一种间充质干细胞无血清培养基

摘要

本发明涉及生物领域，公开了一种无血清培养基，其必要组成为IMDM、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、Hepes、重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、重组人白蛋白、2-巯基乙醇、原儿茶酸、脂质、氨基酸、维生素、微量元素、氢化可的松、维生素C、粘接胺或重组人纤连蛋白、黄体酮、腐胺、肝素、血清素、EGF、b-FGF、PDGF-BB、IGF-I。本发明所述无血清培养基化学成分明确、无动物源、无血清，培养细胞安全、理想，避免了掺杂动物成分和批次的不稳定性，培养间充质干细胞结果显示其细胞总数、细胞表型和分泌细胞因子均正常，具有良好的工业应用前景。

权利要求

1.一种无血清培养基，其必要组分为IMDM 17.7g/L、L-谷氨酰胺1-5mM、碳酸氢钠

3.024g/L、Hepes 1-5mM、重组人胰岛素1-10mg/L、重组人转铁蛋白5-20mg/L、重组人白蛋白4-10g/L、2-巯基乙醇55nM、原儿茶酸1-5mmol/L、脂质0.1-1mg/L、氨基酸1-10g/L、维生素1-10mg/L、微量元素1-5mg/L、 F-68 100-500mg/L、氢化可的松1-50ng/ml、维生素C 1-50mg/L、重组人纤连蛋白1-5mg/L、黄体酮10-20ng/ml、腐胺1-10mg/L、肝素

1-10IU/mL、血清素1-5mg/L、EGF 1-10ng/ml、b-FGF 1-10ng/ml、PDGF-BB 1-10ng/ml、IGF-I

1-10ng/ml。

2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，其必要组成为IMDM 17.7g/L、L-谷氨酰胺5mM、碳酸氢钠3.024g/L、Hepes

5mM、重组人胰岛素10mg/L、重组人转铁蛋白10mg/L、重组人白蛋白4g/L、2-巯基乙醇55nM、原儿茶酸1.5mmol/L、脂质0.5mg/L、氨基酸5g/L、维生素8mg/L、微量元素2mg/L、F-68 100mg/L、氢化可的松50ng/ml、维生素C 50mg/L、重组人纤连蛋白5mg/L、黄体酮15ng/ml、腐胺10mg/L、肝素10IU/mL、血清素2mg/L、EGF 10ng/ml、b-FGF 10ng/ml、PDGF-BB 10ng/ml、IGF-I 10ng/ml。

3.根据权利要求1或2所述的无血清培养基，其特征在于，还包含丙酮酸钠110mg/L、大豆卵磷脂10-20mg/L、IL-3 1-10ng/ml、GM-CSF 1-10ng/ml、TGF-β1 1-10ng/ml。

4.根据权利要求1或2所述的无血清培养基，其特征在于，还包含丙酮酸钠110mg/L、大豆卵磷脂15mg/L、IL-3 10ng/ml、GM-CSF 10ng/ml、TGF-β1 10ng/ml。

5.权利要求1-4任一项所述无血清培养基在MSC培养中的应用。

说明书

一种间充质干细胞无血清培养基

技术领域

[0001] 本发明涉及生物领域，特别涉及一种间充质干细胞无血清培养基。

背景技术

[0002] 间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是属于中胚层的一类多能干细胞，具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞，还具有分化为肌细胞、肝细胞、造血细胞、神经细胞、胰岛细胞等多种细胞的能力。MSC来源广泛，易于分离、培养、扩增和纯化，免疫原性低，无道德伦理问题的限制、所以在组织工程、基因治疗和免疫治疗方面有着巨大的应用前景。

[0003] MSC在组织中的比例极低，通过体外分离获取的MSC数量非常有限，远远无法满足临床和研究的需求。非分化性增殖，即在保持MSC的多向分化潜能和未分化状态的同时又能快速有效地增殖，成了目前急需解决的问题。

[0004] 目前国内外实验室和临床研究的EPC的扩增体系，主要是基础培养基添加一定浓度的胎牛血清（FBS）。FBS中含有异种蛋白质，它本身有携带细菌、病毒、蛋白传染性疾病或朊病毒的风险。另外，有研究表明MSC在培养过程中可以吞噬培养基中的蛋白，内含有牛血清蛋白，可以使受者体内产生抗牛蛋白抗体引起免疫反应，从而导致患者尤其在重复输注干细胞治疗后治疗失效。因此FBS在干细胞临床大规模培养中的不利因素已经逐渐暴露出来，现已有很多学者研究FBS的替代品。一些临床研究使用商用血清替代物Ultroser G(Pall BioSepra)，这种培养基含有多种生长因子、结合蛋白、维生素和激素，能较好地满足MSC生长的需要，然而Ultroser G仍然还有一些动物源成分。目前人们使用较多的是应用人血清或血清衍生物来替代。包括成人血清、血小板衍生物(血小板裂解液、凝血酶激活血小板释放因子)、脐血清等。这些成份虽然来源于人，输注人体内不会引起异种蛋白的免疫，但这些人源成分化学成分不明确，不利于进行MSC的深入研究，而且这些成分会将一些人源的一些潜在带入细胞。更关键在于目前人血清、血小板资源少，无法保证MSC的大规模培养。

