一种预防及治疗瘢痕的疫苗及制备方法

摘要

本发明涉及一种预防及治疗瘢痕的疫苗及制备方法，该疫苗由编码人白细胞介素10（human interlenkin 10,hIL-10）基因、胶原特异结合的多肽CBD基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)在基因水平融合后构成。经Balb/C小鼠伤口愈合模型试验证实，该疫苗在一定时间内能够持续诱导小鼠合成分泌hIL-10-CBD。分泌的hIL-10-CBD蛋白能够与伤口愈合过程中细胞产生的胶原蛋白特异结合，既可以降低疫苗量、毒副作用及治疗成本，又能够在瘢痕部位特异有效地发挥药理作用，从而阻止了胞外基质的过度沉积而造成的纤维化，达到了预防及治疗瘢痕的形成，改善瘢痕外观的疗效。本发明通过基因工程手段把人白细胞介素10（human interlenkin 10，hIL-10）与胶原特异结合的CBD多肽在基因水平融合与真核表达载体pcDNA3.1(+)在基因水平融合后组成。

权利要求

1.序列如SEQ ID:1所示的hIL-10-CBD重组基因在制备用于预防或治疗瘢痕的基因药物中的应用。

说明书

一种预防及治疗瘢痕的疫苗及制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种疫苗，特别是一种预防及治疗瘢痕的疫苗及制备方法，属于医药领域。

背景技术

[0002] 白细胞介素10（IL-10）是多种细胞产生的重要免疫调节细胞因子，具有广泛的生物学活性，包括免疫抑制、抗炎及免疫调节特性，主要生物学功能是限制和终止炎症反应，调节多种免疫细胞的分化和增殖。体内外和动物实验表明IL-10在炎症、恶变和自身免疫性疾病方面都发挥了重要功能。在临床上应用于治疗急、慢性炎症疾病、自身免疫性疾病如炎性肠炎、类风湿性关节炎、克隆病、多发性硬化症、银屑病等。

[0003] IL-10作为一种炎症反应调节抑制因子，具有：①调整炎症细胞的募集和分化，减少前炎症细胞因子的分泌；②减少胞外基质（ECM）的产生，上调蛋白水解酶（如基质金属酶）增加ECM的降解；③下调TGF-β1的活性及表达，拮抗瘢痕增生的作用。Renovo公司利用重组hIL-10作为治疗瘢痕增生，改善瘢痕外观的候选药物已进入III期临床研究，但存在着缺乏对病理部位的特异性、用药次数多、时间长及纯化工艺繁杂等缺点。 [0004] 胶原蛋白过度沉积是瘢痕组织的重要特征，而CBD多肽（TKKTLRT，7肽）是能够特异结合胶原蛋白的多肽序列。将编码人hIL-10基因、CBD基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)在基因水平融合，构建了预防和治疗瘢痕的核酸疫苗。经Balb/C小鼠伤口愈合模型试验证实，该疫苗在一定时间内能够诱导小鼠合成分泌 hIL-10-CBD，分泌的hIL-10-CBD蛋白能够与伤口愈合过程中细胞产生的胶原蛋白特异结合，既可以降低疫苗量及治疗成本，又能够在瘢痕部位有效地发挥药理作用，从而达到预防及治疗瘢痕的形成，改善瘢痕外观的疗效。 发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种预防及治疗瘢痕的疫苗及制备方法，该疫苗是一种核酸疫苗，是由编码人白细胞介素10（human interlenkin 10,hIL-10）基因、胶原特异结合的多肽CBD基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)在基因水平融合后构成。经Balb/C小鼠伤口愈合模型试验证实，该疫苗在一定时间内能够诱导小鼠合成分泌hIL-10-CBD，分泌的hIL-10-CBD蛋白能够与伤口愈合过程中细胞产生的胶原蛋白特异结合，从而阻止了胞外基质的过度沉积而造成的纤维化。该疫苗用于预防及治疗瘢痕的形成，改善瘢痕的外观的作用。

