一种寡核苷酸探针以及用其对靶分子进行检测的方法

摘要

本发明提供一种集信号放大和信号报告为一体的寡核苷酸探针。探针是一对基于靶分子设计的具有粘性末端的DNA发夹序列，实质是杂交链式反应燃料分子和G-四链体序列相结合的产物，既具有杂交链式反应可通过无酶、等温的方式将靶分子信号级联放大的特点，又可通过G-四链体序列这一信号报告元件的引入使得放大后的靶分子信号以方便、简捷的方式得以检测。本发明还提供了由上述探针介导的无酶等温核酸探针方法，可使待检测物的信号在没有任何酶参与且于常温条件下便可得到放大和检测，方法灵敏准确、简便易行。

权利要求

1.一种集信号放大和信号报告为一体的寡核苷酸探针，其特征在于，所述探针为一对基于靶分子设计的具有粘性末端的DNA发夹序列，其由一条普通的单链寡核苷酸序列通过内部碱基互补结合形成的，均由粘性末端、茎部和环部组成；第一个发夹序列的粘性末端位于5’-端，第二个发夹序列的粘性末端位于3’-端；

其中，第一个发夹序列的茎部序列由两部分组成，即①靠近粘性末端一侧的部分茎部序列，该序列与粘性末端共同构成靶分子的特异识别序列；和②靠近环部的部分茎部序列，其为G-四链体5’-端部分序列；

第一个发夹序列的环部序列与被封闭的G-四链体序列3’-端一侧相接，其主要由G-四链体序列的剩余部分组成；

第二个发夹序列的粘性末端位于整个发夹序列的3’-端，与相邻的茎部序列共同组成第一个发夹序列环部3’-端一侧茎部序列的互补序列；

第二个发夹序列的环部为第一个发夹序列5’-粘性末端的互补序列，与相邻的5’-端一侧的茎部序列共同组成第一个发夹序列中靶分子特异识别序列的互补序列。

2.如权利要求1所述的寡核苷酸探针，其特征在于，所述的G-四链体5’-端部分序列为被封闭在茎部的一小段G-四链体序列，使G-四链体序列在无靶分子存在时不显示活性。

3.如权利要求1或2所述的寡核苷酸探针，其特征在于，第一个发夹序列的靶分子特异识别序列与被封闭的信号报告元件序列结合处附近含有至少一个碱基与茎部另一侧序列的相应碱基不配对。

4.如权利要求1或2所述的寡核苷酸探针，其特征在于，所引入的G-四链体序列为：

5’-TGG GTA GGG CGG GTT GGG AAA-3’。

5.一种用无酶、等温核酸探针技术对靶分子进行检测的方法，其特征在于，在反应体系+中加入如权利要求1所述的寡核苷酸探针，在pH为中性或近中性、Na 浓度至少大于200mM和常温条件下，靶分子打开探针，引发杂交链式反应，一段时间后形成类似双链DNA的长链聚合分子，达到将靶分子信号级联放大的目的，结果可通过琼脂糖凝胶电泳进行检测；与此同时，探针中的G-四链体序列得到释放，使得放大后的靶分子信号可通过多种信号呈现形式得到检测。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，检测结果可通过肉眼观察、可见光吸收或荧光吸收测定这些信号检测方式来反映。

说明书

一种寡核苷酸探针以及用其对靶分子进行检测的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及核酸探针技术，具体涉及一种集信号放大和信号报告为一体的寡核苷酸探针以及一种由该探针介导的无酶等温核酸探针技术来对靶分子进行检测的方法。

背景技术

[0002] 核酸探针是能与靶分子特异结合且能将靶分子信号转换为可供后续检测的信号的核酸分子，运用核酸探针对靶分子进行检测分析的技术即为核酸探针技术。核酸探针技术是实现核酸定性和定量分析的有力工具，目前广泛应用于疾病诊断和预防、临床微生物学、群体遗传学、法医学、食品安全等领域。