[0005] 当前也有一些公司开发的新一代无血清培养基．如Invitrogen开发MSC SFM XenoFree无血清培养基、加拿大stemcell公司开发了MesenCultTM-XF Medium无血清培养基、BD公司开发的BDMOSAICTM Hmsc SF Medium和CellGenix开发的
Serum-free MSC Medium等。但这些培养基价格昂贵，在培养MSC过程中都需要使用附属产品进行细胞培养瓶的包被处理，且有可能在明胶包被的过程中引入动物源成分，而且这也增加了工作量和污染的机会，而且一些研究者在使用这些产品时发现并不支持MSC的原代培养或者在原代培养的过程中需要添加2%血清(Hudson JE,Mills RJ,Frith JE,et al.A defined medium and substrate for expansion of human mesenchymal stromal cell progenitors that enriches for osteo-and chondrogenic precursors.Stem Cells Dev.2011;20:77-87.)。而且这些产品在使用过程中需要有高的细胞接种密度要求，在低密度细胞接种时这些培养基无法使用（见表1）。

[0006] 表1市场上的MSC无血清培养基

[0007]

[0008]

发明内容

[0009] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种无血清培养基，其化学成分明确，无动物源，无血清，支持MSC的原代培养，并且可以在低密度接种进行传代培养。

[0010] 本发明提供的一种无血清培养基，其必要组分为IMDM 17.7g/L、L-谷氨酰胺1-5mM、碳酸氢钠3.024g/L、Hepes 1-5mM、重组人胰岛素1-10mg/L、重组人转铁蛋白
5-20mg/L、重组人白蛋白4-10g/L、2-巯基乙醇55nM、原儿茶酸1-5mmol/L、脂质0.1-1mg/L、氨基酸1-10g/L、维生素1-10mg/L、微量元素1-5mg/L、 100-500mg/
L、氢化可的松1-50ng/ml、维生素C 1-50mg/L、粘接胺或重组人纤连蛋白1-5mg/L、黄体酮10-20ng/ml、腐胺1-10mg/L、肝素1-10IU/mL、血清素1-5mg/L、EGF 1-10ng/ml、b-FGF
1-10ng/ml、PDGF-BB 1-10ng/ml、IGF-I 1-10ng/ml。

[0011] 作为优选，本发明所述无血清培养基必要组成为IMDM 17.7g/L、L-谷氨酰胺5mM、碳酸氢钠3.024g/L、Hepes 5mM、重组人胰岛素10mg/L、重组人转铁蛋白10mg/L、重组人白蛋白4g/L、2-巯基乙醇55nM、原儿茶酸1.5mmol/L、脂质0.5mg/L、氨基酸5g/L、维生素8mg/L、微量元素2mg/L、 100mg/L、氢化可的松50ng/ml、维生素C 50mg/L、粘接胺或重组人纤连蛋白5mg/L、黄体酮15ng/ml、腐胺10mg/L、肝素10IU/mL、血清素2mg/L、EGF10ng/ml、b-FGF 10ng/ml、PDGF-BB 10ng/ml、IGF-I 10ng/ml。

[0012] 更优选地，本发明所述无血清培养基还包含丙酮酸钠110mg/L、大豆卵磷脂10-20mg/L、IL-3 1-10ng/ml、GM-CSF 1-10ng/ml、TGF-β11-10ng/ml。

[0013] 最优选的，本发明所述无血清培养基还包含丙酮酸钠110mg/L、大豆卵磷脂15mg/L、IL-310ng/ml、GM-CSF 10ng/ml、TGF-β110ng/ml。

[0014] 另一方面，本发明还提供所述无血清培养基在间充质干细胞MSC培养中的应用。

[0015] 本发明提供的化学成分明确、无动物源的间充质干细胞无血清培养基，支持原代细胞的分离、且培养时无需包被细胞培养瓶，培养效果与有血清培养基培养效果相当，而且避免了动物成分和批次的不稳定性。

