鲍鱼内脏多糖替代血清在细胞培养基中的应用转让专利
申请号 : CN201210351833.3
文献号 : CN102839149B
文献日 : 2013-11-13
发明人 : 王玉明 , 武风娟 , 薛勇 , 李兆杰 , 王静凤 , 常耀光 , 徐杰 , 唐庆娟 , 薛长湖
申请人 : 中国海洋大学
摘要 :
本发明涉及一种鲍鱼内脏多糖代替血清在细胞培养基中的应用，在细胞培养基中该鲍鱼内脏多糖可以代替部分血清，且能维持细胞的正常生长，无毒副作用。
权利要求 :
1.一种鲍鱼多糖替代血清在细胞培养基中的应用，该鲍鱼内脏多糖组成成分包括鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖，所述的鲍鱼内脏多糖主链结构中含有→3)-β-D-GlcpA-(1→4)-α-L-Rhap-(3SO4)-(1→，→3)-β-D-GlcpA-(1→4)-α-L-Rhap-(2SO4)-(1→两种结构单元，两种单元数量比例2:1；
所述的鲍鱼内脏多糖在细胞培养基中替代部分血清；
所述的鲍鱼内脏多糖的制备方法：将干鲍鱼内脏磨粉，加入0.1M pH6.0乙酸钠缓冲溶液、0.1倍样品质量的木瓜蛋白酶、5mM EDTA溶液和5mM半胱氨酸溶液，于60℃水浴下搅拌反应24h之后，反应混合物离心获得上清液，即鲍鱼内脏酶解液，随后向上清液中加入终浓度为10％的阴离子表面活性剂溶液，室温下放置24小时后，离心，弃上清，沉淀溶解于3MNaCl和乙醇以体积比为100：15的混合溶液中，再加入2倍体积的95％乙醇溶液，4℃放置24小时，离心，沉淀用80％和95％乙醇洗2-3次，最后将沉淀于60℃干燥2小时，蒸馏水溶解，用透析袋透析并脱盐，浓缩，冻干，得鲍鱼内脏粗多糖；随后鲍鱼内脏粗多糖经过DEAE-52阴离子交换层析和S-200凝胶过滤层析进行分离纯化，得到的物质即为所述鲍鱼内脏多糖。
说明书 :
鲍鱼内脏多糖替代血清在细胞培养基中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于天然高分子领域，具体地涉及鲍鱼内脏多糖替代血清在细胞培养基中的应用。
背景技术
[0002] 鲍鱼(Haliotis spp.)属软体动物门，腹足纲，原始腹足目，鲍科，鲍属，为藻食性动物，是我国传统的海珍品，其氨基酸含量全面、脂肪和胆固醇的含量很低，具有较高的营养价值和药用价值。鲍鱼内脏占鲍鱼总重的15~25%，作为鲍鱼加工过程中的副产物，利用价值极低，亟待开发其高值化利用方法，提高经济价值，促进鲍鱼养殖行业的良性持续发展。
[0003] 鲍鱼内脏多糖是鲍鱼内脏的主要组成部分，其结构受鲍鱼种类和生长环境而有所不同。近年来，有研究报道从大连产鲍鱼内脏中提取的鲍鱼内脏多糖其具有抗肿瘤，提高机体免疫力，抗氧化等多种生理活性；而从青岛产鲍鱼内脏中提取的鲍鱼内脏多糖具有改善四氯化碳致急性肝损伤大鼠的肝功能等活性。
[0004] 伴随着动物细胞培养和人工脏器工学的发展，培养基的质量要求越来越高。而大多数动物细胞的培养离不开血清，目前培养基中使用的血清主要来源于小牛或胎牛，不仅价格昂贵，而且其成分复杂，含有激素类物质，易受到细菌、霉菌、支原体和病毒等的污染，特别是近年来动物源性疾病，如疯牛病、口蹄疫等病毒性疾病的问题越来越严重，，因此血清成为细胞培养工学和人工脏器工学发展的瓶颈，急需一种安全可靠的血清替代物，以解决上述问题。本发明涉及到一种来源于鲍鱼内脏的多糖，其替代血清用于细胞培养，为血清替代物及组织工学研究提供新的思路。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是在于需要提供一种用于替代血清的活性物质，其在保证不影响细胞的正常生长的条件下，不会带来任何不良作用，从而弥补现有技术上的不足。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种鲍鱼内脏多糖替代血清在细胞培养基中应用，鲍鱼内脏多糖可替代血清保证细胞的正常生长，对细胞生长无不良作用。