[0003] 对于极微量的核酸靶分子，为了提高检测灵敏度，通常需对靶分子信号进行放大从而进行检测。常用的信号放大技术包括聚合酶链式反应（PCR）、连接酶链式反应（LCR）、滚环复制放大技术（RCA）等方法，但这些方法都需要价格昂贵的酶制剂参与。2004年，R.M.Dirks和N.A.Pierce首次报道了无需酶参与且等温条件下即可反应的信号放大技术——杂交链式反应（HCR）。

[0004] 基本的杂交链式反应体系的核心部件为一对含粘性末端的发夹序列，又称为燃料分子。第一个发夹的粘性末端和相邻的茎部序列可与靶分子特异结合，剩余部分与第二个发夹的粘性末端和相邻的茎部序列互补，而第二个发夹除去与第一个发夹互补的序列，剩余部分又与靶分子具有相同的作用，均能与第一个发夹特异结合。当反应体系中不存在靶分子时，发夹序列保持亚稳态的发夹结构。当反应体系中存在靶分子时，靶分子便可与第一个发夹序列杂交，破坏其二级结构并释放剩余序列；随后，第一个发夹被释放的序列可与第二个发夹杂交，破坏第二个发夹并释放出与靶分子具有相同作用的核酸序列，如此周而复始，最终形成类似双链DNA的大分子聚合物，从而达到无酶、等温放大靶分子信号的目的。放大后的信号可通过琼脂糖凝胶电泳或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳呈现出来。

[0005] 杂交链式反应对能直接或间接使体系中燃料分子发生聚合的靶分子均具有较好的放大作用。为了对靶分子进行更快速、直接、准确的检测，使杂交链式反应中的燃料分子真正成为一种集信号放大和信号报告为一体的核酸探针，还需赋予燃料分子合适的信号报告方式。Pierce团队将纳米金颗粒引入杂交链式反应，实现了对靶分子的可视化检测。2007年，D.A.Chemeris等在HCR体系的发夹序列中引入荧光基团和淬灭基团，通过杂交链式反应对待检测物进行适时的荧光定量检测。2010年，谭蔚泓等将荧光染料芘引入HCR发夹序列的粘性末端，利用染料分子的空间特性，使其在有靶分子存在时产生荧光信号，反之则不产生荧光信号。同年，张书圣等通过生物素修饰和磁珠固定技术将杂交链式反应与辣根过氧化物酶（HRP）相结合，使放大后的信号可通过荧光进行检测。这几种方法均通过对杂交链式反应体系中燃料分子进行修饰来实现放大后的靶分子信号的检测，价格昂贵，操作复杂，且对仪器具有绝对的依赖性。所以，寻找一种简单、易行的信号报告方式使HCR检测更快速、简便、经济具有重要意义。

[0006] G-四链体是一段富含鸟嘌呤（G）的高度有序的DNA或RNA序列。一定溶液环境中，鸟嘌呤（G）可通过hoogsteen氢键折叠形成G-四链体平面，连续的G-四链体平面的堆积便可形成稳定的G-四链体空间二级结构。G-四链体序列多存在于真核生物的端粒中，也存在于其它的非端粒基因组DNA中，如核酸酶敏感的启动子序列中。1996年，Dipankar Sen等首次通过体外筛选（SELEX）技术获得能与卟啉化合物特异识别的G-四链体序列（PS5.M和PS2.M），随后又发现这类G-四链体序列可与hemin特异结合并显示出非常强的过氧化物2- ·+
酶活性，可催化H2O2氧化ABTS 产生有颜色的自由基ABTS ，使溶液呈肉眼可见的蓝绿色。
至此，G-四链体成为一种新的脱氧核酶（DNAzyme,Catalytic DNA,Deoxyribozyme）。除能与hemin特异结合外，G-四链体还可与多种卟啉类化合物结合，TaoLi等首次报道了G-四链体与ZnPPIX的相互作用关系，其研究表明受试的G-四链体PW17、PS2.M以及T30695均可与ZnPPIX相互作用产生明显的荧光信号。