[0016] 本发明无血清培养基和有血清培养基（10%胎牛血清培养基）以及市场无血清培养基（Gibco的 MSC SFM XenoFree培养基）培养MSC流式细胞表型检测结果显示，本发明提供的无血清培养基和10%胎牛血清培养基以及Gibco的 MSC SFM XenoFree培养基MSC阳性表达CD 13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166和HLA-ABC，阴性表达CD14、CD29、CD45、CD34和HLA-DR无统计学差异。且本发明无血清培养基和有血清培养基（10%胎牛血清培养基）培养MSC细胞增殖能力对照显示本发明提供的无血清培养基生长的MSC在低密度接种时，细胞增殖能力明显低于10%胎牛血清培养基，但在较高的接种密度时候，生长速度要快于10%胎牛血清培养基。

[0017] 本发明提供的无血清培养基和市场对照无血清培养基MSC都具有成骨、成软骨和成脂肪分化的能力。同时本发明提供的无血清培养基生长的MSC在低密度接种时，细胞增殖能力远远高于对照组无血清培养基，在高的接种密度时候，生长速度也快于对照组培养基。

[0018] 本发明提供的一种化学成分明确、无动物源、无血清的间充质干细胞培养基是目前最安全、最为理想的培养基，首先可以保证培养基批次间的一致性，其次是培养基的性质明确，有助于进一步研究间充质干细胞扩增过程中细胞因子的分泌情况。移植的脐血干细胞通过多种细胞因子与微环境相互作用以达到彼此适应，微环境中基质细胞产生细胞因子对移植后干细胞的趋化、归巢、活化及存活均起着重要的作用。而且培养基无动物源成分，在培养的过程中无需对培养瓶进行包被处理,可以避免在细胞培养的过程中引入动物成分(明胶、鼠尾胶原等)。更重要的是本发明提供的培养基可以支持MSC的原代分离培养，2
可以在更低的细胞接种密度下进行细胞传代。（2000/cm），同时分离纯化也比较方便。这种培养基的开发极大推动了MSC分泌因子和信号传导方面的研究和临床规模化培养，具有良好的应用前景。

附图说明

[0019] 图1为本发明无血清培养基和对照组培养基培养MSC形态图和结晶紫染色图。

[0020] 图2为本发明所述无血清培养基和对照组培养基培养MSC成骨、成脂肪分化结果图。A，B，C分别为本发明无血清培养基MSC成骨、成软骨、成脂肪分化的染色图；D，E，F分别为对照组培养基MSC成骨、成软骨、成脂肪分化的染色图。

具体实施方式

[0021] 本发明公开了一种间充质干细胞无血清培养基，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0022] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

[0023] 实施例1：培养基的配制

[0024] 本发明所述培养基SFM成分如下：

[0025]

[0026]

[0027] 更优选地，本发明所述培养基SFM成分如下：

[0028]

[0029]

[0030] 本发明所述培养基中粘接胺可用1mg/L的重组人纤连蛋白替代。

[0031] 上表中所述氨基酸包含L-精氨酸、L-胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸;

[0032] 所述维生素包含泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、内消旋肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺;

[0033] 所述脂质包含花生四烯酸、胆固醇、DL-α-生育酚乙酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈油酸、棕榈酸、硬脂酸;

[0034] 所述微量元素包含Cu、Zn、Se、Fe、Sn、Ni、Ag、Al、Cr、Ge、Zr、Rb、Co、Cd、Ba、K;

[0035] 各组分0.22μm滤器过滤除菌，密封，4℃避光保存。

[0036] 本实施例中使用的细胞培养试剂为Gibco，sigma提供，细胞因子为peprotech公司提供，细胞培养瓶为Fisher scientific提供（Cat.No.310109015）。

[0037] 调整培养基各参数如下：

[0038] PH： 7.2-7.4

[0039] 渗透压： 260-320mOsm/kg

[0040] 细菌、真菌检测： 阴性

[0041] 衣原体、支原体检测：阴性

[0042] 内毒素： <0.5EU/mL。

[0043] 实施例2：脐带中贴壁细胞的分离与培养

[0044] 无菌取脐带2cm，剪开血管后使用DPBS冲洗去残血，剪碎后先使用1mg/mL的Ⅱ型胶原酶DPB S 35mL在37℃消化2h，2500r/min离心10min（离心半径22cm），取下层沉淀再用0.25%胰蛋白酶PBS消化20min，2500r/min离心10min（离心半径22cm），取沉淀使用PBS吹打细胞悬浮，100μｍ滤网过滤，2000r/min离心10min（离心半径22cm）获得单细胞，继6
以PBS 800r/min离心10min（离心半径22cm），洗涤细胞2次，以1×10 个/mL的密度悬浮于无血清培养基和对照组无血清培养基，置37℃、5%CO2培养箱培养，随后每3～4d换液1次，经2d可见成纤维细胞在瓶底生长，约8～12d后能达到80%汇合时用0.25%胰蛋白酶
3 2
消化，以细胞密度5×10 个/cm 传代培养。

