓度从高到低依次加入相应样品母液，使其终浓度为8mg/mL、4mg/mL、1024μg/mL、512μg mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL，同时加入1ml混合抗生素和10ml无菌脱纤维羊血，振荡混匀后快速倾倒平板(平板直径为90mm)，琼脂冷却凝固后即可使用。

[0123] 4.4)含溶媒血平板的配制(溶剂对照)：方法同含样品血平板的配制，即加入相应体积的二甲亚砜或无水乙醇替代样品母液，以双蒸水作为溶剂则不需配制。

[0124] 5)实验方法

[0125] 5.1)幽门螺旋杆菌标准株的复苏培养及菌株的鉴定

[0126] 从-80℃冰箱中取出幽门螺旋杆菌ATCC700392和幽门螺旋杆菌ATCC700824标准菌株，置于37℃水浴箱中溶解，用接种环醮取菌液均匀涂布于含混合抗生素的哥伦比亚血平板上，置于厌氧培养盒中，并于盒内放置两袋微需氧产气袋(85%N2，10%CO2，5%O2)，密封后置37℃培养72-96h。对这两株标准菌株进行培养特性、革兰染色、尿素酶鉴定、过氧化氢酶鉴定、氧化酶鉴定。

[0127] 5.2)菌液配制：将血平板上的菌落或菌苔刮至预冷含2ml脑心浸液肉汤管中，离心洗涤三次后，重悬于4℃脑心浸液肉汤中，将此菌液作10倍、100倍、1000倍稀释后，在紫外分光光度计上测菌液的OD600值，结果位于0.1-1.0之间的OD值与菌液浓度有较好的线8
性关系，菌液含量的计算公式如下：菌量/ml=2.2×10×OD600值×稀释倍数。将菌液稀释
8
得到10CFU/mL。在15分钟内完成菌液配制和接种，接种过程中菌液需保持在4℃。

[0128] 5.3)头花蓼提取物的体外抗菌活性实验

[0129] 5.3.1)菌液涂布：吸取200μl浓度为108CFU/mL菌液，用L型棒在琼脂表面均匀涂布。按每种样品每个浓度均涂布2块平板。同时设阴性对照(即不加菌)、生长对照(即不加实验样品)、溶剂对照各两块平板。

[0130] 5.3.2)培养：按照说明书方法，置于厌氧培养盒中，并于盒内放置两袋微需氧产气袋，密封后37℃培养72-96h后观察结果。每个样品的体外抗菌活性实验重复两次。

[0131] 5.3.3)头花蓼提取物抑菌效果判定：在阴性对照(即不加菌)无菌生长、生长对照(即不加实验样品)生长良好、溶剂对照无生长抑制现象的条件下，以完全无菌生长的样品最高稀释度为该菌株对相应样品的MIC。

[0132] 6)实验的结果：

[0133] 6.1)幽门螺旋杆菌的鉴定

[0134] 两株幽门螺旋杆菌ATCC700392和ATCC700824及临床分离株在普通哥伦比亚血平板上置于微需氧条件下培养72-96小时，菌落呈针尖状无色透明，光滑湿润，边缘整齐，凸起，呈小水滴样，菌苔灰白色，发油光。

[0135] 生化试验：尿素酶试验阳性，氧化酶试验阳性，过氧化氢酶试验阳性；在显微镜油镜下观察，典型的海鸥状，S状，革兰染色阴性。

[0136] 6.2)头花蓼提取物的体外抗菌活性试验实验结果见表1。

[0137] 表1、本发明实施例1的提取物对幽门螺旋杆菌体外抑菌结果(MIC)

[0138]

[0139]

[0140] 在本实施例的平行试验中，同时验证了阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑三者对上表中七种幽门螺旋杆菌的敏感性，结果与通常检测中所得基本一致，即三种药物对ATCC700392和ATCC700824均敏感，而Hp B-1对阿莫西林耐药，对另外两种药物敏感；Hp B-2对克拉霉素耐药，对另外两种药物敏感；Hp B-3对甲硝唑耐药，对另外两种药物敏感；Hp B-4对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑三种药物均耐药；Hp B-5对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑三种药均敏感。

