本发明公开一种透膜肽介导的反义抗菌剂，包含PLNA787，所述的PLNA787为透膜肽(KFF)3K与LNA787之间以半胱氨酸-〔4-(N-马来酰亚胺甲基)-1-环己酰胺〕-己烷进行连接，以固相合成法制备而得。本发明的透膜肽介导的反义抗菌剂以细菌治病基因为靶点，具有高特异性、高效性、低毒、安全等优点，对耐药菌的生长具有显著的抑制作用，尤其可以显著拮抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长。
1.一种透膜肽介导的反义抗菌剂，其特征在于：包含(KFF)3K-Cys-SMCC-C6-LNA787，所述的(KFF)3K-Cys-SMCC-C6-LNA787为透膜肽(KFF)3K与LNA787之间以半胱氨酸-〔4-(N-马来酰亚胺甲基)-1-环己酰胺〕-己烷进行连接；
所述LNA787的序列为5'-T+*GA+CT*C+GCC*A+C+CA*GTAA*TA+T+*T-3'，其中A为腺嘌呤核苷酸单体，T为胸腺嘧啶核苷酸单体，C为胞嘧啶核苷酸单体，G为鸟嘌呤核苷酸单体；*X代表硫代修饰，X+代表LNA修饰，X为A、T、C或G；
所述硫代修饰的核苷酸如式（Ⅰ）所示，所述LNA修饰的核苷酸结构中2′-O位和
4′-C位通过缩水作用形成氧亚甲基桥，并连接成环形，如式（Ⅱ）所示：
所述透膜肽(KFF)3K的序列为5'-KFFKFFKFFK-3'，其中K为赖氨酸，F为苯丙氨酸；
所述(KFF)3K-Cys-SMCC-C6-LNA787的序列为：
5'-KFFKFFKFFK-Cys-SMCC-C6-T+*GA+CT*C+GCC*A+C+CA*GTAA*TA+T+*T-3'；
2.根据权利要求1所述的透膜肽介导的反义抗菌剂，其特征在于：核苷酸单体中的碱基为鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶。
3.一种权利要求1所述透膜肽介导的反义抗菌剂的制备方法，其特征在于：所述的(KFF)3K-Cys-SMCC-C6-LNA787是将透膜肽(KFF)3K和LNA787通过作为空间间隔的Cys-SMCC-C6共价连接，以固相合成法制备而得；制备步骤如下：（1）透膜肽(KFF)3K的制备：通过芴甲氧羰基固相合成方法（Fmoc-SPPS）合成，即以HATU/DIEA为缩合剂，在MBHA-Rink树脂上，采用Fmoc保护α-氨基酸，从C-端（羧基端）向N-端（氨基端）固相合成C-末端为半胱氨酸的多肽，合成的多肽经高浓度的TFA剪切并通过RP-HPLC分离纯化；透膜肽(KFF)3K的氨基酸序列为KFFKFFKFFK，K为赖氨酸（Lys），F为苯丙氨酸（Phe）；
（2）锁核酸（LNA）的制备：采用标准的固相亚磷酸酰胺法合成；
具体步骤为：首先将寡核苷酸链3′末端核苷(N1)以其3′-OH通过1个长的烷基臂与固相载体可控微孔玻璃珠（CPG）耦联、N1的5′-OH以二甲氧基三苯甲基（DMTr）保护；
然后从N1开始逐步地接长寡核苷酸酸链；1个合成循环包括4步；第一步：去保护，用三氯乙酸（TCA）去除CPG所连核苷酸上的5′-末端的DMTr，暴露出5′-OH，洗涤以备进行下步反应；第二步：耦联反应，在缩合之前，脱氧核苷亚磷酰胺单体与四唑混合并进入合成柱，四唑给3′磷酸上二异丙胺基的N原子提供一个质子，质子化的二异丙胺是一个良好的游离基团，与四唑形成亚磷酰胺四唑这种活性中间体，此步四唑过量保证了单体活化充分；亚磷酰胺四唑与CPG所连的核苷酸N1接触时，与其5′-OH发生亲核反应，发生缩合并脱掉四唑，乙腈洗涤；第三步：加帽反应，加入醋酐及二甲基氨基吡啶，使未参加反应的寡核苷酸链乙酰下，乙酰化的寡核苷酸链不参加下一步反应；第四步：氧化反应，加入碘，使三价的亚磷酸转变为更稳定的五价磷酸；上述循环完成之后进行第二个合成循环；每经历一轮循环，延长1个核苷酸；延长的寡核苷酸链始终被固定在不溶的固相载体上，过量的未反应物或分解物则通过过滤或洗涤除去；硫代修饰核苷酸的合成与上述方法不同点有二：一是硫化反应代替氧化反应，二是加帽反应在硫化反应后完成；LNA修饰的核苷酸的合成方法同上，只是核苷酸单体是经过LNA修饰的核苷酸单体，直接进行上述四步反应；