[0007] 基于杂交链式反应和G-四链体，本发明的目的便是将这两者有机结合，提供一种集靶分子信号逐级放大和信号报告为一体的核酸探针以及利用该探针对靶分子信号进行简单快速的定性定量分析的无酶、等温检测技术。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于提供一种集靶分子信号逐级放大和信号报告为一体的核酸探针以及利用该探针对靶分子信号进行简单快速的定性定量分析的无酶、等温检测方法。

[0009] 本发明的技术方案如下：

[0010] 本发明的第一方面，提供了一种集信号放大和信号报告为一体的寡核苷酸探针。探针的基本骨架与传统杂交链式反应燃料分子的骨架一致，是一对具有粘性末端的DNA发夹序列，不同之处在于信号报告元件G-四链体序列的引入。该发夹序列由普通的单链寡核苷酸序列通过内部碱基互补结合形成，均由粘性末端、茎部和环部组成。该发夹对的第一个发夹具有靶分子特异识别和结合能力，其二级结构在靶分子存在条件下可被打开。该发夹对间具有交互互补的特点，在靶分子打开任意第一个发夹的二级结构后，剩余的发夹对可通过杂交互补相继打开，最终形成类似DNA双链的长链聚合分子。

[0011] 该发夹序列的茎部是由一寡核苷酸序列中两段互补的碱基序列通过氢键结合回折形成的DNA双链区域，环部则为上述两段互补序列之间的一段DNA单链区域。第一个发夹序列的粘性末端位于5’-端，第二个发夹序列的粘性末端位于3’-端。

[0012] 本发明所述探针的结构及各部分作用和相互关系为：

[0013] （1）第一个发夹序列

[0014] 粘性末端位于整个发夹结构的5’-端。

[0015] 紧邻粘性末端的茎部序列主要由两部分组成：①靠近粘性末端一侧的部分茎部序列。该序列与粘性末端共同构成靶分子的特异识别序列；②靠近环部的部分茎部序列。此为G-四链体5’-端部分序列，为被封闭在茎部的一小段G-四链体序列，使G-四链体序列在无靶分子存在时不显示活性。

[0016] 与被封闭的G-四链体序列3’-端一侧相接的是环部序列，主要由G-四链体序列的剩余部分组成。

[0017] 环的3’-端一侧茎部序列与环的5’-端一侧茎部序列几乎完全互补，除在靶分子特异识别序列近3’-端处有一个碱基与另一侧茎部序列的相应碱基不配对。

[0018] 视G-四链体序列不同，在不影响G-四链体二级结构及其活性的前提下，序列前后可添加不同数量的任意碱基，保证释放后的G-四链体序列有足够的空间形成二级结构。

[0019] （2）第二个发夹序列

[0020] 粘性末端位于整个发夹序列的3’-端，与相邻的茎部序列共同组成第一个发夹序列环部3’-端一侧茎部序列的互补序列。环部为第一个发夹序列5’-粘性末端的互补序列，与相邻的5’-端一侧的茎部序列共同组成第一个发夹序列中靶分子特异识别序列的互补序列，该部分序列具有与靶分子相同的作用，均能与第一个发夹序列的靶分子特异识别序列特异结合。

[0021] 该探针的第一个发夹序列的靶分子特异识别序列与被封闭的信号报告元件序列结合处附近含有至少一个碱基与茎部另一侧序列的相应碱基不配对。

[0022] 本发明的探针结构如附图1所示。

[0023] 本发明所涉及的G-四链体是一段富含鸟嘌呤（G）且在一定溶液环境下能形成G-四链体二级结构的DNA序列，能与卟啉铁（hemin）等结合产生过氧化物酶活性。在含G-四链体的反应体系中加入hemin、显色底物（ABTS、DAB等）、H2O2后，G-四链体与hemin形成的具有过氧化物酶活性的复合物，可催化H2O2氧化显色底物显色。该显色反应在室温下即可进行，且显色结果可直接通过肉眼观察或用分光光度计进行测定。

