一种龙须菜琼胶寡糖及其制备方法与应用转让专利
申请号 : CN201210347105.5
文献号 : CN102827899B
文献日 : 2013-11-27
发明人 : 曾润颖 , 产竹华 , 万玮 , 高超
申请人 : 国家海洋局第三海洋研究所
摘要 :
一种龙须菜琼胶寡糖及其制备方法与应用，涉及一种寡糖。提供一种龙须菜琼胶寡糖及其制备方法与龙须菜琼胶寡糖在制备抗氧化、抗紫外线保健品和化妆品中的应用。所述龙须菜琼胶寡糖是利用太平洋火色杆菌H2与龙须菜共培养，利用菌株所产的酶系直接降解龙须菜获得聚合度为4～8的琼胶寡糖，具有抗氧化、吸收紫外线等生理活性。制备时将菌株用活化培养基平板进行活化后，接种于种子培养基中，振荡培养得发酵液，再接种入产糖培养基中，继续振荡发酵培养后离心，收集上清液，采用膜过滤设备，将上清液依次用0.45μm，0.22μm滤膜，10000～50000D超滤膜和300～600D纳滤膜，所得滤出液即为龙须菜琼胶寡糖。
权利要求 :
1.一种龙须菜琼胶寡糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将菌株太平洋火色杆菌（Flammeovirga Pacifica）H2用活化培养基平板进行活化后，接种于种子培养基中，振荡培养得发酵液；所述活化培养基平板为：含经60～80目过筛后的龙须菜粉末1%，酵母膏0.2%，NaCl 3%，琼胶粉1.5%，蒸馏水配制，经121℃，20min灭菌后使用；所述种子培养基为：含CMC-Na2 0.5%～1.5%，酵母膏0.2%，NaCl 3%，蒸馏水配制，经121℃，20min灭菌后使用；所述太平洋火色杆菌（Flammeovirga Pacifica）H2已于
2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2012229；
2）将步骤1）中得到的发酵液接种入产糖培养基中，继续振荡发酵培养后离心，收集上清液；所述产糖培养基为：含经60～80目过筛的龙须菜粉末1%～5%，MgCl2 0.1%～0.5%，蒸馏水配制，经121℃，20min灭菌后使用；
3）采用膜过滤设备，将上清液依次用0.45μm，0.22μm滤膜，10000～50000D超滤膜和300～600D纳滤膜，所得滤出液即为龙须菜琼胶寡糖。
2.如权利要求1所述一种龙须菜琼胶寡糖的制备方法，其特征在于在步骤1）中，所述振荡培养的条件为：在25～37℃条件下，250r/min振荡培养至OD600＝1.0～1.5。
3.如权利要求1所述一种龙须菜琼胶寡糖的制备方法，其特征在于在步骤2）中，所述发酵液的接种比例为5%。
4.如权利要求1所述一种龙须菜琼胶寡糖的制备方法，其特征在于在步骤2）中，所述振荡发酵培养的条件为：在25～37℃条件下，300r/min振荡发酵培养24～72h。
5.如权利要求1所述一种龙须菜琼胶寡糖的制备方法，其特征在于在步骤3）中，所述发酵液离心的条件为：10000×g离心15min。
6.如权利要求1所述一种龙须菜琼胶寡糖的制备方法，其特征在于在步骤3）中，所述滤膜为卷式有机膜。
说明书 :
一种龙须菜琼胶寡糖及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种寡糖，涉及一种龙须菜琼胶寡糖及其制备方法，该寡糖利用菌株与龙须菜的共培养制备而成，具有抗氧化、防紫外线等生理活性。
背景技术
[0002] 寡糖是指由2～20个相同或不同单糖构成的直链或支链低度聚合糖类物质，又称低聚糖，包括普通寡糖和功能性寡糖两大类。普通寡糖中有人们熟悉的蔗糖、麦芽糖、乳糖等，这些糖可以被机体消化吸收，对肠道有益菌并无生长促进作用，另一类是功能性寡糖，例如果寡糖、低聚木糖、大豆低聚糖、壳寡糖、琼胶寡糖、褐藻胶寡糖等，它们本身不能被机体消化吸收，但具有多种生理活性，在食品、农业等领域有着广阔的市场空间。