其中，LNA787的序列为5'-T+*GA+CT*C+GCC*A+C+CA*GTAA*TA+T+*T-3'，其中A为腺嘌呤核苷酸单体，T为胸腺嘧啶核苷酸单体，C为胞嘧啶核苷酸单体，G为鸟嘌呤核苷酸单体；
*X代表硫代修饰，X+代表LNA修饰，X为A、T、C或G；硫代修饰的核苷酸如式（Ⅰ）所示，LNA修饰的核苷酸结构中2′-O位和4′-C位通过缩水作用形成氧亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖的构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，如式（Ⅱ）所示；
采用HPLC对LNA粗品进行分离纯化，得到纯度为98.58%的LNA787，MALDI-TOF测定的分子量为6700.28；
（3）透膜肽(KFF)3K和锁核酸LNA的连接及纯化鉴定：当寡核苷酸链达到预定长度后，过量的SMCC加入到连接在CPG上的寡核苷酸上，孵育1h，充分洗涤后真空干燥；连接在CPG上的寡核苷酸与过量的透膜肽共孵育过夜，充分洗涤，(KFF)3K和LNA的连接物从固相载体上切下，新鲜浓氨水脱去保护基，真空干燥；将(KFF)3K和LNA的连接物粗品通过HPLC进行纯化，并通过MALDI-TOF质谱进行鉴定；透膜肽(KFF)3K与LNA787的连接物由透膜肽(KFF)3K与LNA之间以半胱氨酸-〔4-(N-马来酰亚胺甲基)-1-环己酰胺〕-己烷（Cys-SMCC-C6）进行连接，其中(KFF)3K位于半胱氨酸端，LNA位于己烷基端，具体结构如下：采用RP-HPLC对透膜肽与LNA的连接物的粗品进行分离纯化，得到纯度为91.13%的透膜肽(KFF)3K与LNA787的连接物，即透膜肽介导的反义抗菌剂，MALDI-TOF测定的分子量为
一种透膜肽介导的反义抗菌剂及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种透膜肽介导的反义抗菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 金黄色葡萄球菌是医院内感染和社区获得感染最常见、最重要的致病菌，随着抗生素的广泛应用，金葡菌的耐药情况愈来愈严重。目前，90%以上的金葡菌对青霉素耐药，自1961年英国首次报道耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant staphylococcus aureus，MRSA）至今，由MRSA引起的感染已经遍及全球，且其检出率不断增高。MRSA对所有β-内酰胺类抗生素和其他多种抗菌药物耐药，因此由MRSA引起的感染，治疗十分困难，死亡率很高。目前治疗MRSA最有效的药物是万古霉素，然而随着耐万古霉素MRSA的出现，人们即将面临无药可用的境地，因此寻找新的特异性抗MRSA感染的新靶点及新策略成为细菌感染治疗领域的研究热点和难点。
[0003] 传统的抗菌药物的研发主要是对已知抗生素进行结构修饰，然而按照这种方法发现新先导物变得越来越困难，同时细菌产生耐药性的速度远远超过新抗菌药物的研发速度，所以必须寻找新的突破口。由于具有全新作用模式的抗菌药物可以大大减慢细菌产生耐药性的速度，因此目前抗菌药物的研究主要集中在寻找新的作用靶标和新的作用模式的药物。2005年美国AVI公司提出的反义抗菌剂是一种具有全新作用模式的抗菌药物——通过RNase H介导的靶RNA的降解及抑制DNA的复制和转录及转录后的加工和翻译等方式而抑制致病菌基因的转录、翻译进而抑制细菌的生长、繁殖，从而达到减毒、抑制或杀灭细菌的目的，该类药物是最具研发潜能的新型抗菌药物。