[0141] 此外，肉眼观察各试验组细菌(ATCC700392)生长情况，结果见图1。其中图1a是细菌在培养基中生长的生长对照组，显示细菌生长正常，为均匀分散的小白点；图1b是细菌在添加了用于配制药液的溶媒的培养基中生长的溶媒对照组，显示细菌生长正常，为均匀分散的小白点；图1c是平行试验中未加入细菌的平皿，为阴性对照组，显示无细菌生长，无典型细菌生长的小白点；图1d、1e、1f分别是本发明实施例1提取物加至细菌生长的平皿中后2天、3天、4天肉眼观察的结果，显示在2天细菌明显比生长对照组少，第3天仅出现个别的散在细菌小白点，而到第4天完全见不到细菌，与阴性对照组的平皿类似。

[0142] 另外，以上试验中，在ATCC700392菌组，取空白对照0天、空白对照4天、头花蓼处理2天、头花蓼处理4天的培养物，分别进行电镜检查，结果分别见图2a、2b、2c、和2d。从图中可见，空白对照0天培养物的细菌呈杆状、面包圈样、U型等多种形态菌体表面光滑，边缘整齐，电子密度均一(图2a)；空白对照4天培养物的细菌呈短杆状、面包圈样、U型等多种形态，菌体表面光滑、边缘整齐(图2b)；头花蓼处理2天培养物的细菌呈短杆状、U型、面包圈样等多种形态，有部分菌体表面有凹陷、缺失等表现(图2c)；头花蓼处理4天培养物的细菌呈长杆状、螺杆状、一端向内弯曲等形态部分菌体表面凹陷严重，部分菌体(如最右边菌)从中间出现分裂(图2d)。

[0143] 试验例2：头花蓼提取物对幽门螺旋杆菌标准株及临床分离菌株的抗菌活性检测[0144] 基本上参考试验例1的方法，分别以实施例2-18所得提取物为试药，测试这些提取物对ATCC700392、ATCC700824、Hp B-1、Hp B-2、Hp B-3、Hp B-4、Hp B-5的抗菌活性，结果所有提取物对这七种幽门螺旋杆菌的MIC值在0.05~8mg/mL之间，例如实施例2-10、17提取物对的七种幽门螺旋杆菌的MIC值在1~8mg/mL之间，实施例11-16、18提取物对的七种幽门螺旋杆菌的MIC值在0.05~2mg/mL之间。

[0145] 试验例3：头花蓼提取物(实施例1所得提取物)的体内实验

[0146] 通过建造幽门螺旋杆菌感染小鼠的模型，然后用头花蓼治疗后，观察Hp的根除情况和胃粘膜炎症的改善情况，判断头花蓼在体内抑制或杀灭Hp的效果。实验菌株选用标准菌株ATCC700392和SS1，实验动物选用SPF级BALB/c小鼠。实验方法如下：

[0147] 1)建造动物模型分组：标准株700392和SS1：阴性对照组、阳性对照组和实验组。

[0148] 2)复苏菌株：复苏标准菌株ATCC700392和SS1，并传代一次，分别为给动物灌胃做准备。

[0149] 3)动物预处理：给动物编组编号；断食、断饮24h；50%乙醇0.3ml灌胃，继续断食断饮。

[0150] 4)感染Hp：乙醇预处理24h后以109自调菌液0.5ml灌胃；0.5ml/只上、下午各1次，隔天上午以同浓度同剂量再灌喂1次，对照组以无菌肉汤灌喂，4h后供食、水。感染8周后使动物分组进行给药。另外取部分动物，于末次感染后第4周、第8周和第12周后分别处死小鼠，观察是否建造幽门螺旋杆菌感染的小鼠模型成功，以及感染是否持续存在，观察项目如下：(1)处死后取出鼠胃窦部粘膜组织,一半进行培养、涂片及快速尿素酶纸片试验；(2)动物眼球放血，分离血清，-20℃保存ELISA试验检测抗Hp抗体；(3)另一半粘膜组织作HE染色以观察其Hp定植情况和粘膜组织的炎症程度等病理变化。结果显示感染8周后全部动物造模成功并且到12周时仍然持续存在感染。

[0151] 5)药物治疗和检测：感染8周后使动物分组进行给药，每组20只动物。实验组给予实施例11提取物，250mg/kg/d(5%的CMC-Na溶液溶解/混悬)，连续14天；阳性对照组给予阿莫西林，250mg/kg/d(5%的CMC-Na溶液溶解/混悬)，连续14天)，阴性对照组给予同体积的CMC-Na溶液。治疗结束后4周观察小鼠胃部症状，是否改善以及幽门螺旋杆菌是否根除。肉眼观察，结果显示，在每种菌株的试验中，实验组和阳性对照组中80%以上的动物胃粘膜正常，无溃疡，显示幽门螺旋杆菌已根除，而阴性对照组全部动物胃部均有明显的溃疡面。