[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种预防及治疗瘢痕的疫苗，其特征是：它是由编码人白细胞介素10基因、胶原特异结合的多肽CBD基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)在基因水平融合后构成，其中，编码人白细胞介素10基因简称hIL-10基因；融合后的hIL-10-CBD重组基因的核酸序列No1：

[0007] 5’atgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcacccagtctgagaacagctgcacccacttcccaggcaacctgcctaacatgcttcgagatctccgagatgccttcagcagagtgaagactttctttcaaatgaaggatcagctggacaacttgttgttaaaggagtccttgctggaggactttaagggttacctgggttgccaagccttgtctgagatgatccagttttacctggaggaggtgatgccccaagctgagaaccaagacccagacatcaaggcgcatgtgaactccctgggggagaacctgaagaccctcaggctgaggctacggcgctgtcatcgatttcttccctgtgaaaacaagagcaaggccgtggagcaggtgaagaatgcctttaataagctccaagagaaaggcatctacaaagccatgagtgagtttgacatcttcatcaactacatagaagcctacatgacaatgaagatacgaaacggtggtggtggttctaccaagaagac c ctccgcacc3’，其中3’，5’分别代表重组核酸链的3’，5’端。

[0008] 所述的hIL-10基因，其相应的核酸序列No2：

[0009] 5’atgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcacccagtctgagaacagctgcacccacttcccaggcaacctgcctaacatgcttcgagatctccgagatgccttcagcagagtgaagactttctttcaaatgaaggatcagctggacaacttgttgttaaaggagtccttgctggaggactttaagggttacctgggttgccaagccttgtctgagatgatccagttttacctggaggaggtgatgccccaagctgagaaccaagacccagacatcaaggcgcatgtgaactccctgggggagaacctgaagaccctcaggctgaggctacggcgctgtcatcgatttcttccctgtgaaaacaagagcaaggccgtggagcaggtgaagaatgcctttaataagctccaagagaaaggcatctacaaagccatgagtgagtttgacatcttcatcaactacatagaagcctacatgacaatgaagatacgaaac3’

[0010] 其中，3’,5’分别代表核酸链的3’,5’端。

[0011] 所述胶原特异结合的多肽CBD基因，其核酸序列No3：

[0012] 5’accaagaagaccctccgcacc3’，其中3’,5’分别代表核酸链的3’,5’端。 [0013] 所述的融合后的hIL-10-CBD重组基因在制备用于预防或治疗瘢痕的疫苗中的应用。

[0014] 本发明与现有技术相比，本发明通过基因工程手段把人白细胞介素10（human interlenkin 10，hIL-10）与胶原特异结合的CBD多肽在基因水平融合与真核表达载体pcDNA3.1(+)在基因水平融合后组成。经Balb/C伤口愈合模型试验证实，该疫苗在一定时间内能够持续诱导小鼠合成分泌hIL-10-CBD，分泌的hIL-10-CBD能够与伤口愈合过程中产生的胶原特异结合，既可以降低疫苗的用量、减少毒副作用，同时更为重要的是该疫苗能够特异地在瘢痕部位发挥药理作用，最大程度地预防及治疗瘢痕的形成，改善瘢痕的外观。 附图说明

[0015] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细说明，但不作为对本发明的限定： [0016] 图1是愈合切口及愈合组织中胶原分布（A-C为疫苗治疗组；D-F为空白对照组；箭头示意创缘大小）。

具体实施方式

[0017] 本发明通过基因工程手段把人白细胞介素10（human interlenkin 10，hIL-10）基因与胶原特异结合多肽CBD在基因水平融合后的重组基因hIL-10-CBD核酸序列。所述的hIL-10基因，其相应的核酸序列No2：

[0018] 5’atgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcacccagtctgagaacagctgcacccacttcccaggcaacctgcctaacatgcttcgagatctccgagatgccttcagcagagtgaagactttctttcaaatgaaggatcagctggacaacttgttgttaaaggagtccttgctggaggactttaagggttacctgggttgccaagccttgtctgagatgatccagttttacctggaggaggtgatgccccaagctgagaaccaagacccagacatcaaggcgcatgtgaactccctgggggagaacctgaagaccctcaggctgaggctacggcgctgtcatcgatttcttccctgtgaaaacaagagcaaggccgtggagcaggtgaagaatgcctttaataagctccaagagaaaggcatctacaaagccatgagtgagtttgacatcttcatcaactacatagaagcctacatgacaatgaagatacgaaac3’