[0024] 本发明所涉及的G-四链体还可与ZnPPIX、NMM等卟啉类化合物结合，在一定波长的光的激发下产生荧光信号。

[0025] 表1.部分试剂的中英文全称

[0026]

[0027] 本发明的第二方面提供了一种利用本发明第一方面涉及的寡核苷酸探针对靶分子进行定性、定量分析的无酶、等温检测方法。

[0028] 该方法为在反应体系中加入上述本发明第一方面涉及的寡核苷酸探针，在pH为+中性或近中性、Na 浓度至少大于200mM和常温条件下，靶分子打开探针，引发杂交链式反应，一段时间后形成类似双链DNA的长链聚合分子，达到将靶分子信号级联放大的目的，结果可通过琼脂糖凝胶电泳进行检测；与此同时，探针中的G-四链体序列得到释放，使得放大后的靶分子信号可通过多种信号呈现形式得到检测。

[0029] 其中，由于探针中的G-四链体序列得到释放，基于G-四链体序列广泛的化学和生物特性，如过氧化物酶活性、与卟啉类化合物的特异结合能力等，可通过多种信号呈现形式来检测放大后的靶分子信号。

[0030] 例如探针中释放的G-四链体序列与hemin、ABTS、H2O2反应后，反应溶液可由无色变为肉眼可见的绿色，使得放大后的靶分子信号得以定性检测，也可测定显色产物的吸光度值使靶分子信号得以定量检测；被释放的G-四链体序列还可与ZnPPIX等卟啉类化合物结合产生荧光信号，通过检测荧光信号也可定性定量检测靶分子。

[0031] 具体地，本发明所涉及的无酶、等温检测方法是，当反应体系中不存在靶分子时，探针保持亚稳态的DNA发夹二级结构。当体系中存在靶分子时，靶分子与探针的第一个发夹序列的靶分子特异识别序列特异结合，基于最小热力学平衡原理和茎部一不配对碱基对的影响，第一个发夹结构的特异识别区（即除G-四链体封闭区外的茎部序列）被打开。此时，由于G-四链体被封闭区域自身的不稳定性以及环部3’-端一侧的茎部序列与第二个发夹3’-粘性末端和相邻茎部序列杂交的趋势，G-四链体被封闭区域可被打开，并结合环部的G-四链体序列形成自由的G-四链体序列。与此同时，环部3’-端一侧的茎部序列被释放，并与第二个发夹的相应序列杂交，释放出第二个发夹序列的环部序列及相邻的5’-端一侧的茎部序列。第二个发夹被释放的序列具有与靶分子相同的作用，均可与第一个发夹的靶分子特异识别序列特异结合，从而导致两个发夹级联杂交，不断循环，最初聚合形成一条类似双链DNA的大分子长链聚合产物。而此时，被释放的大量的完全自由的G-四链体序列即可通过一定方式发挥其信号报告的作用。当G-四链体二级结构与hemin结合后，其过氧化物酶活性可催化H2O2氧化ABTS，使反应溶液由无色变为绿色，从而使靶分子得到检测，也可通过测定414nm处的光吸收值进行检测。当G-四链体二级结构与ZnPPIX结合，用420nm的光激发，可在590nm处产生强烈的荧光信号，通过检测荧光信号的强度也可对靶分子信号进行检测。

[0032] 本发明的核酸探针检测技术原理如附图2所示。

[0033] 本发明所涉及的无酶、等温检测方法是指整个检测反应不需要任何酶参与，且在等温条件下即可进行。此处所述等温条件并非绝对等温，而是与如聚合酶链式反应等需在多个温度间进行切换的检测方法相对而言的一个较大的温度范围，依赖于探针发夹结构的稳定性。温度无需严格控制，一般在常温下即可进行。

[0034] 本发明所涉及的无酶、等温检测方法中，不同的靶分子量在一定的时间内产生的自由G-四链体序列的量不同，故可产生不同强度的颜色信号、光吸收值或荧光信号，从而可对靶分子实现定性、定量检测。