[0003] 海藻寡糖近年来被发现具有重要的生理活性，其中来自江篱、石花菜等红藻的琼胶寡糖研究得较为广泛。例如中国专利CN200410024380.9中所主张的琼胶寡糖具有益生元的作用，中国专利CN03138973.2专利中所主张的琼胶低聚糖混合物可用作制备降血糖的药物或者食品添加剂，中国专利CN1171592C专利中所主张的琼胶低聚寡糖具有成纤维细胞生长促进作用以及紫外线氧化损伤保护作用等。
[0004] 但至今琼胶寡糖的应用仍然较少，影响其应用开发的瓶颈因素主要在于制备方法。目前琼胶寡糖的制备过程都是先从江篱、石花菜等红藻中提取出琼胶，然后再用化学法或酶法将琼胶降解为分子量更小的寡糖。例如中国专利CN01115094.7，CN021132573.1，CN03138971.6等分别主张采用不同的化学方法降解琼胶获取低聚糖；中国专利CN03112515.8，CN03112518.2，CN200310114439.9等主张利用天然菌或者基因工程菌所获得的琼胶酶制剂进行琼胶低聚糖的制备等。但是无论是化学法还是酶解法都存在较为严重的缺点，包括：①这些方法都只能作用于琼胶等海藻多糖，而从海藻中提取海藻多糖需经过碱、酸反复处理和反复的水洗，造成了严重的污染和水资源的消耗；②酶解法需先经过酶制剂的大规模制备，然后才能应用于多糖的降解。但是酶制剂的制备对仪器设备的要求高，提高了生产成本，并使整体工艺复杂化；③目前仍然缺乏高效的琼脂酶，导致琼胶寡糖无法得到大规模生产和应用；④化学法生产的琼胶寡糖分子量不均一，产品质量不稳定，难以进行大规模生产。目前仅有美国使用大西洋假单胞菌的琼胶酶制备琼胶低聚糖的产品，但价格昂贵，无法满足开发和生产的要求。
[0005] 我国海藻养殖规模庞大，本发明所涉及的龙须菜是一种江蓠属海藻，也是我国主要的海藻养殖品种之一，其经济价值主要来自于提取琼胶和作为鲍鱼饲料，处于低值化利用阶段。本发明采用菌株与龙须菜共培养的方法，利用微生物所产的酶系直接降解龙须菜得到琼胶寡糖，可解决限制琼胶寡糖应用开发中的上述问题，实现龙须菜的高值化利用。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种龙须菜琼胶寡糖及其制备方法。
[0007] 本发明的第2目的在于提供龙须菜琼胶寡糖在制备抗氧化、抗紫外线保健品和化妆品中的应用。
[0008] 所述龙须菜琼胶寡糖是利用太平洋火色杆菌（Flammeovirga Pacifica）H2与龙须菜共培养，利用菌株所产的酶系直接降解龙须菜获得聚合度为4～8的琼胶寡糖，具有抗氧化、吸收紫外线等生理活性。
[0009] 所述太平洋火色杆菌（Flammeovirga Pacifica）H2由本发明人自行分离得到，并于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2012229，地址为中国武汉大学（邮编430072）。样品的来源为太平洋深海5378m深处的泥样（E157°24′31″，N19°30′30"）。菌株的筛选分离和培养方法为：将深海沉积物2g放入30mL含1%经60～80目过筛的龙须菜粉末的2216E液体培养基中，于4℃中富集。然后将富集液稀释1000倍，涂布于含1%经60～80目过筛的龙须菜粉末的2216E平板上，于16℃培养。将得到的菌株进一步纯化保种，并进行鉴定。
[0010] 本发明所述龙须菜琼胶寡糖的制备方法如下：