[0019] 其中，3’,5’分别代表核酸链的3’,5’端。

[0020] 所述胶原蛋白特异结合多肽CBD（TKKTLRT，7肽），其核酸序列No3： [0021] 5’accaagaagaccctccgcacc3’，其中3’,5’分别代表核酸链的3’,5’端。 [0022] 融合后的hIL-10-CBD重组基因的核酸序列No1：

[0023] 5’atgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcacccagtctgagaacagctgcacccacttcccaggcaacctgcctaacatgcttcgagatctccgagatgccttcagcagagtgaagactttctttcaaatgaaggatcagctggacaacttgttgttaaaggagtccttgctggaggactttaagggttacctgggttgccaagccttgtctgagatgatccagttttacctggaggaggtgatgccccaagctgagaaccaagacccagacatcaaggcgcatgtgaactccctgggggagaacctgaagaccctcaggctgaggctacggcgctgtcatcgatttcttccctgtgaaaacaagagcaaggccgtggagcaggtgaagaatgcctttaataagctccaagagaaaggcatctacaaagccatgagtgagtttgacatcttcatcaactacatagaagcctacatgacaatgaagatacgaaacggtggtggtggttctaccaagaagacc ctccgcacc3’

[0024] 其中，3’,5’分别代表重组核酸链的3’,5’端。

[0025] 所述的融合后的hIL-10-CBD重组基因真核表达载体在制备用于预防或治疗瘢痕疫苗中的应用。

[0026] 实施例1：hIL-10-CBD重组基因的获得

[0027] （一）hIL-10cDNA的获得

[0028] 1.总RNA的提取

[0029] 人外周血经淋巴细胞分离液分离单个核细胞,PBS洗涤2次，重悬于10%RPMI 1640培养液，加入终浓度为10g/l的ConA，置5%CO2培养箱，37℃培养48h，收集细胞。参照RNA抽提试剂盒的方法，抽提总RNA，-80℃保存备用。

[0030] 2.总RNA的提取及hIL-10cDNA的扩增

[0031] 用Takara公司RNA提取及反转试剂盒，按说明抽提总RNA，进行RT-PCR反应：总RNA 500ng，5×逆转录Buffer2μl，oligo dT 0.5μl，6mer 0.5μl，AMV逆转录酶0.5μl，DEPC水加至10μl。37℃温育30min，后85℃温育3min，得cDNA。

[0032] （二）载体的构建及鉴定

[0033] 1.pMD18-T克隆载体的构建

[0034] 按真核细胞惯用密码子设计含CBD基因序列、相应的酶切位点（NheI/EcoRI）以及linker(G4S)的碱基序列，合成如下2条引物Pf、Pr。

[0035] 所述胶原蛋白特异结合多肽CBD（TKKTLRT，7肽），其核酸序列No3： [0036] 5’accaagaagaccctccgcacc3’；

[0037] 引入的linker(G4S)核酸序列No4：5’ggtggtggtggtagc3’；

[0038] Pf：5’gctagcatgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcac3’(77mer,5’-3’)

[0039] Pr:5’gaattctcaggtgcggagggtcttcttggtgctaccaccaccaccgtttcgtatcttcattgtc3’(64mer,5’-3’)

[0040] 以Pf、Pr为引物，以cDNA为模板，随之按95℃30s，58℃30s，72℃1min，30个循环后72℃进行延伸12min，得到PCR产物，产物回收连入pMD18-T载体，进行酶切鉴定和序列测定，得到pMD18T-hIL10-CBD重组克隆载体。

