一种高效降解菲的假单胞菌及其应用

摘要

本发明公开了一种高效降解菲的假单胞菌及其应用，所述假单胞菌从石油开采处的污泥进行分离、纯化而获得，为假单胞菌属的一个种，命名为Pseudomonas sp.ZJF08，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2953。该菌种具有较高降解菲的能力，在一周内，能对浓度为1000mg/L的菲的降解率达到99.1％。

权利要求

1.一种假单胞菌种（Pseudomonas sp.）ZJF08，保藏编号为CGMCC No.2953。

2.权利要求1所述的假单胞菌种在降解菲中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，降解条件为pH为7.5，温度为30℃。

说明书

一种高效降解菲的假单胞菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一株高效降解菲的菌种及其应用。

背景技术

[0002] 多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbon，简称PAHs)是由两个或两个以上的苯环以线性排列、弯接或簇聚的方式而构成。PAHs在环境中分布广泛，由于其自身的疏水性及低水溶性，能很快进入到沉积环境中，并且它们随着苯环数量的增加，脂溶性越强，水溶性越低，在环境中存在的时间越长，遗传毒性越高。PAHs极易在环境中累积并可通过食物链传递，对人类健康和生态环境具有很大危害性。

[0003] 在PAHs中，菲属于较简单的一类低分子量PAHs，除存在于石油中外，大多来自不完全燃烧及煤炭气化和液化工艺排放的废气废水中。菲由三个苯环连接而成，让人们对其感兴趣的原因不仅是因为它在环境中的含量高，而且有着与致癌PAHs类似的区域结构。菲的性质稳定，易在环境中沉积，对人呼吸道和皮肤有毒害作用，可诱发鱼类和其它生物的突变、畸变和癌变，并能通过食物链累积。

[0004] 研究表明，PAHs的水解和光解速率都非常缓慢，生物降解成为它们从环境中缓慢消失的主要途径，因此高效降解菌的筛选成为修复PAHs污染的生态系统的关键。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种假单胞菌新种及其在高效降解菲中的应用。

[0006] 为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：一种假单胞菌种，命名为Pseudomonas sp.ZJF08，保藏编号为CGMCC No.2953。

[0007] 本发明是通过对大庆油田受污染的土壤进行分离、纯化，得到假单胞菌属的一个新种，经过反复实验，发现该菌种具有高效降解菲的能力，降解条件优选为pH为7.5，温度为30℃。

[0008] 本发明的菌种已于2009年3月17日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2953。

[0009] 本发明的菌种分离纯化方法如下：将2g土样加入100ml加菲MM培养基中 (MgSO4·7H2O 0.2g/L，CaCl20.02g/L，KH2PO41.0g/L，K2HPO41.0g/L，NH4NO31.0g/L，-1FeCl30.05g/L，用10mol·L NaOH调节pH至7.0。菲加到预先灭菌的MM培养基中，使其终含量为1‰)，30℃、150rpm摇床培养5d后，吸取1ml菌液转接至新鲜培养基，连续富集。转接4次后，用接种环蘸取少量菌液，在LB固体培养基平板上直接划线分离。在平板上选择不同形态特征的菌落，重新转接至加菲MM液体培养基中，摇床培养，如菌液变混浊，则继续分离纯化，直至得到形态单一菌体。

[0010] 本发明的Pseudomonas sp.ZJF08具有如下的形态和生理生化特性。

[0011] 菌体的形态特性：(1)采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，Pseudomonas sp.ZJF08的细胞为革兰氏阴性短杆菌，细胞较小。为(0.4～1.0)μm×(1.3～4.1)μm。(2)在LB固体培养基平板上培养12h后，菌落为圆形，丰满，呈淡黄色，边缘整齐，表面湿润光滑，易挑起。菌落的主要生理生化特性参见表1。

[0012] 表1菌落的主要生理生化特性：

[0013]

[0014] 16S rDNA序列检测：采用小量DNA提取方法提取细菌总DNA。将获得的16S rDNA基因序列输入GenBank，通过比对发现ZJF08与假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的多个菌株16S rDNA序列同源度均在98％以上。