[0035] 上述方法中，反应所需pH范围为中性或近中性，Na+浓度至少大于200mM；检测结果可通过肉眼观察、可见光吸收或荧光吸收测定来反映。

[0036] 本发明所涉及的靶分子可以是任何可通过传统杂交链式反应检测的待分析物，即可以是简单的核酸分子，可以是能与探针的特异识别序列进行特异结合的某些小分子，也可以是可通过其它过程产生与本发明所述的探针特异结合的分子。

[0037] 本发明所涉及的探针中所引入的G-四链体序列没有特殊限制。本发明所引入的G-四链体序列为命名为CatG4的一段序列：5’-TGG GTA GGG CGG GTT GGG AAA-3’（SEQ ID NO 1）。

[0038] 本发明所涉及的探针的第一个发夹序列的茎部对G-四链体序列5’-端的前6个碱基进行封闭。一方面可使G-四链体序列在无靶分子存在时保持沉默，有效防止假阳性信号的产生；一方面也不致G-四链体序列被封闭区域在靶分子将特异识别区域茎部序列打开后难以释放，从而影响杂交链式反应效率。

[0039] 本发明所涉及的探针的第一个发夹序列所涉及的一对不配对碱基对于杂交链式反应的顺利进行和G-四链体序列的释放有重要作用，本发明所涉及的不配对碱基为第一个发夹茎部序列靠近环部的第8对碱基。

[0040] 在本发明中，除另外特别说明外，下列词语/术语具有下列含义。

[0041] “核酸”：主要指脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA），也可以是经过修饰的DNA或RNA类似物、肽核酸（PNA）以及嵌合DNA或RNA分子。

[0042] “寡核苷酸”：小分子核酸，由核苷酸残基（片段）通过磷酸二酯键连接（聚合）而成，分子量介于核酸与核苷酸之间，并倾向于核苷酸。

[0043] “发夹结构/发夹序列”：本发明所述发夹结构或发夹序列是指一段由粘性末端、茎部序列(双链区、螺旋区)和环部序列(单链区)组成的类似于发夹状结构的寡核苷酸序列。

[0044] “靶分子”：能与本发明所述探针特异结合或能通过其它过程产生与本发明探针特异结合的分子的待检测物质，主要包括（但并不限于）核酸分子、蛋白质、抗原、抗体、病原体以及其它分子。

[0045] “杂交链式反应（HCR）”：核心部件为至少两个以上的在碱基序列上具有互补关系的亚稳态的发夹结构或其它核酸二级结构，又称为燃料分子。杂交链式反应即为在靶分子的触发作用下，亚稳态的发夹结构或其它核酸二级结构被打开并相互杂交，最终形成类似双链DNA的长链聚合分子。

[0046] “G-四链体序列”：一段富含鸟嘌呤（G）的高度有序的DNA或RNA序列。

[0047] “G-四链体二级结构”：是指G-四链体序列中的鸟嘌呤（G）在一定溶液环境中通过hoogsteen氢键折叠形成G-四联体平面，连续的G-四联体平面在空间上进行堆积便可形成稳定的G-四链体二级结构。

[0048] “亚稳定”：描述了本发明所述探针的热力学性质，是指本发明所述探针在反应体系中缺乏靶分子的情况下保持发夹结构，当反应体系中存在靶分子时，靶分子与本发明所述探针的特异识别序列结合或互补杂交，从而破坏本发明所述探针的亚稳定二级结构。

[0049] “粘性末端”：本发明所述探针中与发夹结构茎部序列相邻的5’-或3’-末端的摆动寡核苷酸序列，其特征是粘性末端自身与其它分子的结合或互补杂交并不能影响本发明探针的亚稳定二级结构，但当存在能与粘性末端及相邻的茎部序列共同构成的特异识别序列特异结合或互补杂交的靶分子时，本发明所述探针的亚稳定二级结构将受到破坏，并释放出自由的G-四链体序列。