[0041] 2.pcDNA-hIL10-CBD真核表达载体的构建

[0042] 测序正确的pMD18T-IL10-CBD重组克隆载体及原核pcDNA3.1(+)表达载体，分别经NheI/EcoRI双酶切，回收目的片段进行连接，连接产物转化DH5α，挑取克隆，同样回收质粒，酶切鉴定，进一步经核酸测序鉴定，构建成pcDNA-hIL10-CBD真核表达载体，即本专利所述的核酸疫苗。

[0043] 实施例2：核酸疫苗的制备及质量标准控制

[0044] （一）疫苗的制备

[0045] 1．疫苗的扩增

[0046] 上述pcDNA-hIL10-CBD/DH5α菌接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养7-8h，次日以2%的接种量接种到同样的培养基中，继续在37℃过夜培养。 [0047] 2．疫苗的制备

[0048] 按照北京康为生物技术有限公司生产的“金牌超量无内毒素质粒大提试剂盒”使用说明操作。制备提取无内毒素的质粒－即核酸疫苗，具体操作步骤如下： [0049] ①取150ml过夜培养的菌液，加入离心管中，10000rpm离心2-3min收集细菌，尽量吸弃全部上清。

[0050] ②向菌体沉淀的离心管中加入12ml Buffer P1使用移液器或振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀。

[0051] ③向离心管中加入12ml Buffer P2，温和地上下颠倒混匀6-8次，使菌体充分裂解，室温放置3-5min。此时溶液应变得清亮粘稠。

[0052] ④向离心管中加入12ml Buffer E3，立即上下颠倒混匀6-8次，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5min。10000rpm离心10min。将上清全部倒入除内毒素过滤器中，滤液收集在洁净的50ml离心管中。

[0053] ⑤向滤液中加入11ml异丙醇，上下颠倒混匀。将混合液转移到平衡好的吸附柱中（向已装入收集管中的吸附柱加入2ml Buffer PS，10000rpm离心2min即可）。6000-10000rpm离心2min，弃收集管中的废液。

[0054] ⑥向吸附柱中加入10ml Buffer PW，6000-10000rpm离心2min，弃收集管中的废液，重复操作1次。

[0055] ⑦将吸附柱重新放回收集管中，10000rpm离心5min，弃废液，将吸附柱置于室温干燥10min。

[0056] ⑧将吸附柱置于一个新的收集管中，向吸附膜的中间部位加入1-3mlEndo-free Bufer EB，室温放置2-5min，10000rpm离心5min，将质粒溶液收集到收集管中。 [0057] （二）制备疫苗的质量控制

[0058] 1.疫苗的纯度及含量测定

[0059] 取纯化好的疫苗溶液5μl，加入95μl纯水（即按20倍稀释）。应用DU800Nucleic acid/Protein analyzer，利用软件中的程序测定分析稀释样品中疫苗DNA在波长260nm、280nm、320nm的OD值，分析测定出稀释样品中疫苗DNA的纯度（260nm/280nm）及浓度含量，并计算出所制备疫苗的浓度（μg/ml）。

[0060] 2.疫苗的质量标准

[0061] 样品中疫苗溶液的浓度应≥500μg/ml，260nm/280nm的比值在1.8左右。 [0062] 实施例3：Balb/C小鼠伤口愈合模型的建立

[0063] （一）Balb/C小鼠伤口愈合模型的建立

[0064] 1.Balb/C小鼠的预处理及第一次疫苗的注射

[0065] 7周龄，18只Balb/C雄性小鼠，利用电推剪及强效脱毛膏去除背部软毛，均分为3组。在小鼠背部正中用印度墨水画出0.4cm×1cm长方形区域。24h后沿区域两侧皮下分别注射：①空白对照组注射50μl体积的生理盐水；②阴性对照组注射50μg/50μl（用生理盐水稀释制备的空载体pcDNA3.1(+)）的pcDNA3.1(+)空载体；③实验组注射50μg/50μl（用生理盐水稀释制备的核酸疫苗pcDNA3.1-hIL10-CBD）的核酸疫苗。