[0015] 综合上述生理生化特性、16S rDNA基因序列结果，本发明Pseudomonas sp.ZJF08应归属假单胞菌属。

[0016] 本发明的积极效果在于：该菌种具有较高降解菲的能力，在一周内，能对浓度为1000mg/L的菲的降解率达到99.1％，具有广阔的应用前景。

附图说明

[0017] 图1为加入表面活性剂Triton X100后，Pseudomonas sp.ZJF08对菲的降解曲线图，其中■代表Triton X100，□代表对照组。

具体实施方式

[0018] 下面结合附图对本发明做详细说明，提供三个实施例，但是实施例的作用仅是解释而非限定本发明。

[0019] 实施例1：Pseudomonas sp.ZJF08对菲的降解。

[0020] 在500ml去离子水中添加MgSO4·7H2O 1g，CaCl20.1g，KH2PO45g，K2HPO45g，NH4NO35g，-1FeCl30.25g，用10mol·L NaOH调节pH至7.5。菲加到预先灭菌的MM培养基中，使其终含量为1‰，121℃条件下灭菌20min作为培养液分别装到250ml摇瓶中，每瓶100ml。从保存的Pseudomonas sp.ZJF08甘油管接种至LB液体培养基中，于30℃，180rpm条件下摇床活化菌体，以1ml活化菌液接种到培养基中，30℃，180rpm摇床培养。每隔12h定时取样，并用等量的苯进行萃取，重复三次，样品中多余的水用无水硫酸钠去除。菲的含量通过气相色谱(GC)测定。气相条件如下：DB-5苯甲基硅氧烷毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)，进样口-1
温度250℃；检测器温度290℃；柱升温程序：初始温度100℃，以20℃·min 升温至280℃-1
保持18min；载气：高纯氮，99.99％；流量：50mL·min ；进样量：1μL。7天后，Pseudomonas sp.ZJF08对菲的降解率达到99.1％。

[0021] 实施例2：pH值对降解菲的影响。

[0022] 调节MM培养基为不同pH值(5.5～8.5)，在初始菲浓度为1000mg/L的条件下，培养7天，测定pH对菲降解作用的影响，具体结果参见表2。

[0023] 表2pH对菲降解作用的影响：

[0024]初始pH值 菌株密度OD600 降解率(％)
5.5 0.13 54.1
6.0 0.189 71.3
6.5 0.25 89.5
7.0 0.28 95.8
7.5 0.303 98.4
8.0 0.275 78.8
8.5 0.15 70.1

[0025] 由表2可看出，在pH为7.5时，Pseudomonas sp.ZJF08对菲的降解作用最强，在7天后其降解率达98.4％。

[0026] 实施例3：表面活性剂对降解菲的影响。

[0027] 在500ml去离 子水 中添 加MgSO4·7H2O 1g，CaCl20.1g，KH2PO45g，K2HPO45g，-1NH4NO35g，FeCl30.25g，加入表面活性剂Triton X100至终浓度为1％，并用10mol·L NaOH调节pH至7.5。菲加到预先灭菌的MM培养基中，使其终含量为1‰，121℃条件下灭菌20min作为培养液分别装到250ml摇瓶中，每瓶100ml。从保存的Pseudomonas sp.ZJF08甘油管接种至LB液体培养基中，于30℃，180rpm条件下摇床活化菌体，以1ml活化菌液接种到培养基中，30℃，180rpm摇床培养。每隔12h定时取样，并用等量的苯进行萃取，重复三次，样品中多余的水用无水硫酸钠去除。菲的含量通过气相色谱(GC)测定。气相条件如下：DB-5苯甲基硅氧烷毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)，进样口温度250℃；检测器温度290℃；柱-1
升温程序：初始温度100℃，以20℃·min 升温至280℃保持18min；载气：高纯氮，99.99％；
-1
流量：50mL·min ；进样量：1μL。4天后，Pseudomonas sp.ZJF08对菲的降解率达到99.4％(参见图1)。

[0028] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。