[0004] 与传统药物相比，以细菌治病基因为靶点的反义抗菌剂因具有高特异性、高效性、低毒、安全等特点，是极具开发潜能的新型抗菌药物。在众多种类的反义分子中锁核酸（LNA）作为一种新颖的核苷酸衍生物引起了人们的广泛关注，有希望成为分子水平治疗各种疾病的突破口。LNA是一种特殊的双环状寡核苷酸衍生物，结构中核酸的2′-O,4′-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，形成了刚性的缩合结构，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，所以它对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力，与其他寡核苷酸类似物相比，LNA有很多优点：1）和DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性；2）具有抗3′脱氧核苷酸酶降解的稳定性；3）LNA-DNA杂交物能激活RNase H；4）体内无毒性作用；
5）有高效的自动寡聚化作用，合成方法相对简单，部分或完全修饰的LNA寡核酸链可用氨基磷酸法在DNA自动合成仪上合成，由此可见，LNA是一种理想的反义药物。
[0005] 然而，LNA充分发挥其反义作用的前提是必须在细菌细胞内的靶mRNA结合部位达到有效浓度，而LNA是荷负电荷的大分子化合物，不易透过细菌的细胞壁和细胞膜、胞内浓度低，并能非特异性的被机体细胞所摄取，因此高效的、特异性靶向细菌的递药载体是限制反义抗菌剂研制的瓶颈问题。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于通过对MRSA细胞分裂的关键蛋白——丝状温度敏感蛋白Z（flamentous temperature-sensitive protein Z，FtsZ）的结构基因ftsZ mRNA为靶点进行研究，提供一种透膜肽介导的反义抗菌剂及其制备方法和应用。
[0007] 本发明的目的是这样实现的：
[0008] 一种透膜肽介导的反义抗菌剂，包含(KFF)3K-Cys-SMCC-C6-LNA787，所述的(KFF)3K-Cys-SMCC-C6-LNA787为透膜肽(KFF)3K与LNA787之间以半胱氨酸-〔4-(N-马来酰亚胺甲基)-1-环己酰胺〕-己烷进行连接；
[0009] 所述LNA787的序列为5'-T+*GA+CT*C+GCC*A+C+CA*GTAA*TA+T+*T-3'，其中A为腺嘌呤核苷酸单体，T为胸腺嘧啶核苷酸单体，C为胞嘧啶核苷酸单体，G为鸟嘌呤核苷酸单体；*X代表硫代修饰，X+代表LNA修饰，X为A、T、C或G；
[0010] 所述硫代修饰的核苷酸如式（Ⅰ）所示，所述LNA修饰的核苷酸结构中2′-O位和4′-C位通过缩水作用形成氧亚甲基桥，并连接成环形，如式（Ⅱ）所示：
[0011]
[0012] 所述透膜肽(KFF)3K的序列为5'-KFFKFFKFFK-3'，其中K为赖氨酸，F为苯丙氨酸。
[0013] 所述(KFF)3K-Cys-SMCC-C6-LNA787的序列为如下所示：
[0014] 5'-KFFKFFKFFK-Cys-SMCC-C6-T+*GA+CT*C+GCC*A+C+CA*GTAA*TA+T+*T-3'。
[0015] 上述透膜肽介导的反义抗菌剂，其中核苷酸单体中的碱基为鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶。
[0016] 本发明还提供了上述透膜肽介导的反义抗菌剂的制备方法，其中所述的(KFF)3K-Cys-SMCC-C6-LNA787是将透膜肽(KFF)3K和LNA787通过作为空间间隔的Cys-SMCC-C6共价连接，以固相合成法制备而得。
[0017] 本发明通过试验研究(KFF)3K-Cys-SMCC-C6-LNA787（以下称PLNA787）对Mu50菌落数的影响，结果显示PLNA787能显著减少Mu50的菌落数，此抑制作用具有浓度依赖性。另外，本发明通过试验研究PLNA787对Mu50生长的影响，结果显示PLNA787能浓度依赖性的抑制Mu50的生长。根据这些试验结果，本发明提供了上述透膜肽介导的反义抗菌剂在制备抗耐药菌的药物中的应用。优选所述的耐药菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