[0050] “特异识别序列”：本发明所述探针中能特异识别靶分子并与之互补或结合的DNA序列。特异识别序列的主要作用一方面为能特异识别靶分子并与之发生作用，一方面为当其与靶分子特异性结合或互补杂交后破坏本发明所述探针的亚稳定二级结构，推动杂交链式反应，释放自由的G-四链体序列。

[0051] “定性检测”：直接或间接检测靶分子是否存在。

[0052] “定量检测”：直接或间接检测靶分子的浓度或量。

[0053] “hemin”：血红素，即卟啉铁。

[0054] 本发明与现有的核酸检测方法相比，主要有以下优点：

[0055] （1）经济。现有的大多数核酸探针是通过对核酸分子进行修饰或改性得到的，本发明所涉及的核酸探针为单纯的寡核苷酸序列。现有的核酸检测方法大多离不开酶的参与，本发明所涉及的核酸检测方法由于探针本身具有信号放大和信号报告双重功能而可以在无需任何酶参与的条件下对靶分子进行检测。由于核酸修饰或改性以及酶都非常昂贵，所以本发明所述核酸检测方法可以大大降低检测成本。

[0056] （2）简单。现有的核酸检测体系大多成分复杂，步骤繁复。本发明所涉及的核酸检测方法仅需将探针与待检测物混合，在中性或近中性溶液和一定的钠离子浓度条件下于常温反应至多一个小时即可加入显色试剂或荧光染料从而得到检测结果。

[0057] （3）实用。现有的核酸检测方法对仪器的依赖程度非常高，大多只能在实验室内完成。本发明所涉及的核酸检测方法在常温下进行即可，而显色检测手段更是不需要任何仪器，简单、快速，至多一个小时即可得到检测结果，尤其适用于现场分析，具有非常高的实用性。

附图说明

[0058] 图1是本发明的探针结构示意图。

[0059] 图2是本发明的核酸探针检测方法原理示意图。

[0060] 图3是本发明的核酸探针方法检测不同浓度靶核酸的ZnPPIX荧光结果图。

具体实施方式

[0061] 实施例1、基于一人工合成的靶核酸分子进行探针设计（结合附图1）[0062] 人工合成的靶核酸DNA序列T1:

[0063] 5’-TCTCCACAACTGAACACGTTAGA -3’（SEQ ID NO 2）。

[0064] 由T1转录得到的靶核酸RNA序列T1-R:

[0065] 5’-UCUCCACAACUGAACACGUUAGA -3’（SEQ ID NO 3）。

[0066] （双下划线序列命名为序列a，无标记部分为序列b。）

[0067] 根据T1和T1-R设计的探针序列分别为：

[0068] A、发夹GAa1

[0069] 5’- TCTAACGTGTTCAGTTGTGGA AT TCCACAACTGAACACGTTAGA-3’（SEQ ID NO 4）。

[0070] 序列组成、各部分关系及命名说明：

[0071] ①5’-端双下划线序列为粘性末端，与靶核酸T1的3’-末端双下划线序列互补，命名为序列a*，相邻的单下划线序列命名为序列b*，与靶核酸的序列b互补，a*、b*整体为靶核酸T1和T1-R的特异识别序列，与靶核酸完全互补；

[0072] ②斜体部分为G-四链体序列，其中阴影部分为被封闭序列，命名为序列g1，其余部分位构成发夹GAa1的环部，命名为g2；

[0073] ③紧挨g2的双下划线序列一方面封闭g1，一方面与第二个发夹GA2的3’-粘性末端互补，命名为g1*；

[0074] ④与g1*相邻的单下划线序列与序列b*几乎完全互补，除带边框的一对碱基不配对，因此与序列b有一个碱基之差，命名为序列b′。

[0075] B、发夹GA2

[0076] 5’-T TCCACAACTGAACACGTTAGACCACTTTCTAACGTGTTCAGTTGTGGA A -3’（SEQ ID NO 5）。

[0077] 序列组成、各部分关系及命名说明：

[0078] ①3’-端双下划线序列为粘性末端，与发夹GAa1中g1相同，与g1*互补，仍命名为g1。与g1相邻的单下划线部分与发夹GAa1中b′完全互补，命名为b′*；

