一种粮食和/或其副产物中真菌毒素的生物降解方法

摘要

本发明公开了一种粮食和/或其副产物中真菌毒素的生物降解方法。该方法以被真菌毒素污染的粮食和/或其副产物为原料，利用含有真菌毒素降解酶基因的工程菌进行发酵生产乙醇，并进一步将乙醇生产工艺中的副产物制成酒糟蛋白，该酒糟蛋白中真菌毒素的含量可达到国家限量标准以下，并可用于动物饲料等用途，解决了现有发酵生产乙醇工艺中产生的酒糟因真菌毒素超标无法有效利用，并污染环境的重大问题。

权利要求

1.一种粮食和/或其副产物中真菌毒素的生物降解方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）粉碎被真菌毒素污染的粮食和/或其副产物，所述粮食为小麦、玉米、稻谷、大麦或木薯，粮食副产物为淀粉、麦麸或玉米浆；

（2）加入水进行蒸煮；

（3）冷却，再加入粮食和/或其副产物重量的0.01-1%的糖化酶进行糖化；

（4）加入粮食和/或其副产物重量的0.001-2%的含有真菌毒素降解酶基因的酿酒酵母工程菌菌株进行发酵；其中，真菌毒素降解酶的基因为玉米赤霉烯酮降解酶基因、脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因和伏马毒素降解酶基因；所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的基因如序列表中SEQ ID NO：1所示，其对应的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；所述玉米赤霉烯酮降解酶的基因如序列表中SEQ ID NO：3所示，其对应的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示；所述伏马毒素降解酶基因如序列表中SEQ ID NO:5，其对应的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示；

（5）分别制得乙醇及酒糟；

（6）将酒糟制成酒糟蛋白，并测定酒糟蛋白中真菌毒素含量，其中，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量≤500ug/kg；玉米赤霉烯酮的含量≤60ug//kg；伏马毒素的含量≤1000ug/kg。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，粮食和/或其副产物与水的重量比为1:2-1: 8。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，发酵的条件为：温度保持

30℃-35℃，发酵时间为60-120h。

说明书

一种粮食和/或其副产物中真菌毒素的生物降解方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种以被真菌毒素污染的小麦、玉米、大麦等粮食和/或其副产物为原料发酵的同时降解真菌毒素的方法。

背景技术

[0002] 真菌毒素是产毒真菌在危害过程做产生的一类次生代谢物质，主要包括黄曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（又称呕吐毒素，DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和伏马毒素（FUM）和赭曲霉毒素等，近几年，由于我国极端气候的频繁出现，导致了以危害小麦、玉米为主的赤霉病的大流行，真菌产生的DON和ZEN污染加重，污染超标的小麦和玉米不断增加，为保障我国的人民消费安全和畜牧养殖安全，国家粮食局及有关部门对2010年我国黄淮海地区小麦收获季节感染严重的赤霉病，DON大面积超标毒素超标小麦及时进行了封存，共计174.5万吨。由于缺乏行之有效的安全处理技术，目前仍处于封存状态。2012年的小麦赤霉病大流行，导致我国安徽、江苏、河南局部的小麦DON和ZEN毒素含量超标严重。研究毒素超标粮食的安全利用，不仅可保护我国农民的种粮利益，同时防止流入口粮市场维护国家粮食食品质量安全已迫在眉睫。

[0003] 对于真菌毒素的清除，目前国内外较为普遍的方法主要有物理去除及吸附、化学处理等。吸附剂在吸附真菌毒素的同时还大量吸附了饲料和食品中的微量营养物质，被黏土吸附后的毒素，无法被分解，会引起二次污染。

[0004] 生物降解不仅可以高效将毒素转化为无毒产物、环保安全，而且生物酶催化方法专一性强、转化效率高。已经成为当前真菌毒素削减技术中最有发展前景的处理技术途径，其不仅安全、环保、高效，而且利用现代生物技术开展研究非常符合当前我国节能减排的发展趋势。当前利用真菌毒素污染粮食作为原料发酵生产乙醇是最主要的手段之一，但毒素在发酵生产得到的大量副产物酒糟中被进一步浓缩，真菌毒素如DON、ZEN和FUM含量大大超过国家限量标准而不能利用。DDGS又称酒糟蛋白，因其高蛋白、高有效磷、低植酸磷、高维生素等优点，深受饲料业欢迎。DDGS作为常规蛋白质饲料的重要替代品，它的使用大大缓解了我国常规蛋白质资源缺乏现状，有效降低了生产成本，但真菌毒素含量超标严重，DDGS中真菌毒素含量几乎达到发酵粮食原料的3倍，根据2010年DDGS市场调查，玉米赤霉烯酮检出率为73%，呕吐毒素检出率为98%。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种粮食和/或其副产物中真菌毒素的生物降解方法，该方法是以被真菌毒素污染的粮食和/或其副产物为原料，通过构建含有降解毒素酶基因的工程菌，在生产发酵产品的同时，高效降解发酵产物中真菌毒素含量，使其达到国家限量标准以下，无需在发酵结束后再对发酵产物进行再次处理，不仅把真菌毒素含量超标的发酵产物安全利用，而且产生巨大的经济效益和环保、社会效益。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案：