[0018] 本发明所涉及的透膜肽介导的反义抗菌剂具有如下优点和显著的进步：以细菌致病基因为靶点，具有高特异性、高效性、低毒、安全等优点。对耐药菌的生长具有显著的抑制作用，尤其可以显著拮抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长。具体表现在：通过实施例4的试验结果可以看出，PLNA787能显著减少Mu50的菌落数，也可以抑制Mu50的生长；RT-PCR法检测发现，裸的LNA不能抑制MRSA菌株的ftsZ基因的表达，而低浓度的PLNA787能完全抑制MRSA菌株的ftsZ基因表达。
附图说明
[0019] 图1PLNA的分子结构图。
[0020] 图2各种PLNA对Mu50的菌落数的影响柱状图；**P<0.01vs.control。
[0021] 图3HPLC法纯化LNA787的色谱图。
[0022] 图4LNA787的MALDI-TOF质谱分析图。
[0023] 图5RP-HPLC法纯化PLNA787的色谱图。
[0024] 图6PLNA787的MALDI-TOF质谱分析图
[0025] 图7PLNA787对Mu50的菌落数的柱状图；*P<0.05vs.control；**P<0.01vs.control。
[0026] 图8PLNA787对Mu50生长的影响曲线图。
[0027] 图9PLNA787对ftsZ基因表达的影响电泳图。
具体实施方式
[0028] 本发明以调控MRSA细胞分裂的关键蛋白——丝状温度敏感蛋白Z（filamentous temperature-sensitive protein Z，FtsZ）的结构基因ftsZ mRNA为靶点，设计、筛选并合成特异性靶向ftsZ mRNA的锁核酸（locked nucleic acid,LNA），并将透膜肽与LNA共价连接PLNA，通过体内、体外药效学实验探讨PLNA治疗MRSA感染的效果，并最终筛选出了效果显著的LNA787，其可以单独作为或与赋形剂制备成为特异性抗MRSA感染的新型药物——反义抗菌剂，为MRSA感染的防治寻找出了新的突破口。
[0029] 以下是本发明涉及的PLNA的制备实施例及PLNA787的效果试验例。
[0030] 实施例1设计、合成并筛选抗金葡菌ftsZ mRNA的LNA
[0031] (1)筛选ftsZ mRNA的有效靶点，设计特异高效的LNA：采用RNA Structure4.5软件详细分析ftsZ mRNA的序列并预测其二级结构，以18-21个碱基为LNA基本长度，在非保守序列区、非折叠区选择有效靶点，筛选出最优的10条LNA（见表1）。
[0032] 表1 针对ftsZ mRNA设计的锁核酸（LNA）
[0033]
[0034] 注：核酸序列栏中大写字母代表LNA，小写字母代表DNA。
[0035] 实施例2 PLNA的制备及分离纯化
[0036] （1）透膜肽(KFF)3K的制备：通过芴甲氧羰基固相合成方法（Fmoc-SPPS）合成，即以HATU/DIEA为缩合剂，在MBHA-Rink树脂上，采用Fmoc保护α-氨基酸，从C-端（羧基端）向N-端（氨基端）固相合成C-末端为半胱氨酸的多肽，合成的多肽经高浓度的TFA剪切并通过RP-HPLC分离纯化。透膜肽(KFF)3K的氨基酸序列为KFFKFFKFFK，K为赖氨酸（Lys），F为苯丙氨酸（Phe）。
[0037] 具体步骤为：第一步，多肽的固相合成：制备的多肽从C端到N端逐个进行，首先MBHA-Rink树脂装柱，加二氯甲烷（CHCl2），使其溶胀，20%哌啶/二甲基甲酰胺（DMF）溶液脱保护，DMF清洗。以1:1:2的摩尔比将9-芴甲氧羰基（Fmoc）保护的第一个氨基酸、2-（7-偶氮苯并三氮唑）-N,N,N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）和N,N-二异丙基乙胺（DIEA）溶解于适量的DMF，活化后与脱保护后的树脂在柱上循环偶合反应2~6h，DMF洗涤。后续连接的氨基酸重复上述的活化、缩合、脱保护和洗涤的过程，直至制备结束。第二步，多肽的剪切：取下反应后的树脂，加入剪切液（95%三氟乙酸+5%间甲酚），室温反应1.5-2h，过滤，滤出液中加入10倍体积的预冷的无水乙醚，3500rpm离心5min，收集沉淀并室温干燥。第三步：多肽的分离纯化：称量一定量干燥后的多肽，溶于0.1%三氟乙酸，样品处理后经反向柱梯度分离（洗脱液为含0.1%三氟乙酸的20-80%的乙腈），收集260nm处洗脱峰。