[0007] 所述的鲍鱼内脏多糖组成成分包括鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖，所述的鲍鱼内脏多糖主链结构中含有→3)-β-D-GlcpA-(1→4)-α-L-Rhap-(3SO4)-(1→，→3)-β-D-GlcpA-(1→4)-α-L-Rhap-(2SO4)-(1→两种结构单元，两种单元数量比例为2:1。
[0008] 进一步，所述的鲍鱼内脏多糖在细胞培养基中替代部分血清。
附图说明
[0009] 附图1细胞计数法测定鲍鱼内脏多糖对总细胞个数的影响。
[0010] 附图2MTT法测定鲍鱼内脏多糖对细胞存活率的影响：a鲍鱼内脏多糖加样24h后对细胞存活率的影响；b鲍鱼内脏多糖加样48h后对细胞存活率的影响，c鲍鱼内脏多糖加样72h后对细胞存活率的影响，其中柱状图上的*表示与正常组相比差异显著。
[0011] 附图3不同鲍鱼内脏多糖浓度梯度添加对替代血清的影响：a鲍鱼内脏多糖浓度梯度添加24h后对替代血清的影响；b鲍鱼内脏多糖浓度梯度添加48h后对替代血清的影响，其中柱状图上的#表示与10%血清组相比，差异显著；*表示与2%血清组相比，差异显著；
[0012] 附图4血清及鲍鱼内脏多醣梯度添加对替代血清的影响
具体实施方式
[0013] 下面通过实施例结合附图来详细说明本发明的实施方式。但本发明的技术方案不受实施例任何形式的限制。
[0014] 实施例1鲍鱼内脏多糖的制备
[0015] 将干鲍鱼内脏磨粉，加入0.1M乙酸钠缓冲溶液（pH6.0）、0.1倍样品质量的木瓜蛋白酶、5mM EDTA溶液和5mM半胱氨酸溶液，于60℃水浴下搅拌反应24h之后，反应混合物离心获得上清液，即鲍鱼内脏酶解液，随后向上清液中加入终浓度为10％的阴离子表面活性剂溶液，室温下放置24小时后，离心，弃上清，沉淀溶解于3MNaCl和乙醇以体积比为100：15的混合溶液中，再加入2倍体积的95％乙醇溶液，4℃放置24小时，离心，沉淀用80％和
95％乙醇洗2-3次，最后将沉淀于60℃干燥2小时，蒸馏水溶解，用透析袋透析并脱盐，浓缩，冻干，得鲍鱼内脏粗多糖；随后鲍鱼内脏粗多糖经过DEAE-52阴离子交换层析和S-200凝胶过滤层析进行分离纯化，得到的物质即为所述鲍鱼内脏多糖。
95％乙醇洗2-3次，最后将沉淀于60℃干燥2小时，蒸馏水溶解，用透析袋透析并脱盐，浓缩，冻干，得鲍鱼内脏粗多糖；随后鲍鱼内脏粗多糖经过DEAE-52阴离子交换层析和S-200凝胶过滤层析进行分离纯化，得到的物质即为所述鲍鱼内脏多糖。
[0016] 通过化学分析和光谱分析确定本发明中的鲍鱼内脏脏多糖成成分包括鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖，所述鲍鱼内脏多糖主链有→3)-β-D-GlcpA-(1→4)-α-L-Rhap-(3SO4)-(1→，→3)-β-D-GlcpA-(1→4)-α-L-Rhap-(2SO4)-(1→两种结构单元，两种结构单元数量比例为2:1
[0017] 实施例2鲍鱼内脏多糖对HepG2细胞的增殖作用
[0018] （1）细胞计数
[0019] 将处于对数生长期的HepG2细胞，用RPMI-1640完全培养基（含10%新生牛血清）4 -1
制成密度为5×10 个·mL 的细胞悬液，接种于96孔培养板内，100μL/孔。待24h贴壁-1 -1 -1 -1
后加入200μL/孔的浓度分别为50μg·mL ，100μg·mL ，200μg·mL 和400μg·mL多糖的培养液，每个浓度设4个复孔。空白对照组加等量不含多糖的完全培养基。在37、
