梅久兰链霉菌ZW-1菌株及其发酵液的抑菌用途

摘要

本发明是一种梅久兰链霉菌ZW-1菌株及其发酵液的抑菌用途，所抑的菌为：小麦雪腐镰刀菌、小麦赤霉病菌、斑点落叶病菌、油菜菌核病菌、菠菜早疫病菌、玉米圆斑病菌、西瓜枯萎病菌或者棉花枯萎病菌。本发明梅久兰链霉菌ZW-1及其发酵液可抑制植物病原真菌菌丝的生长，导致病原真菌菌丝细胞壁膨大，原生质体浓缩，并可抑制菠菜早疫病菌分生孢子的萌发和芽管的伸长，抑菌效果好，具有良好植物病害生物防治的开发应用前景。

权利要求

1.一种梅久兰链霉菌ZW-1（Streptomyces mediolani strain zw-1）发酵液的抑菌用途，所抑的菌为：小麦雪腐镰刀菌（Fusarium nivale）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、斑点落叶病菌（Alternaria.alternata）、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、菠菜早疫病菌（Alternaria solani）、玉米圆斑病菌（Helminthosporium carbonum）、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)或者棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）。

说明书

梅久兰链霉菌ZW-1菌株及其发酵液的抑菌用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种来自海洋的链霉菌菌株的用途，特别是梅久兰链霉菌ZW-1菌株及其发酵液的抑菌用途。

背景技术

[0002] 生物防治已经成为植物病害防治的重要手段。但目前用于生物防治的微生物菌株多数来自于陆地，而多年来对陆地微生物的筛选，导致筛选到产生新型抗病机制的微生物的几率越来越低，因而越来越多的人们把目光投向了海洋，希望从海洋环境中极具多样性的微生物中开发出新型抗病原菌活性物质，用于植物病害的生物防治。近几年以来，从海洋中寻找微生物新种和具有特殊功能的生理活性物质成为国内外的研究热点，海洋微生物已经成为农用抗生素的新资源。

[0003] 海洋放线菌是海洋微生物中一类特殊的、具有重要经济价值的微生物,据不完全统计, 近年来50%以上新发现的海洋微生物活性物质是由海洋放线菌这个庞大的分类群产生的，许多放线菌的次生代谢产物具有医药和植物保护方面的用途，已广泛用作抗细菌、抗真菌和抗肿瘤药物。目前关于海洋放线菌活性物质的研究已经引起人们的重视，从海洋环境中分离得到了多种产生新活性物质的海洋放线菌，并对得到菌株的发酵条件、生物活性以及活性物质的分离鉴定进行了研究，取得了一定的成果，海洋放线菌对植物病原真菌的抗菌作用研究已有报道，但有关梅久兰链霉菌（Streptomyces mediolani）对植物病原真菌抗菌活性的研究目前尚未见报道。目前随着人们生活水平的提高和对食品安全的重视，一些高毒农药逐步限制使用，防治植物病害需要开发大量无毒的微生物农药，优良微生物菌株的筛选是生物农药研发的基础，而现有的微生物菌株远不能满足微生物农药开发的需求，分离筛选新型抗菌微生物菌株对于微生物农药的开发具有重要意义。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种梅久兰链霉菌ZW-1菌株的新的抑菌用途。

[0005] 本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种梅久兰链霉菌ZW-1（Streptomyces mediolani strain zw-1）及其发酵液的抑菌用途，所抑的菌为：小麦雪腐镰刀菌（Fusarium nivale）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、斑点落叶病菌（Alternaria. alternata）、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、菠菜早疫病菌（Alternaria solani）、玉米圆斑病菌（Helminthosporium carbonum）、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)或者棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）

[0006] 本发明所涉及的生物材料“梅久兰链霉菌ZW-1（Streptomyces mediolani strain zw-1）”菌株已于2011年12月5日在Genebank公开（登录号为：JQ309924.1，网址为：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JQ309924.1。该菌株为公知公用材料，在该专利申请日期起二十年内，公众如果需要，淮海工学院海洋学院实验室可对外提供。