[0007] 本发明提供一种粮食和/或其副产物中真菌毒素的生物降解方法，该方法包括以下步骤：

[0008] （1）粉碎粮食和/或其副产物；

[0009] （2）加入水进行蒸煮，

[0010] （3）冷却，加入粮食和/或其副产物重量的0.01-1%的糖化酶进行糖化，进一步地，优选糖化酶的用量为0.05-0.4%；

[0011] （4）加入粮食和/或其副产物重量的0.001-2%的含有真菌毒素降解酶基因的酿酒酵母工程菌菌株进行发酵，进一步地，优选工程菌的添加量为0.01-1%，更进一步为0.08-0.2%；其中，所述真菌毒素降解酶的基因为玉米赤霉烯酮降解酶基因、脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因和伏马毒素降解酶基因中的一种或几种；

[0012] 该步骤中所述玉米赤霉烯酮降解酶基因、脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因和伏马毒素降解酶基因可以是现有技术中已经公开的降解酶基因，本领域技术人员可以利用现有分子生物学方法构建工程菌来实现本发明。为了详细说明本发明的方法，本发明在实施例中也提供一种工程菌的构建方法；

[0013] （5）分别制得乙醇及酒糟；制得的乙醇就是常说的工业酒精；

[0014] （6）将酒糟制成酒糟蛋白，并测定酒糟蛋白中真菌毒素含量，其中，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量≦500ug/kg；玉米赤霉烯酮的含量≦60ug//kg；伏马毒素的含量≦1000ug/kg。该步骤可以采用现有技术中已知的方法来实现，制成的酒糟蛋白由于真菌毒素含量达到国家限量标准以下，可以直接用来进行饲料生产。

[0015] 进一步地，所述粮食为小麦、玉米、大麦、稻谷或木薯等，粮食副产物是指淀粉、麦麸或玉米浆等。

[0016] 进一步地，步骤（2）中，所述粮食和/或其副产物与水的重量比为1:2-1:8，优选为1:3-1:4。

[0017] 进一步地，步骤（4）中，所述发酵的条件为：温度保持30℃-35℃，发酵时间为60-120h。

[0018] 进一步地，所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的基因如序列表中SEQ ID NO：1所示，其对应的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；所述玉米赤霉烯酮降解酶的基因如序列表中SEQ ID NO：3所示，其对应的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示；所述伏马毒素降解酶基因如序列表中SEQ ID NO:5，其对应的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。

[0019] 采用本方法具有以下优点：

[0020] （1）本发明方法可大规模处理含有真菌毒素的粮食和/或其加工副产物，解决当前缺乏行之有效处理技术，并产生显著经济效益。因为，该方法不仅破除了乙醇发酵副产物DDGS因真菌毒素超标的质量瓶颈，并且无需在发酵结束后再对包括DDGS等发酵产物的再次处理，减少能源消耗和环境污染，可推动我国每年巨量的DDGS的“变废为宝”的安全、高效和价值最大化利用。这不仅为我国大量真菌毒素超标的粮食安全处理开辟了一条全新的技术途径，而且也有助于大量的DDGS作为蛋白质饲料等在畜牧业上的广泛应用缓解我国常规蛋白质资源缺乏，降低饲料成本。更有助于节约、高效用粮、保障国家粮食食品质量安全的目的。

[0021] （2）与物理、化学方法相比，不会产生二次污染，有利于节能减排，保护环境。

[0022] （3）该方法可在不改变现有发酵条件的前提下使用，节约大量的财力和人力等成本。

附图说明

[0023] 图1、本发明的生产工艺流程图；

[0024] 图2、发酵乙醇产生的DDGS中真菌毒素含量变化图。

[0025] 具体实施例方式

[0026] 下面结合具体实施例，进—步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

[0027] 实施例1：具有降解能力的酿酒酵母工程菌的构建

[0028] 1、从毕赤酵母（pichiapastoris）GS115中克隆GAP基因片段

[0029] 引物序列：

[0030] 上游引物：5-GC ACTAGT TTT TTG TAGAAATG-3（SEQ ID NO.7所示）[0031] 下划线为Spe I

[0032] 下游引物：5-GG GAATCCATAGTT GTT CAATTG-3（SEQ ID NO.8所示）[0033] 下划线为EcoRI.