[0011] 1）将菌株太平洋火色杆菌（Flammeovirga Pacifica）H2用活化培养基平板进行活化后，接种于种子培养基中，振荡培养得发酵液；
[0012] 2）将步骤1）中得到的发酵液接种入产糖培养基中，继续振荡发酵培养后离心，收集上清液；
[0013] 3）采用膜过滤设备，将上清液依次用0.45μm，0.22μm滤膜，10000～50000D超滤膜和300～600D纳滤膜，所得滤出液即为龙须菜琼胶寡糖。
[0014] 在步骤1）中，所述活化培养基平板可为：含经60～80目过筛后的龙须菜粉末1%，酵母膏0.2%，NaCl3%，琼胶粉1.5%，蒸馏水配制，经121℃，20min灭菌后使用；所述种子培养基可为：含CMC-Na20.5%～1.5%，酵母膏0.2%，NaCl3%，蒸馏水配制，经121℃，20min灭菌后使用；所述振荡培养的条件可为：在25～37℃条件下，250r/min振荡培养至OD600＝1.0～1.5。
[0015] 在步骤2）中，所述产糖培养基可为：含经60～80目过筛的龙须菜粉末1%～5%，MgCl20.1%～0.5%，蒸馏水配制，经121℃，20min灭菌后使用；发酵液的接种比例可为5%；所述振荡发酵培养的条件可为：在25～37℃条件下，300r/min振荡发酵培养24～72h。
[0016] 在步骤3）中，所述发酵液离心的条件可为：10000×g离心15min；所述滤膜可为卷式有机膜。
[0017] 本发明所述龙须菜琼胶寡糖可在制备抗氧化、抗紫外线保健品和化妆品中应用。
[0018] 本发明中所述龙须菜琼胶寡糖制备工艺的优点是：
[0019] 1.采用菌株与龙须菜共培养，利用菌株所产的酶系，一步法直接获得琼胶寡糖。而现有研究报道或专利中所述酶解法制备寡糖均需要多个步骤，主要包括由产琼胶酶菌株发酵制备琼胶酶、由龙须菜等海藻提取琼胶、将琼胶酶与琼胶进行反应以获得寡糖等。本发明中的工艺具有明显的创新性，且工艺简单、无污染、成本低、效率高，具有很好的实用性。
[0020] 2.在产糖培养基中利用低浓度的MgCl2代替发酵中常用的NaCl（浓度一般在1%以上），不仅减少对发酵设备的腐蚀，而且降低了海藻寡糖后续纯化的成本。
[0021] 本发明中所述龙须菜琼胶寡糖的生理活性特征为：
[0022] 具有显著的抗氧化性，包括对CCl4引起的小鼠急性肝损伤，和百草枯造成的果蝇死亡具有明显的保护作用；具有很强的吸收短、中波紫外线的活性。在目前所公开的海藻寡糖相关专利中，CN1843325A所主张的海藻寡糖为褐藻胶寡糖，主要用于化妆品防晒、保湿的活性；CN1843153A所主张的海藻寡糖主要用于饲料添加剂；CN1593433A所主张的琼胶寡糖作为益生元用于动物和人体。因此，本发明中所获得的琼胶寡糖的活性均未见其它研究报道或专利。CN1843325A所主张的海藻寡糖虽然提到具有防晒活性，与紫外吸收活性相关，但该专利所述海藻寡糖为褐藻胶寡糖，并非本发明中所述琼胶寡糖。综上所述，本发明中所制备的琼胶寡糖具有明显的创造性和实用性。
附图说明
[0023] 图1为龙须菜活性寡糖的薄层层析分析。在图1中，M：从上到下依次为分别为Neoagarotetraose，neoagarohexaose和neoagarooctaose标准品；1,2:龙须菜琼胶寡糖。
[0024] 图2为肝脏切片HE染色结果。
[0025] 图3为龙须菜琼胶寡糖全波长扫描图。在图3中，横坐标是波长(nm)，纵坐标为绝对强度Abs。
具体实施方式
[0026] 下面通过实施例对本发明做进一步详细描述，但本发明不仅仅局限于以下实施例。
[0027] 实施例1龙须菜琼胶寡糖的微生物发酵法制备