[0079] ②与b′*相邻的为标记部分构成发夹GA2的环部，与靶核酸DNA序列中的序列a相同，同命名为序列a。与GA2中序列a相邻的单下划线部分与靶核酸DNA序列中的序列b相同，同命名为序列b，该序列与b′*几乎完全互补，除带边框的一对碱基不配对。由于发夹GA2中的序列a和b同靶核酸DNA序列完全一致，故可同发夹GAa1中的靶核酸特异识别序列完全互补，发挥同靶核酸DNA和RNA序列相同的作用。

[0080] 实施例2、运用实施例1中所述探针对靶核酸进行检测

[0081] （1）ABTS显色方法检测不同浓度的靶核酸

[0082] ①反应体系（TV=20μL）

[0083] 表2ABTS显色方法所用杂交链式反应体系

[0084]

[0085] 注：X表示加入的不同体积的靶核酸储备液，Y表示与X相对应的不同的靶核酸终-9 -8 -8 -8 -8 -7浓度，分别为0M,7.5x10 M,1.5x10 M,3x10 M,5x10 M,7.5x10 M,1x10 M。

[0086] ②探针预处理

[0087] 检测前需对探针——发夹GAa1和GA2分别进行预处理。预处理方式为：将反应所需的NaCl量二等分，分别与发夹GAa1和GA2混合（以一个反应所需的量为例：1μL GAa1(10μM)与1μL NaCl(4M)混合，1μL GA2(10μM)与1μL NaCl(4M)混合），于95℃加热2min，缓慢降温1h左右至室温。

[0088] ③杂交链式反应

[0089] 将经预处理的探针——发夹GAa1和GA2混合，按表1加入buffer和靶核酸，并加水补足至20μL，振荡混匀，于37℃反应1h（置于冰上即可停止反应）。

[0090] ④ABTS显色检测

[0091] 向HCR反应产物中加入KCl(90mM)、Triton X-100(0.05%)、hemin(0.625μM)，振荡混匀，继续加入ABTS(4.5mM)和H2O2(3mM)，振荡混匀，于室温下放置一段时间，观察颜色变化。

[0092] 检测结果：显色10min左右即可观察到明显的颜色变化。随靶核酸浓度从低到高，ABTS被氧化的程度不同，呈现出由浅至深不同程度的绿色。

[0093] B、ZnPPIX荧光检测不同浓度的靶核酸

[0094] ①反应体系（TV=80μL）

[0095] 表3ZnPPIX荧光检测方法所用杂交链式反应体系

[0096]

[0097] 注：X表示加入的不同体积的靶核酸储备液，Y表示与X相对应的不同的靶核酸终浓度，分别为0nM,3nM,6nM,9nM,15nM,20nM,40nM,60nM,80nM,100nM,120nM。

[0098] ②探针预处理

[0099] 检测前需对探针——发夹GAa1和GA2分别进行预处理。预处理方式为：将反应所需的NaCl量二等分，分别与发夹GAa1和GA2混合（以一个反应所需的量为例：4μL GAa1(10μM)与8μL NaCl(5M)混合，4μL GA2(10μM)与8μL NaCl(5M)混合），于95℃加热2min，缓慢降温1h左右至室温。

[0100] ③杂交链式反应

[0101] 将经预处理的探针——发夹GAa1和GA2混合，按表2加入buffer和靶核酸，并加水补足至80μL，每个样品三个平行，振荡混匀，于37℃反应1h（置于冰上即可停止反应）。

[0102] ④ZnPPIX荧光检测

[0103] 向HCR反应产物中加入KCl(50mM)、ZnPPIX(1μM)，振荡混匀，用波长为420nm的光进行激发，扫描550-670nm范围内的荧光谱图，并测定590nm处的荧光值，制作工作曲线。

[0104] 检测结果：如附图3所示，随靶分子浓度增加，荧光信号增强，且在一定范围内呈线性增长趋势。