[0034] 更换PYES2载体的诱导型启动子为组成型GAP启动子（甘油醛磷酸脱氢酶组成型启动子）

[0035] 2、具有外分泌能力酿酒酵母表达载体的构建

[0036] 根据已报道的毕赤酵母外分泌表达载体上编码外分泌蛋白α交配因子编码基因的序列（GenBank Accession No.HQ398363.1），设计如下引物，分别引入BamHI和XbaI识别位点

[0037] 上游引物P7：5'-CGCGGATCCATGAGATTTCCTTCAATTTT-3'（SEQ ID NO.9所示）[0038] 下划线为Bam HI

[0039] 下游引物P8：5'-GCTCTAGATTAATTCGCGGCCGCCCTAG-3'（SEQ ID NO.10所示）[0040] 下划线为Xba I

[0041] 用毕赤酵母表达载体pIC9k的质粒DNA作为模板进行PCR扩增，将得到PCR产物进行测序正确后，经BamHI和XbaI双酶切的处理后插入至pYES2载体上，获得具有外分泌能力的表达载体SCWES2。

[0042] 3、降解酶基因表达载体的构建

[0043] （1）真菌毒素DON降解酶基因DONase的克隆

[0044] A．将标准菌株尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）ACCC No.36245（购自中国农业微生物菌种保藏管理中心）活化后接入PDA液体培养基（马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH自然），然后将菌株的悬浮液接入100ml同样的培养基，摇床条件为220转/分钟，30℃，72小时。培养完成后用离心机12000转/分钟离心收集菌体。提取RNA（Trizol法）；

[0045] B．以RNA为模板逆转录合成cDNA序列；再cDNA序列为模板，在引物1和引物2的引导下进行PCR反应，扩增脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因的序列。

[0046] 上游引物P1：5'-GGAATTCCATATGACTGCACTAAACGTTACAAAC-3'（划线部分碱基为Nde I识别位点）（SEQ ID NO.11所示）

[0047] 上游引物P2：5'-CCCAAGCTTCTAGCCAATGAATTGCCCATAC-3'（划线部分碱基为HindⅢ识别位点）（SEQ ID NO.12所示）

[0048] 在PCR反应中，PCR反应条件为：94℃，保持5分钟，接着按以下的温度变化程序循环30次：升温至94℃，保持1分钟，降温至54℃，保持1分钟，升温至68℃，保持2分钟；然后于68℃，保持10分钟，最后于4℃保温10分钟，结束扩增反应。通过琼脂糖电泳分析获得约1.4kb的单一带，扩增之后的PCR产物检测之后将目的带大小的扩增产物用DNA凝胶回收试剂盒进行回收，并检测其浓度。回收PCR产物连接pMD19-T Vector转化大肠杆菌JM109，获得重组质粒pMD19-Dasag测序鉴定。则该脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因DNA序列为序列表SEQ ID NO：1，其对应的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO：2。

[0049] （2）真菌毒素ZEN降解酶基因ZDase的克隆

[0050] 以标准菌株粉红粘帚霉ACCCNo.31535基因组DNA为模板进行PCR扩增。设计如下引物，分别引入EcoRI和NotI识别位点（用下划线标出）

[0051] 上游引物P3：5'-CCG GAA TTC ATG CGC ACT CGC AGC ACA AT-3'（SEQ ID NO.13所示）

[0052] 下游引物P4：5'-ATAAGAAT GCG GCC G CA AGA TAC TTC TGC GTAAAT T-3′（SEQ ID NO.14所示）

[0053] PCR反应在50μLPCR反应混合液中含有25μL KOD酶Mix，12.5μmoL/L引物各2μL，模板10μL，加无菌水11μL调整至50μL.条件为94℃，变性5min，循环参数：94℃变性40s；54℃退火1min；68℃延伸1min；30个循环；68℃延伸10min使产物延伸完全。将得到PCR产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳，得到一条约0.8kb条带，其大小与预期相当，具体方法参见中国专利公开号CN102199581A“一种玉米赤霉烯酮毒素降解酶及其编码基因与应用”。经测序，该玉米赤霉烯酮降解酶基因DNA序列为序列表SEQ ID NO：3，其对应的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO：4。

[0054] （3）真菌毒素FUM降解酶基因fumD

[0055] 该基因序列来自NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），GenBank登录号：HV695894.1。以购自中国海洋微生物菌株保藏管理中心的标准菌株鞘氨醇单胞菌菌株（Sphingopyxis sp，编号为1A02290）基因组DNA为模板进行PCR扩增。设计如下引物，分别引入EcoRI和NotI识别位点（用下划线标出）