[0028] 1）将菌株太平洋火色杆菌（Flammeovirga Pacifica）H2用活化培养基（含经60～80目过筛的龙须菜粉末1%，酵母膏0.2%，NaCl3%，琼胶粉1.5%，蒸馏水配制，pH7～8，经
121℃灭菌20min后使用）进行活化后，挑取单菌落接种于种子培养基（含CMC-Na21%，酵母膏
0.2%，NaCl3%，蒸馏水配制，pH7～8，经121℃灭菌20min后使用）中，在30℃的条件下振荡培养至OD600＝1.0；
121℃灭菌20min后使用）进行活化后，挑取单菌落接种于种子培养基（含CMC-Na21%，酵母膏
0.2%，NaCl3%，蒸馏水配制，pH7～8，经121℃灭菌20min后使用）中，在30℃的条件下振荡培养至OD600＝1.0；
[0029] 2）将发酵液按照3%的接种比例加入产糖培养基（含经60～80目过筛的龙须菜粉末3%，MgCl2 0.25%，蒸馏水配制，pH7～8，经121℃灭菌20min后使用）中，继续在30℃条件下振荡发酵培养48h；
[0030] 3）将发酵液经10000×g离心15min，收集上清液；
[0031] 4）采用膜过滤设备，将上清液依次用0.45μm，0.22μm滤膜，30000D超滤膜和300D纳滤膜，所得滤出液即为龙须菜琼胶寡糖；
[0032] 5）用DNS法测定寡糖浓度，于10℃以下温度中保存。
[0033] 所得龙须菜琼胶寡糖成分的薄层层析图参见图1，所制备的寡糖为4～8糖的混合物。
[0034] 以下给出所得龙须菜琼胶寡糖抗氧化生理活性的实验验证。
[0035] 1.龙须菜琼胶寡糖对小鼠四氯化碳急性肝损伤的保护作用
[0036] 小鼠腹腔注射CCl4后，CCl4在肝脏中酶的催化下产生自由基使细胞膜发生脂质过氧化，从而破坏细胞膜结构和功能的完整性，使细胞质内酶类渗入血液中，导致血清酶活性发生改变，同时使细胞发生气球样变和坏死，这一过程可选择性的破坏小叶中央区的肝细胞。
[0037] 动物实验：
[0038] 实验动物及分组：选用健康的雄性、BALB/c小鼠，6~7周大小，体重18~20g。按随机分组的方法将小鼠分为4组，每组3只。第1组为高剂量龙须菜琼胶寡糖给药组，第2组为低剂量龙须菜琼胶寡糖给药组，第3组为空白对照组，第4组为CCl4损伤对照组。
[0039] 给药量及方法：A组灌药量为200mg/(kg.BW)，B组灌药量为150mg/(kg.BW)，C、D组每日灌等量灭菌蒸馏水。各组连续灌7天，7天后对A、B、D组小鼠按1mL/kg体重的用量腹腔注射CCl（4 按照2∶5的比例将CCl4稀释于液体石蜡中），注射48h后眼球取血分离血清，解剖取肝脏进行分析。
[0040] 小鼠观察指标的测定：主要观察指标为小鼠体重、肝重、血清ALT含量和肝脏病理组织检查。小鼠体重在取血前称量，肝重在解剖后进行称量。血清中的ALT含量采用赖氏法进行测定，将血清稀释50倍左右后用ALT试剂盒测得其吸光度值；将得到的赖氏法单位换算回酶单位IU/L，在25℃条件下1卡门氏单位=0.482I U/L。而肝脏病理组织检查采用苏木精-伊红（HE）染色法进行观察，选取小鼠肝脏组织制成石蜡切片后进行HE染色后在电镜下观察。
[0041] 实验结果：
[0042] 通过测量各组小鼠的体重、肝重和血清中ALT结果，得到如表1的数据：
[0043] 表1
[0044]