[0038] （2）锁核酸（LNA）的制备：采用标准的固相亚磷酸酰胺法合成。
[0039] 具体步骤为：首先将寡核苷酸链3′末端核苷(N1)以其3′-OH通过1个长的烷基臂与固相载体可控微孔玻璃珠（CPG）耦联、N1的5′-OH以二甲氧基三苯甲基（DMTr）保护。然后从N1开始逐步地接长寡核苷酸酸链。1个合成循环包括4步。第一步：去保护，用三氯乙酸（TCA）去除CPG所连核苷酸上的5′-末端的DMTr，暴露出5′-OH，洗涤以备进行下步反应。第二步：耦联反应，在缩合之前，脱氧核苷亚磷酰胺单体与四唑混合并进入合成柱，四唑给3′磷酸上二异丙胺基的N原子提供一个质子，质子化的二异丙胺是一个良好的游离基团，与四唑形成亚磷酰胺四唑这种活性中间体，此步四唑过量保证了单体活化充分。亚磷酰胺四唑与CPG所连的核苷酸N1接触时，与其5′-OH发生亲核反应，发生缩合并脱掉四唑，乙腈洗涤。第三步：加帽反应，加入醋酐及二甲基氨基吡啶，使未参加反应的寡核苷酸链乙酰下，乙酰化的寡核苷酸链不参加下一步反应。第四步：氧化反应，加入碘，使三价的亚磷酸转变为更稳定的五价磷酸。上述循环完成之后进行第二个合成循环。每经历一轮循环，延长1个核苷酸。延长的寡核苷酸链始终被固定在不溶的固相载体上，过量的未反应物或分解物则通过过滤或洗涤除去。硫代修饰核苷酸的合成与上述方法不同点有二：一是硫化反应代替氧化反应，二是加帽反应在硫化反应后完成。LNA修饰的核苷酸的合成方法同上，只是核苷酸单体是经过LNA修饰的核苷酸单体，直接进行上述四步反应。
[0040] 其中，LNA787的序列为5'-T+*GA+CT*C+GCC*A+C+CA*GTAA*TA+T+*T-3'，其中A为腺嘌呤核苷酸单体，T为胸腺嘧啶核苷酸单体，C为胞嘧啶核苷酸单体，G为鸟嘌呤核苷酸单体；*X代表硫代修饰，X+代表LNA修饰，X为A、T、C或G；硫代修饰的核苷酸如式（Ⅰ）所示，LNA修饰的核苷酸结构中2′-O位和4′-C位通过缩水作用形成氧亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖的构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，如式（Ⅱ）所示。
[0041] 采用HPLC对LNA粗品进行分离纯化，均得到纯度98%以上的纯品，用MALDI-TOF测定纯品的分子量与理论值相符。图3和图4分别为合成的LNA787的HPLC图和MALDI-TOF图，经HPLC纯化，LNA787的纯度为98.58%，MALDI-TOF测定的分子量为6700.28，与理论值6699.24相符。
[0042] （3）透膜肽(KFF)3K和锁核酸LNA的连接及纯化鉴定：当寡核苷酸链达到预定长度后，过量的SMCC加入到连接在CPG上的寡核苷酸上，孵育1h，充分洗涤后真空干燥。连接在CPG上的寡核苷酸与过量的透膜肽共孵育过夜，充分洗涤，(KFF)3K和LNA的连接物（即PLNA）从固相载体上切下，新鲜浓氨水脱去保护基（氨解），真空干燥。将PLNA粗品通过HPLC进行纯化，并通过MALDI-TOF质谱进行鉴定。本发明制备的PLNA分子为透膜肽(KFF)3K与LNA787的连接物，透膜肽(KFF)3K与LNA之间以半胱氨酸-〔4-(N-马来酰亚胺甲基)-1-环己酰胺〕-己烷（Cys-SMCC-C6）进行连接，其中(KFF)3K位于半胱氨酸端，LNA位于己烷基端，具体结构见图1。
[0043] 采用RP-HPLC对透膜肽与LNA的连接物（PLNA）的粗品进行分离纯化，均得到纯度90%以上的纯品，用MALDI-TOF测定纯品的分子量与理论值相符。图5和图6分别为PLNA787的RP-HPLC图和MALDI-TOF图，经RP-HPLC纯化，PLNA787的纯度为91.13%，MALDI-TOF测定的分子量为8616.14，与理论值8614.85相符。
[0044] 实施例3 PLNA对Mu50的最小抑菌浓度研究