[0007] 本发明中所述的梅久兰链霉菌ZW-1是通过以下方法分离得到：

[0008] （1）分离纯化：从连云港海域的连岛、高公岛采集海水、海泥、近海土样、海洋动、植物样品， 25℃，180r/min富集振荡培养5d；采用稀释平板分离法分离放线菌，三区划线纯化后转接到高氏一号斜面培养基上；

[0009] （2）菌株的筛选：采用平板对峙法，取直径5mm植物病原真菌菌苔置于PDA平板中央，在真菌菌胎四周对称位置，距离平皿边缘15mm处划线接种分离到的海洋放线菌不同菌株，25℃倒置恒温培养，观察真菌菌丝生长情况，5d后测量抑菌带宽度，每个菌株为一处理，以不接放线菌对照，重复3次；选取一株对所述的8种植物病原真菌的抑菌带宽度平均值大于8mm、发酵液的抑菌带宽度高于5mm的菌株，记为ZW-1菌株；

[0010] （3）菌株的鉴定：采用插片法，将ZW-1菌株划线接种到高氏一号培养基平板上，将灭菌的盖玻片以45°角插入划线接种部位的培养基内，28℃条件下分别于培养4、6、8d取出盖玻片，观察菌丝及孢子丝形态特征；同时进行生理生化试验，并进行16S rDNA 测序分析；根据形态学和生理生化试验结果初步认为菌株ZW-1属于链霉菌属（Streptomyces）；16SrDNA的同源性分析表明, ZW-1菌株最接近于Streptomyces mediolani，二者的16S rDNA 序列相似性为99 %，ZW-1菌株为梅久兰链霉菌（Streptomyces mediolani）。

[0011] 本发明中所述的梅久兰链霉菌ZW-1是发明人从连云港海域采集海水海泥、海洋动植物样品，分离纯化具有抗真菌作用的海洋放线菌，并对优良菌株的抗菌作用和种类鉴定进行系统研究，旨在为海洋放线菌用于植物病害的生物防治提供优良菌株和理论依据。下面对本发明进行更为详细的说明。

[0012] 1材料和方法

[0013] 1.1供试植物病原真菌

[0014] 小麦雪腐镰刀菌（Fusarium nivale）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、斑点落叶病菌（Alternaria. alternata）、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、菠菜早疫病菌（Alternaria solani）、玉米圆斑病菌（Helminthosporium carbonum）、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)或者棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）由中国农科院植物保护研究所土传病害实验室提供，由淮海工学院海洋学院实验室保存。

[0015] 1.2培养基

[0016] 植物病原真菌活化及抑菌试验培养基：PDA培养基。

[0017] 样品的富集和放线菌分离培养基：海水高氏一号液体培养基。

[0018] 淀粉培养基：可溶性淀粉2g、酵母粉0.5g、蛋白胨0.5g、琼脂2g，海水100ml。 [0019] 1.3海洋放线菌的分离与纯化

[0020] 从连云港海域的连岛、高公岛等地采集海水、海泥、近海土样、海洋动、植物样品，25℃，180r/min富集振荡培养5d。采用稀释平板分离法分离放线菌，三区划线纯化后转接到高氏一号斜面培养基上。

[0021] 1.4 海洋放线菌对植物病原真菌菌丝生长的抑制作用

[0022] 采用平板对峙法。取直径5mm植物病原真菌菌苔置于PDA平板中央，在真菌菌胎四周对称位置，距离平皿边缘15mm处划线接种分离到的海洋放线菌不同菌株，25℃倒置恒温培养，观察真菌菌丝生长情况，5d后测量抑菌带宽度。以不接放线菌对照，3次重复。

[0023] 1.5 放线菌无菌发酵液对真菌的抑制作用

[0024] 无菌发酵液的制备：有抑菌活性的放线菌不同菌株培养5d，用5ml无菌水洗下菌苔，摇匀制成菌悬液，取3ml菌悬液接种到装有60ml高氏一号培养液的250ml三角瓶中，25℃，180r/min振荡培养5d，培养液于4℃，5000r/min条件下离心10min，上清液用孔径为
0.22μm的细菌过滤器过滤，即得到不同海洋放线菌菌株的无菌发酵液。