[0045] 通过对各组小鼠的体重比较可以看到，其中A组200mg/(kg.BW)小鼠体重平均高于其余几组的小鼠体重，而B组150mg/(kg.BW)小鼠的体重平均低于其余组，说明200mg/(kg.BW)浓度的海藻寡糖对小鼠的体重有促进作用，而150mg/(kg.BW)浓度的海藻寡糖对小鼠的体重则有相反的作用。而通过对各组小鼠的肝重比较可以得到类似小鼠体重比较的结果。对各组小鼠血清中ALT结果的比较发现服用了海藻寡糖的实验组小鼠的ALT水平普遍低于CCl4损伤对照组，其中A组200mg/(kg.BW)小鼠的ALT含量基本与空白对照组的水平相一致，而B组150mg/(kg.BW)小鼠ALT含量略高于空白对照组的水平，但也远远低于CCl4损伤对照组。说明海藻寡糖对于CCl4造成的肝损伤有着良好的修复效果。
[0046] 而将各组小鼠的肝脏组织进行石蜡包埋，然后进行HE染色，在电子显微镜下观察后拍照片保存参见图2。根据肝脏切片HE染色结果可以发现，CCl4会造成的肝组织血管周围的细胞损伤，而A组200mg/(kg.BW)小鼠的肝组织血管周围的细胞并无损伤，而B组150mg/(kg.BW)小鼠肝组织血管周围的细胞有损伤，这也解释了B组150mg/(kg.BW)小鼠的体重和肝重较轻的原因，说明150mg/(kg.BW)浓度的海藻寡糖对小鼠的CCl4造成的肝脏损伤修复作用没有200mg/(kg.BW)浓度的好，但是200mg/(kg.BW)浓度的海藻寡糖对小鼠的CCl4造成的肝脏损伤修复作用效果明显。说明海藻寡糖对于CCl4造成的肝损伤有着良好的修复效果。
[0047] 2.以果蝇对百草枯的抗性为模型检测龙须菜琼胶寡糖的抗氧化性[0048] （1）检测方法
[0049] 用邻苯三酚自氧化法测定。用10mM HCl配制0.1mM邻苯三酚，按表2取50mMTris-HCl缓冲液（pH8.0），10mM HCl，龙须菜琼胶寡糖，混匀后在25℃水浴保温20min，取出后立即加入0.4mL 25℃预热过的0.1mM邻苯三酚（总体积3mL），迅速摇匀，倒入比色皿，测定OD325值。
[0050] 表2
[0051]反应体系 Tris-HCl（mL） HCl（mL） 龙须菜琼胶寡糖（mL）
空白 2 1 0
对照 2 0.6 0
A1* 2 0.3 0.3
A2* 2 0.2 0.4
A3* 2 0.1 0.5
空白 2 1 0
对照 2 0.6 0
A1* 2 0.3 0.3
A2* 2 0.2 0.4
A3* 2 0.1 0.5
[0052] *A1寡糖终浓度为170mg/L；A2寡糖终浓度为227mg/L；A3寡糖终浓度为283mg/L。
[0053] （2）实验结果
[0054] 抑制率计算公式：抑制率＝（A对-A处）/A对
[0055] 式中，A对为……，A处为……。
[0056] 表3
[0057]处理 回归方程 R2 △OD/min 抑制率（%）
对照 y=0.0418x+0.002 0.9973 0.0852 0
A1 y=0.0257x+1.1369 0.9874 0.0586 31.22
A2 y=0.0267x+1.1208 0.9938 0.0565 33.69
A3 y=0.0262x+1.4755 0.9981 0.0523 38.62
对照 y=0.0418x+0.002 0.9973 0.0852 0
A1 y=0.0257x+1.1369 0.9874 0.0586 31.22
A2 y=0.0267x+1.1208 0.9938 0.0565 33.69
A3 y=0.0262x+1.4755 0.9981 0.0523 38.62
[0058] 由表3说明：龙须菜琼胶寡糖可以明显减缓邻苯三酚的自氧化作用，抑制率可达30%，且浓度越高抑制作用越强。
[0059] 3.以果蝇对百草枯的抗性为模型检测龙须菜琼胶寡糖抗氧化的实际应用效果[0060] （1）实验方法：取刚羽化的野生型OR果蝇雌、雄各420只，将其雌雄分开饲养，4～7天后进行试验。在平底试管的底部铺设6层滤纸，在每个平底管内加入500μL的处理样品，设置6个实验组（参见表4），每个实验组雌雄各3个重复，每个重复放置20只果蝇。每隔12h记录果蝇的死亡情况。记录108h后果蝇死亡率。