[0056] 上游引物P5：5'-CCG GAA TTCGTG AAA GAG CAC CAA TGC CG-3'（SEQ ID NO.15所示）

[0057] 下游引物P6：5'-ATAAGAAT GCG GCC GCCTA TTT TGA GGG TTG GCA GGC-3'（SEQ ID NO.16所示）

[0058] PCR反应在50μLPCR反应混合液中含有25μL KOD酶Mix，12.5μmoL/L引物各2μL，模板10μL，加无菌水11μL调整至50μL.条件为94℃，变性5min，循环参数：94℃变性40s；54℃退火1min；68℃延伸1min；30个循环；68℃延伸10min使产物延伸完全。将得到PCR产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳，得到一条约1.6kb条带，其大小与预期相当。经测序，伏马菌素降解酶基因DNA序列为序列表SEQ ID NO：5，其对应的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO：6。

[0059] （4）降解酶基因表达载体的构建

[0060] 将（1）、（2）、（3）中扩增得到的降解酶基因双酶切处理后，插入到外分泌载体SCWES2的相应的双酶切位点中，分别获得可表达ZEN、DON、FUM三种毒素降解酶的重组表达载体SCWES2-1、SCWES2-2和SCWES2-3。

[0061] （5）工程菌的获得与鉴定

[0062] 将上述构建成功的表达载体通过电击转化法导入到购自Invitrogen公司的酿酒酵母INVsCL菌株中，因该菌株是尿嘧啶缺陷性菌株，质粒表达载体上含有产生尿嘧啶的基因序列，故转化成功的工程菌株可以再不含有尿嘧啶的培养基上生长，二没有转化成功的菌株不能生长。然后挑选几个生长健壮的菌株作为种子菌株利用引物P3和P4检测ZEN降解酶基因、利用引物P5和P6检测DON降解酶基因、利用P7和P8检测FUM降解酶基因，通过PCR检测获得同时含有1个或多个重组表达载体的工程菌，进一步进行真菌毒素降解能力实验。

[0063] 实施例2：工程菌发酵生产乙醇过程中降解真菌毒素的能力测定

[0064] 实验目的：以真菌毒素污染超标小麦（ZEN含量为725ug/kg；DON含量为2560ug/kg；FUM含量物1453ug/kg）为乙醇生产原料，在发酵中检测DDGS中真菌毒素ZEN、DON和FUM的含量变化，以检验酿酒酵母基因工程菌在酒精生产中对DDGS中真菌毒素的降解效果。

[0065] 实验仪器及试剂：高效液相色谱仪，水浴锅，pH计，恒温震荡培养箱。甲醇（色谱纯），乙腈、纯水。

[0066] 实验步骤：

[0067] 分为两组实验，1号菌株和2号菌株，菌株1为利用实施例1中的方法构建的酿酒酵母工程菌，该工程菌同时含有可表达ZEN、DON和FUM三种毒素降解酶基因；菌株2为常规酿酒酵母，实验步骤除所用菌株不同，均采用以下方法：

[0068] 1、粉碎污染小麦原料经过二级粉碎,30-40目过筛,按照小麦与水的重量比为1：3-1：4加水拌料；

[0069] 2、100-125℃蒸煮90-120min，经二级冷却至60℃-65℃，加小麦重量0.05-0.4%糖化酶糖化40min-60min,糖化醪浓度16Bx-18Bx,然后冷却至30℃-32℃送入发酵罐。在蒸煮过程中应注意保持进醪均匀,醪浆浓度始终如一,避免忽高忽低,影响生产。

[0070] 3、酒母罐杀菌后,泵入糖化醪,调酸pH4.0-4.5，分别接入已活化的菌株1和菌株2。

[0071] 4、发酵，温度保持30℃-35℃，发酵时间为60-120h，蒸馏，分别得到酒精（即乙醇）和酒糟。

[0072] 5、酒糟经过固液分离,滤清液送去蒸发浓缩,所得浓浆与分离糟粕一起进行干燥,即成为酒糟蛋白（DDGS）。

[0073] 6、用高效液相色谱法检测DDGS中的真菌毒素含量。

[0074] 表1小麦发酵乙醇DDGS中真菌毒素含量

[0075]菌株 ZEN(ug/kg) DON（ug/kg） FUM(ug/kg)
1# 45 287 172
2# 1456 4267 2366

[0076] 结论：酿酒酵母基因工程菌用于在酒精发酵，副产物DDGS中的真菌毒素得到高效降解，ZEN降解率达到97%；DON降解率达到94%；FUM降解率达到93%，DDGS中的三种毒素均降到国家限量标准以下，可安全的用于饲料，保障我国畜禽生产安全。

[0077] 显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。