[0045] 按照实施例2的方法分别在LNA碳末端将其与促进LNA通过细胞壁的透膜肽(KFF)3K相连接，制备成PLNA。
[0046] 综合改良微孔板MIC测定方法和菌落计数法作为有效抑菌反义靶位筛选的方法。发明人首先对10条抗ftsZ PLNA序列（anti-ftsZ PLNA 01、201、274、309、322、571、593、
705、787和1153）对S.aureus的MIC进行测定（见表2），结果显示10条PLNA均具有强弱不等的抗菌活性。又将各10μM的PLNA与Mu50共孵育8h，进行平板克隆实验，计数CFU，结果显示10条PLNA均能明显降低Mu50的菌落数（图2）。综合改良微孔板MIC测定方法和菌落计数法的实验结果，发明人认为PLNA787具有最强的杀菌效能。
[0047] 表2 PLNA对Mu50的最小抑菌浓度（MIC）
[0048]
[0049]
[0050] 实施例4 PLNA787对MRSA菌株Mu50的抗菌作用研究
[0051] A．PLNA787最小抑菌浓度(MIC)的测定：采用稀释法测定MIC。将新鲜过夜培养的细菌转种于营养肉汤培养基中，35℃、210rpm培养至对数生长中期，测A630＝0.5~0.6，稀释至0.5麦氏比浊标准，然后1:300稀释。取50μl的菌液分别加入到含有倍比稀释的PLNA787的试管中，35℃孵育12～16h。在每管中加入10g/L（1%）氯化三苯四氮唑（TTC）10μl，35℃孵育3h后有细菌生长管呈红色，不显红色的最低药物浓度为PLNA787对检测菌的MIC值，PLNA787对Mu50的MIC值为1.6μM，而裸的LNA787的MIC值﹥25μM，见表3。
[0052] 表3 PLNA787对Mu50的最小抑菌浓度（MIC）
[0053]
[0054] Control：空白对照；PLNA787：透膜肽与LNA787的共价结合物；
[0055] Free-LNA787：裸的LNA787；Free-Pep：裸的(KFF)3K。
[0056] B．PLNA787对Mu50菌落数的影响：将新鲜过夜培养的菌液转种于营养肉汤培养基中，35℃、210rpm培养至对数生长中期，向培养液中加入不同浓度的PLNA787，共孵育10h，计数细菌菌落数(CFU)。图7结果PLNA787能显著减少Mu50的菌落数，此抑制作用具有浓度依赖性。
[0057] C.PLNA787对Mu50生长的影响：将新鲜过夜培养的菌液转种于营养肉汤培养基中，35℃、210rpm培养至对数生长中期，向培养液中加入不同浓度的PLNA787，共孵育不同时间，绘制生长曲线，观察细菌生长情况。图8结果显示PLNA787能浓度依赖性的抑制Mu50的生长。
[0058] D.RT-PCR检测PLNA787对ftsZ表达变化的影响：将新鲜过夜培养的菌液转种于营养肉汤培养基中，35℃、210rpm培养至对数生长中期，向培养液中加入不同浓度的PLNA787，共孵育6h。培养结束后收集细菌，Trizol法提取细菌总RNA，反转录获得cDNA作为反应模板，RT反应条件：37℃，60min，冰浴后进行PCR。PCR反应条件：95℃预变性2min，95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环。PCR引物：5’-ACCACGGAATGAATAA-3’和5’-CCTGCTCCTAAACCAC-3’。图9结果显示3.2μM和1.6μM的PLNA787能完全抑制ftsZ基因的表达，而0.8μM的PLNA787能部分抑制ftsZ基因的表达，裸的LNA不能抑制ftsZ基因的表达。
[0059] 序列表
[0060] SEQUENCE LISTING
[0061] <110>中国人民解放军第四军医大学
[0062] <120>一种透膜肽介导的反义抗菌剂及其制备方法和应用
[0063] <160>1
[0064] <170>PatentIn version 3.3
[0065] <210>1
[0066] <211>21
[0067] <212>DNA
[0068] <213>人工序列
[0069] <400>1
[0070] tgactcgcca ccagtaatat t 21