[0025] 无菌发酵液对真菌的抑制作用：用打孔器打取直径为5mm真菌菌苔并倒扣接在PDA平板中央，距皿边缘15mm处，四周对称放置直径为5mm的牛津杯，每个牛津杯内加入250μl放线菌不同菌株的无菌发酵液，以等量的高氏1号液体培养基为对照， 25℃恒温培养4d，测定抑菌带宽度，每处理重复3次。

[0026] 1.6 无菌发酵液对菠菜早疫病菌分生孢子萌发的抑制作用

[0027] 用5mL无菌水洗下培养5 d的菠菜早疫病菌的菌落，用4层无菌纱布过滤除去菌丝，滤液在室温，4000 r/min下离心10min ，沉淀即为分生孢子，用制备好的放线菌无菌发6
酵液配制孢子悬浮液，浓度为10 个孢子/mL，取20μL孢子悬浮液滴加在无菌载玻片上，置于铺有湿润滤纸的培养皿内，28℃下恒温保湿培养，分别于2，4，6，8，10h观察菠菜早疫病菌的孢子萌发和芽管伸长情况。

[0028] 1.6 抗菌海洋放线菌的种类鉴定

[0029] 1.6.1形态学观察

[0030] 采用插片法。具有较强抑菌作用的海洋放线菌划线接种到高氏一号培养基平板上，将灭菌的盖玻片以45°角插入划线接种部位的培养基内， 28℃条件下分别于培养4、6、8d取出盖玻片，观察放线菌菌丝及孢子丝形态特征。

[0031] 1.6. 2生理生化试验

[0032] 使用生化鉴定管，对分离得到的抑菌活性强的放线菌菌株，按照文献的方法测定生理生化特性。

[0033] 1.6.3 放线菌16SrDNA序列分析

[0034] 放线菌基因组DNA的提取采用CTAB裂解法[17]。 扩增引物为细菌通用引物，正向引物为27f：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3′，反向引物为1492R：5′-ACGGTTACCTTACCTTGTTACGACTT -3′，由上海生工生物技术有限公司合成。 PCR扩增条件为94℃预变性 4min，94℃变性 50s，52℃退火50s，72℃延伸1min30s，循环数35，72℃延伸 10min。PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测回收纯化，送上海生工生物工程技术有限公司测序，得到的16SrDNA序列输入NCBI数据库，应用BLAST与数据库中已有的放线菌16S rDNA序列进行相似性比较分析，采用DNAStar与Mega软件进行序列的比较及系统发育树分析。

[0035] 2结果与分析

[0036] 2.1 抗菌海洋放线菌的分离筛选结果

[0037] 从采集的17个样品中分离得到22株海洋放线菌，有9个菌株对供试的植物病原真菌具有较强的抑菌活性。其中Zw-1菌株的抑制活性最强，该菌株对供试的8种植物病原真菌均具有较强的抑制作用，菌株的抑菌带宽度均在8mm以上，结果见表1。

[0038] 表1 Zw-1菌株及其发酵液对8种植物病原真菌的抗菌作用

[0039]

[0040] Zw-1菌株对玉米圆斑病菌的抑制作用最强，抑菌带宽度达13.33mm；其次为小麦雪腐镰刀菌、西瓜枯萎病菌和小麦赤霉病菌，抑菌带宽度分别为13.00mm、11.67mm和11.33mm，对斑点落叶病菌、菠菜早疫病菌的抑菌作用较弱，抑菌带宽度分别为9.33mm和
8.00mm，结果见表1。