[0152] 试验例4：头花蓼提取物对Hp感染C57BL/6小鼠的胃粘膜保护作用

[0153] 1、材料与方法

[0154] 菌株：幽门螺杆菌ATCC700392国际标准测序株，购自ATCC(美国菌种保藏中心)，传代次数在10代以内。幽门螺杆菌Hp悉尼株SS2000由中国疾病控制中心传染病所张建中、何利华教授惠赠。动物：70只SPF级C57BL/6小鼠，6~8周龄，♀35， 体重(20±5)g，由重庆医科大学实验动物中心提供，合格证号：SYXK(渝)2007-0001。

[0155] 药物：头花蓼浸膏粉，棕色粉末，生药含量为8.72g/g，黄酮含量：18.2mg/g，没食子酸含量：17.8mg/g，照《中华人民共和国药典2010年版一部》“热淋清颗粒”品种的制备方法得到的干燥浸膏粉，未加辅料，以下可用代号HL-1112表示该药物。

[0156] 使用时，可以用无菌双蒸水溶解成浓溶液(例如320mg/mL)，4℃保存备用，临用稀释。

[0157] 2、实验方法

[0158] (1)苗药HL--1112对Hp最低抑菌浓度(MIC)的检测

[0159] 哥伦比亚血琼脂平皿的配制：称取哥伦比亚血琼脂粉3.9g，加入89mL去离子水，高压灭菌(121℃，20min)处理后，待琼脂冷却至50℃～55℃时加入10mL(10%)无菌脱纤维羊血、1mL(1%)混合抗生素充分混充，倾倒于直径为90mm的无菌平皿中，使琼脂厚度为3mm～4mm，并随机取一皿置于37℃恒温箱内培养24h做无菌试验，其余均放入4℃冰箱内备用。

[0160] 幽门螺杆菌SS2000和ATCC 700392的培养：从-80℃冰箱中取出待测菌株-幽门螺杆菌SS2000和ATCC 700392，室温溶解后倾倒于哥伦比亚血琼脂平皿内，涂布均匀，37℃恒温箱内培养72h(5%O2、10%CO2、85%N2，相对湿度95%以上)，观察细菌生长情况并进行Hp鉴定实验:革兰氏染色、氧化酶、触酶、尿素酶实验；将鉴定实验均为阳性的细菌进行传代培养72h后重复观察细菌生长情况及并进行细菌鉴定实验，将细菌再次转种于哥伦比亚血琼脂平皿中培养72h。

[0161] HL-1112药物平皿的配置：称取17.55g哥伦比亚固体琼脂粉末溶解于378mL去离子水中，分装于9个三角烧瓶内高压灭菌后，待培养基冷却至50～55℃左右时加入5mL(10%)脱纤维羊血、0.5mL(1%)混合抗生素，再加入对应稀释度的药液2.5mL,充分混匀后，倒入2个无菌平皿(90mm直径)中，凝固后4℃保存。苗药HL-1112溶液的稀释度及对应平板的含药浓度见下表。

[0162]

[0163] 药敏实验：将培养72h菌龄的幽门螺杆菌用脑心浸液肉汤制备菌悬液，调配其浓度在3×108CFU/mL，无菌棉签沾取菌悬液均匀涂布于含不同浓度的药物培养皿及空白培养皿上，每个药物浓度涂抹两个平皿，置于微需氧环境中37℃培养72h。在空白培养皿上细菌生长良好，苗药HL-1112对Hp ATCC700392的MIC为4mg/mL的情况下，以含药培养皿上未见细菌生长的最小药物浓度为苗药HL-1112对Hp SS2000的最小抑菌浓度(MIC)，并对所生长细菌做革兰氏染色和生化鉴定实验。

[0164] (2)幽门螺杆菌感染小鼠慢性胃炎的模型建立

[0165] 幽门螺杆菌培养：取出冻存在-80℃的Hp SS2000菌株，待室温溶解后，倾倒于哥伦比亚血琼脂培养基上，混匀以后，将接种的平皿放入三气培养箱中(5%O2，10%CO2，85%N2)，湿度保持90%以上，培养72h，连续传代两次。

[0166] 菌液制备：造模前C57BL/6适应性饲养1周，后将动物按体重、雌雄分层随机分成正常组(20只)与造模组(50只)；Hp培养72h收获，刮取菌落，混悬与无菌脑心浸液肉汤8
中，紫外分光光度计测定菌液浓度，当A600=1时，细菌浓度为2.2×10cfu/mL，将菌液浓度
9
调制1×10cfu/mL，4℃保存。