[0061] （2）实验结果：
[0062] 百草枯可作用于细胞的氧化还原反应，在细胞内活化为氧自由基是其毒作用基础，所形成的过量超氧化阴离子自由基（·O2-）及过氧化氢（H2O2）等可引起许多组织器官细胞膜脂质过氧化，从而造成多系统组织器官的损害。龙须菜琼胶寡糖可明显降低果蝇的死亡率，尤其是雌性果蝇，表明龙须菜琼胶寡糖具有清除超氧化物自由基的作用。
[0063] 表4以果蝇为模型检测龙须菜琼胶寡糖的抗氧化性
[0064]处理 雌果蝇死亡率（%） 雄果蝇死亡率（%）
蔗糖 0 1.3
蔗糖+百草枯 90 91.7
蔗糖+寡糖(0.2mg/mL) 0 1.7
蔗糖+寡糖(0.2mg/mL)+百草枯 11.7 75
蔗糖 0 1.3
蔗糖+百草枯 90 91.7
蔗糖+寡糖(0.2mg/mL) 0 1.7
蔗糖+寡糖(0.2mg/mL)+百草枯 11.7 75
[0065] 以下给出所得龙须菜琼胶寡糖吸收紫外线性能的检测实例
[0066] （1）测定方法：使用SHIMADZU公司的UV1800型紫外分光光度仪，将龙须菜琼胶寡糖加入比色皿中，用双蒸水调零，按照如下参数测量：测量模式ABS；扫描范围800～200nm；记录范围-4.000～4.000A；扫描步长0.5nm。
[0067] （2）测定结果：
[0068] 波长在100～400nm之间的辐射在光谱上都属于紫外线范围，因此被称为紫外线辐射，按波长划分，一般分为3种：UVC（短波紫外线），波长为100～280nm；UVB（中波紫外线），波长为280～320nm；UVA（长波紫外线），波长为320～400nm。
[0069] 在这3种紫外线中，UVC被臭氧层阻挡在地表之外。10%甚至更低的UVB辐射可以达到地表，是造成皮肤老化、日晒伤、免疫抑制、DNA损伤和皮肤癌的原因之一。90%以上的UVA辐射可以达到地表，其对皮肤的晒伤性和破坏性强度不如UVB，但可抑制皮肤的免疫系统机能。
[0070] 从图3可知，龙须菜琼胶寡糖在230～310nm范围内的吸收值最高，表明对紫外线中危害最大的UVB具有良好的吸收作用，可用于抗紫外线辐射产品的开发。
[0071] 实施例2
[0072] 与实施例1类似，其区别在于在步骤1）和2）中所述培养温度为25℃，步骤1）中所述种子培养基中CMC-Na2的含量为0.5%，步骤2）中龙须菜粉末为1%，MgCl2含量为0.1%，培养时间为72h。
[0073] 实施例3
[0074] 与实施例1类似，其区别在于在步骤1）和2）中所述培养温度为37℃，步骤1）中所述种子培养基中CMC-Na2的含量为1.5%，步骤2）中龙须菜粉末为5%，MgCl2含量为0.5%，培养时间为24h。
[0075] 实施例4
[0076] 与实施例1类似，其区别在于在步骤1）和2）中所述培养温度为30℃，步骤2）中龙须菜粉末为1%，MgCl2含量为0.1%，培养时间为72h。
[0077] 实施例5
[0078] 与实施例1类似，其区别在于在步骤1）和2）中所述培养温度为25℃，步骤2）中MgCl2含量为0.5%，培养时间为48h。
[0079] 实施例6
[0080] 与实施例1类似，其区别在于在步骤1）和2）中所述培养温度为30℃，步骤1）中所述种子培养基中CMC-Na2的含量为1.5%，步骤2）中龙须菜粉末为2%，MgCl2含量为0.4%，培养时间为48h。
[0081] 实施例7
[0082] 与实施例1类似，其区别在于在步骤1）和2）中所述培养温度为37℃，步骤1）中所述种子培养基中CMC-Na2的含量为0.5%。