[0041] 2.2海洋放线菌Zw-1菌株发酵液的抑菌作用测定结果

[0042] ZW-1菌株发酵液对供试的8种植物病原真菌表现了较强的抑菌作用，抑菌带宽度均在5mm以上。对玉米圆斑病菌的抑制作用最强，抑菌带宽度为12.66mm，其次是西瓜枯萎病菌，抑菌带宽度为10.33mm，对菠菜早疫病菌的抑制作用较弱，抑菌带宽度为5.33mm。发酵液的抑菌作用低于菌株对峙培养的抑菌作用，结果见表1。

[0043] 2.3海洋放线菌Zw-1菌株对病原真菌菌丝形态的影响

[0044] ZW-1菌株对供试的几种植物病原真菌的菌丝具有破坏作用，导致病原真菌菌丝畸形，菌丝体内原生质浓缩，细胞内原生质形成多个小球，生长点断裂。而对照菌丝形态饱满，细胞壁光滑，菌丝内细胞质均匀透明。

[0045] 2.4海洋放线菌Zw-1菌株发酵液对菠菜早疫病菌分生孢子萌发的抑制作用 [0046] ZW-1的无菌发酵液对病菠菜早疫病菌的孢子萌发具有明显的抑制作用处理2 h后，对照的孢子萌发率达到11.5%，用ZW-1发酵液处理完的的孢子尚未萌发。随着处理时间的延长，孢子萌发率逐渐增加，对照的增加较快，10 h以后萌发率达到94.5%，处理的孢子萌发率为80.1%，10 h的抑制率分别为14.4%，结果见表2。

[0047] 表2 ZW-1菌株发酵液对菠菜早疫病菌分生孢子萌发的抑制作用

[0048]

[0049] ZW-1的无菌发酵液对病菠菜早疫病菌的芽管伸长有明显的抑制作用，处理2 h，对照的孢子芽管长度为3.13μm，随着处理时间的延长，芽管长度逐渐增长，对照的孢子芽管增长较快，10 h以后达到385μm，处理的孢子芽管长度仅为96μm，抑制率达75%，结果见表3。

[0050] 表3 ZW-1菌株发酵液对菠菜早疫病菌分生孢子萌发芽管伸长的抑制作用 [0051]

[0052] 2.5海洋放线菌Zw-1菌株的鉴定结果

[0053] 2.5.1 形态学观察

[0054] 菌株Zw-1在高氏1号培养基上菌落为白色，无色素，干燥致密，呈绒布状，菌丝生长旺盛，在PDA培养基上菌落黄粉红色带淡米色，气丝粉状或略絮状，基丝橙黄色。取插片经镜检，菌株Zw-1的菌丝分枝较多，孢子丝为波曲型，孢子丝成熟后形成的孢子链成串珠状。

[0055] 2.5.2生理生化试验

[0056] 生理生化试验结果表明，Zw-1菌株能利用D-葡萄糖、麦芽糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-果糖、 D-甘露醇、甘露糖以及纤维二糖，不能利用乳糖、蔗糖、棉子糖、肌醇。明胶液化，牛奶不凝固但胨化，分解尿素、淀粉、纤维素和油脂，硝酸盐还原。不产生类黑色素、H2S和苯丙氨酸脱氨酶，结果见表4。

[0057] 表4菌株Zw-1的生理生化特性试验项目 结果 试验项目 结果油脂水解试验 + 苯丙氨酸脱氨酶试验 -
尿素酶试验 + 产黑色素试验 -
淀粉水解试验 + 纤维素分解试验 +
柠檬酸盐试验 - 石蕊牛奶试验 不凝固，胨化
葡萄糖 + D-木糖 +
麦芽糖 + L-鼠李糖 +
乳糖 - 纤维二糖 +
蔗糖 - D-甘露醇 +
甘露糖 + 肌醇 -
D-果糖 + D-山梨醇 -
棉子糖 - 硫化氢试验 -

[0058] 根据形态、培养特征观察及生理生化试验结果，查阅《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版和《链霉菌鉴定手册》等相关文献，放线菌Zw-1菌株符合链霉菌科链霉菌属的特征。

[0059] 2.5.3 海洋放线菌Zw-1菌株16SrDNA序列扩增和系统发育分析