[0066] 2.小鼠伤口的制备及再次疫苗的注射

[0067] 24h后，全层切除小鼠背部画出的0.4cm×1cm区域，伤口暂时应用无菌油纱包扎。三天后打开包扎伤口的油纱，露出创面，同上再次分别注射相同剂量的生理盐水、空载体及疫苗。分别于7，14，21，28d采集伤口处组织及血清样品。

[0068] （二）小鼠伤口愈合过程中hIL-10的测定

[0069] 血清样品应用新博盛生物技术有限公司“人IL-10 ELISA试剂盒”说明书测定。测定后IL-10标准品的标准曲线方程为y=42.04x-5.23(r＝0.9863)，按说明书测定样品的OD450nm值，并根据曲线方程计算出核酸疫苗的浓度，如表1所示。

[0070] 表1疫苗治疗后小鼠血清中hIL-10的产生及变化(ng/ml)

[0071]

[0072] 实施例4：疫苗抑制瘢痕增生试验

[0073] （一）伤口愈合过程中胶原沉积的变化

[0074] 全层切除切口愈合28d后，切取愈合的瘢痕全皮组织，固定于4%的多聚甲醛溶液中固定，常规方法制备石蜡切片。进行H＆E及胶原三色染色，观察愈合的切口及其组织周缘的胶原分布。结果表明：核酸疫苗组愈合的切口创缘明显小于对照组愈合的切口（图1A,1D）；切口创缘真皮组织中胶原排列较对照组整齐有序（图1C,1F）。 [0075] （二）伤口外观的变化

[0076] 愈合28d后，应用疫苗治疗组小鼠切口愈合处的瘢痕面积小于空白对照组中小鼠切口愈合处的瘢痕面积；愈合处瘢痕的外观也优于空白对照组愈合处瘢痕的外观。 [0077] 序列表：

[0078] 序列号No1：融合后的hIL-10-CBD重组基因的核酸序列

[0079] 5’atgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcacccagtctgagaacagctgcacccacttcccaggcaacctgcctaacatgcttcgagatctccgagatgccttcagcagagtgaagactttctttcaaatgaaggatcagctggacaacttgttgttaaaggagtccttgctggaggactttaagggttacctgggttgccaagccttgtctgagatgatccagttttacctggaggaggtgatgccccaagctgagaaccaagacccagacatcaaggcgcatgtgaactccctgggggagaacctgaagaccctcaggctgaggctacggcgctgtcatcgatttcttccctgtgaaaacaagagcaaggccgtggagcaggtgaagaatgcctttaataagctccaagagaaaggcatctacaaagccatgagtgagtttgacatcttcatcaactacatagaagcctacatgacaatgaagatacgaaacggtggtggtggttctaccaagaagacc ctccgcacc3’，其中3’，5’分别代表重组核酸链的3’，5’端。

[0080] 序列号No2：hIL-10基因的核酸序列

[0081] 5’atgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcacc cagtctgagaacagctgcacccacttcccaggcaacctgcctaacatgcttcgagatctccgagatgccttcagcagagtgaagactttctttcaaatgaaggatcagctggacaacttgttgttaaaggagtccttgctggaggactttaagggttacctgggttgccaagccttgtctgagatgatccagttttacctggaggaggtgatgccccaagctgagaaccaagacccagacatcaaggcgcatgtgaactccctgggggagaacctgaagaccctcaggctgaggctacggcgctgtcatcgatttcttccctgtgaaaacaagagcaaggccgtggagcaggtgaagaatgcctttaataagctccaagagaaaggcatctacaaagccatgagtgagtttgacatcttcatcaactacatagaagcctacatgacaatgaagatacgaaac3’序列号No3：胶原特异结合的多肽CBD基因的核酸序列 [0082] 5’accaagaagaccctccgcacc3’

[0083] 序列号No4：引入的linker(G4S)核酸序列

[0084] 5’ggtggtggtggtagc3’；

[0085] Pf：5’gctagcatgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcac3’(77mer,5’-3’)

[0086] Pr:5’gaattctcaggtgcggagggtcttcttggtgctaccaccaccaccgtttcgtatcttcattgtc3’(64mer,5’-3’)。