[0167] Hp接种小鼠：按照文献介绍接种Hp；具体步骤如下：禁食禁水12h，首先给小鼠灌9
饲0.3mL 50%乙醇，隔天接种制备好的Hp标准菌株SS2000菌液0.5mL(1×10cfu/mL)，间隔1d，共灌胃5次，正常组以等量的无菌脑心浸液肉汤代替；所有小鼠灌胃处理前禁食、禁水12h，灌胃后禁食、禁水4h；末次灌胃8w后，禁食、禁食24h，从正常组和造模组随机抽取
10只小鼠，处死后立即解剖，取出胃腔，沿胃大弯侧剪开，无菌PBS清洗冲洗胃内容物，纵向分为3份，其中1块组织行快速尿素酶检测，1块组织匀浆后进行倍比稀释行Hp培养，另1块组织经石蜡包埋，切片后行HE及Giemsa染色，进行病理组织学及Hp检查；标本培养后对可疑菌落革兰氏染色具有典型特征并且尿素酶实验、触酶试验及氧化酶试验均阳性判定为Hp感染；病理组织学判断按照慢性胃炎悉尼诊断标准，采用半定量计分方法对Hp密度、慢性炎症、炎症活动性、萎缩和肠上皮化生进行评分，以炎症造模是否成功。

[0168] 标本处理：

[0169] (a)Hp定植标准：快速尿素酶实验，将新鲜的小鼠胃粘膜组织放入尿素酶试剂中，组织放入后30min内试剂由桔黄色变为红或紫红色者是阳性。Giemsa染色，石蜡切片入二甲苯中脱蜡，各级酒精梯度脱水，2%Giemsa染色液中染色30min，二甲苯透明，封片，Hp菌体呈深蓝色。Hp的组织培养：称量粘膜组织后，匀浆，取200μL均匀涂布与哥伦比亚血琼脂空白平板培养，培养5~7d后，对培养出的菌落行尿素酶、触酶和氧化酶进行Hp鉴定，并涂片镜检Hp形态。三者中两项阳性即为Hp定植阳性。

[0170] (b)Hp定植密度：称量粘膜组织后，匀浆，然后去匀浆液做10-1系列稀释，每个稀释度取200μL均匀涂布与哥伦比亚血琼脂空白平板培养，培养5~7d后，计数平板中的活菌数，然后换算成每克胃组织中的活菌数(cfu)，定植密度以Igcfu/g组织表示；

[0171] (c)小鼠胃组织病理学检测：组织块用10%甲醛常规固定，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，4μm切片。60℃烤片2h。HE染色：组织切片经脱蜡和梯度乙醇处理脱水，苏木素染色液中染色，盐酸酒精分色，氨酒精分色，冲洗后伊红染色5min，常规脱水、透明、封片。胞核染成蓝色，胞质和Hp均染成淡红色。

[0172] (d)病理改变的判定标准：小鼠的胃炎参照人胃炎的分类法(2000年全国慢性胃炎研讨会共识意见中的分类方法)，根据慢性炎症细胞(淋巴细胞、浆细胞及嗜酸性粒细胞)的数量级浸润胃壁的深度分为3级并计分：无炎症0分；炎症局限于粘膜浅层1/3以为为轻度计1分；深达2/3为中度计2分；超过2/3或全层并细胞密集者为重度计3分。炎症活动性计分：固有层有散在的中性粒细胞计1分，固有层有较多的中性粒细胞计2分，固有层有大量的中性粒细胞计3分。

[0173] (e)造模成功判断标准：小鼠胃内有Hp定植且胃粘膜出现慢性炎症病理学改变判断为造模成功。

[0174] (3)苗药HL-1112干预治疗Hp感染小鼠慢性胃炎

[0175] (a)小鼠分组：将造模组小鼠平均分成4组，每组10只，分别为模型组、HL-1112高剂量组、HL-1112中剂量组和HL-1112低剂量组。

[0176] (b)给药方案：苗药HL-1112浸膏，生药含量为8.72g/g取，无法测出其LD50，苗药HL-1112对小鼠的最大耐受量为249.0g/kg/d其1/5MTD、1/10MTD、1/20MTD分别作为高、中、低组给药剂量，用蒸馏水配成浓度为49.8g/kg/d的高剂量、24.9g/kg/d的中剂量和12.45g/kg/d的低剂量。造模成功后开始灌胃给药，模型组均给予无菌PBS 0.5mL，苗药HL-1112高、中、低剂量组每只分别给予高、中、低剂量的HL-1112水溶液0.5mL。以上各组均每日灌胃1次，连续给药2w。空白组：正常饲养，不灌胃。