[0045] 无血清培养基和对照组培养基培养MSC形态图见图1。结果显示在原代培养5天(P0)，本发明提供的无血清培养基支持MSC的原代分离培养，但对照组培养基在不添加血清的情况下不支持MSC的原代分离培养。细胞培养P3后，本发明提供的无血清培养基和对照组培养基MSC细胞形态均呈典型的短小梭形，形态均一，轮廓清晰，两者无明显差异。SFM为本发明配制的无血清培养基，对照组为Gibco的 MSC SFM XenoFree培养基。

[0046] 实施例3：流式细胞仪检测细胞表型

[0047] 取传至第5代的细胞，去掉培养液，PBS洗涤2次，用1∶1的0.25%胰蛋白酶液9 -1
消化，1000r/min离心5min，用PB S洗涤1次，调整细胞浓度，制成浓度为10L 的单细胞悬液，加入10μL抗体，在4℃下孵育30min，用PB S洗涤1次，1000r/min离心5min，用500μL的PBS重悬细胞，然后上流式细胞仪检测，进行对比。结果见表2。本发明所述无血清培养基和对照组培养基培养MSC流式细胞表型对比结果显示，本发明提供的无血清培养基和对照组培养基MSC阳性表达CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166和HLA-ABC，阴性表达CD14、CD19、CD45、CD34和HLA-DR。没有统计学差异。

[0048] 表2

[0049]

[0050]

[0051] 实施例4：细胞增殖能力检测

[0052] MSC在本发明所述无血清和对照组培养基培养5代后，以8000cells/cm2、5000cells/cm2、3000cells/cm2的密度接种于T-25培养瓶中，分别经过无血清和对照组培养基培养5d后收获细胞，计数。每组实验均取3个样本，进行显著性差异分析。两种培养基培养MSC细胞增殖能力对比结果如表3所示，显示本发明提供的无血清培养基生长的MSC在低密度接种时，细胞增殖能力远远高于对照组培养基，在高的接种密度时候，生长速度也快于对照组培养基。

[0053] 表3

[0054]

[0055] *P<0.05vs对照组；**P<0.01vs对照组。

[0056] 实施例5：诱导MSC成骨分化

[0057] MSC在无血清和对照组培养基培养5代后，以1×105cells/well接种于预铺了I型鼠尾胶原的6孔板中，待细胞达到50%汇合时更换培养基为成骨诱导培养基。成骨诱导培养基为DMEM培养基添加10%胎牛血清、1μmol/L地塞米松、50μg/mL抗坏血酸、0.01mol/Lβ-甘油磷酸钠。对照组为添加10%胎牛血清的DMEM培养基。每3d换液，诱导21d后，95%乙醇固定，茜素红染色，显微镜下观察胞外钙基质沉积。

[0058] 实施例6：诱导MSC成软骨分化

[0059] MSC在无血清和对照组培养基培养5代后，以5×105cells/ml接种于15ml离心管中，150g离心5分钟，更换培养基为成骨诱导培养基。成软骨诱导培养基为DMEM培养基添加胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠、1μmol/L地塞米松、50μg/mL脯氨酸、20ng/mL TGF-β3。对照组为添加10%胎牛血清的DMEM培养基。每3d换液，诱导21d后，石蜡切片，阿利新兰染色，显微镜下观察。

[0060] 实施例7：诱导MSC成脂肪分化

[0061] MSC在无血清和对照组培养基培养5代后，以1×105cells/well接种于预铺了I型鼠尾胶原的6孔板中，待细胞达到80%汇合时更换培养基为脂肪诱导培养基。脂肪诱导培养基为DMEM添加10%胎牛血清、10μg/mL胰岛素、1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L IBMX、0.1mmol/L消炎痛。对照组为添加10%胎牛血清的DMEM培养基。每3d换液，诱导21d后，
10%多聚甲醛固定，饱和油红-O染液染色，显微镜下观察胞内着色脂滴。

[0062] 结果

[0063] 实施例5-7结果如图2所示。结果显示本发明提供的无血清培养基和对照组培养基MSC都具有成骨、成软骨和成脂肪分化的能力。

[0064] 统计学处理

[0065] 数据均以x±s表示，采用SPSS 13.0软件进行统计分析，组间差别采用双尾t检验和方差分析(结果以P<0.05为有较显著性差异，P<0.01为显著性差异)。

[0066] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。