[0177] (c)观察疗效：治疗结束后4w，将实验小鼠颈椎脱臼法处死，剖腹取出胃组织，沿胃大弯纵行剖开，用灭菌PBS水洗去除胃内容物，取胃窦部小弯侧组织，纵向分为3份，其中1块组织行快速尿素酶检测，1块组织匀浆后进行倍比稀释行Hp培养，另1块组织置于10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片后行HE及Giemsa染色，进行病理组织学及Hp检查。小鼠处死前，禁食禁水24h。

[0178] (d)统计学分析：计量资料以“均值±标准偏差”表示，使用SPSS 15.0软件包进行统计学分析。采用F检验统计各组间差异，两两比较采用q检验。

[0179] 3、实验结果

[0180] (1)Hp菌株的培养及鉴定

[0181] Hp国际标准株SS2000在哥伦比亚血琼脂平板上培养72h后，菌落细小呈针尖状、光滑湿润、半透明有光泽。涂片革兰氏染色后镜检，细菌为螺旋状、S形、弧形或海鸥状的G-杆菌，生化鉴定实验尿素酶、触酶、氧化酶均为阳性。

[0182] (2)苗药HL-1112对Hp最低抑菌浓度(MIC)的检测

[0183] 以空白平皿中细菌生长良好，苗药HL-1112对Hp国际标准测序株ATCC 700392的最低抑菌浓度MIC=4mg/mL的对照下，实验重复3次，均观察到Hp在0.125mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL的含药平皿中生长状态良好，在2mg/mL的含药平皿中生长稀薄，在4mg/mL、8mg/mL和16mg/mL的平皿中未见有细菌生长。故苗药HL-1112对Hp SS2000的最低抑菌浓度MIC为4mg/mL。

[0184] (3)Hp定植与分布

[0185] 正常组动物胃窦、胃体及十二指肠粘膜的尿素酶实验、Giemsa染色以及胃粘膜Hp培养结果均显示阴性。在接种Hp后第8w时，模型组小鼠胃窦、胃体粘膜尿素酶阳性率、Giemsa染色示定植率、Hp培养阳性率均为100%，Giemsa染色显示在胃体部及胃窦部都可观察到细菌的定植，以胃窦部位的粘膜腺体观察到的定植细菌最多，在胃腺体表面及上层粘液中亦可见大量细菌。HL-1112干预后，其高、中、低剂量组小鼠病理组织学Giemsa染色，大部分未见Hp定植在胃窦组织。

[0186] (4)小鼠病理组织学检查结果

[0187] 末次菌液灌胃8w后模型组小鼠的胃粘膜出现与人类类似的慢性活动性胃炎的病理改变，出现炎症细胞浸润，胃粘膜的完整性与连续性受到破坏，以幽门粘膜为中心的胃粘膜上皮细胞间及固有层可见大量淋巴细胞浸润，中间夹杂少量中性粒细胞浸润和浆细胞浸润，炎症评分为2.5分。空白组小鼠的胃粘膜完整，腺体排列规则，间质、粘膜积层未见明显异常，少见淋巴细胞浸润，病理评分为0.5分。经统计，模型组与空白组比较，胃粘膜炎性细胞的浸润程度差异有显著性意义。

[0188] HL-1112低剂量组小鼠胃粘膜可见围绕粘膜肌层和腺体周围有少量散在的炎细胞浸润，病理评分为1~1.5分；HL-1112中、高剂量治疗组小鼠胃粘膜病变，见粘膜层和腺体间有极少量的炎细胞，病理评分为1分。可见HL-1112对幽门螺杆菌感染造成的小鼠慢性胃炎有显著的改善效果。在另外一些试验中，参照上述方法，在给予HL-1112时同时给予阿莫西林或奥美拉唑(后二者剂量分别为10mg/kg/d、1mg/kg/d)，结果显示比单用HL-1112的相应组相比病理评分均低0.5分，显示两类药物组合使用效果更理想。

[0189] (5)各组Hp根除率：结果显示，HL-1112高、中、低剂量组与模型组比较均有统计学差异(P<0.05)；HL-1112高、中、低剂量组与空白组比较均无统计学差异(P>0.05)，HL-1112高、中、低剂量组之间两两比较无统计学意义(P>0.05)，说明HL-1112高、中、低剂量组之间比较对Hp的根除率无明显差异。