5%CO2条件下培养24h后，用IX-51型倒置荧光显微镜计数。
制成密度为5×10 个·mL 的细胞悬液，接种于96孔培养板内，100μL/孔。待24h贴壁-1 -1 -1 -1
后加入200μL/孔的浓度分别为50μg·mL ，100μg·mL ，200μg·mL 和400μg·mL多糖的培养液，每个浓度设4个复孔。空白对照组加等量不含多糖的完全培养基。在37、
5%CO2条件下培养24h后，用IX-51型倒置荧光显微镜计数。
[0020] （2）MTT法测定
[0021] 将处于对数生长期的HepG2细胞，用RPMI–1640完全培养基（含10%新生牛血清）4 -1
制成密度为2×10 个·mL 的细胞悬液，接种于96孔培养板内，100μL/孔。待24h贴壁-1
后更换成浓度分别为50、100、200和400μg·mL 多糖的完全培养基，每个浓度设4个复孔，200μL/孔。空白对照组加等量不含多糖的完全培养基。37℃、5%CO2条件下分别培养-1
24h、48h和72h后，弃去培养基，加入MTT液（PBS液配制，终浓度为0.5mg·mL ）。继续培养4h后，吸去上清液，加入酸化异丙醇，吹打至蓝色结晶物完全溶解，酶标仪测570nm各孔吸光度（A）。MTT/%=A570(样品组)/A570(空白对照组)×100%。
制成密度为2×10 个·mL 的细胞悬液，接种于96孔培养板内，100μL/孔。待24h贴壁-1
后更换成浓度分别为50、100、200和400μg·mL 多糖的完全培养基，每个浓度设4个复孔，200μL/孔。空白对照组加等量不含多糖的完全培养基。37℃、5%CO2条件下分别培养-1
24h、48h和72h后，弃去培养基，加入MTT液（PBS液配制，终浓度为0.5mg·mL ）。继续培养4h后，吸去上清液，加入酸化异丙醇，吹打至蓝色结晶物完全溶解，酶标仪测570nm各孔吸光度（A）。MTT/%=A570(样品组)/A570(空白对照组)×100%。
[0022] （3）数据统计
[0023] 实验数据利用SPSS 17.0统计软件进行处理，各组数据均以平均值±标准差（M±SD）表示，多组之间的比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示有统计学差异。
[0024] （4）实验结果
[0025] 结果见图1和图2a、2b、2c，细胞计数显示，鲍鱼内脏多糖组的总细胞个数明显高于空白对照组；MTT数据也表明鲍鱼内脏多糖处理组细胞存活率显著高于对照组，两组数据均且呈现一定的剂量-效应关系，说明其对细胞的正常生长无副作用，且具有一定的细胞增殖效果。
[0026] 实施例3不同鲍鱼内脏多糖浓度梯度添加对替代血清的影响
[0027] （1）实验方法
[0028] 细胞布板方式如实施例1。待24h贴壁后更换为含2%血清，浓度分别为50、20和-110μg·mL 鲍鱼内脏多糖的培养液，每个浓度设4个复孔，200μL/孔。分别以加等量含
10%血清的完全培养基组为空白对照组，加等量的含2%血清浓度的培养基组作为模型组。
37℃、5% CO2条件下分别培养24h和48h，测定各组细胞存活率。
10%血清的完全培养基组为空白对照组，加等量的含2%血清浓度的培养基组作为模型组。
37℃、5% CO2条件下分别培养24h和48h，测定各组细胞存活率。
[0029] （2）数据统计
[0030] 实验数据利用SPSS 17.0统计软件进行处理，各组数据均以平均值±标准差（M±SD）表示，多组之间的比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示有统计学差异。
[0031] （3）实验结果
[0032] 结果见图3a、3b，2%血清处理组细胞存活率低于正常组，加入鲍鱼内脏多糖后，细-1胞存活率均呈现显著的增加，且呈现显著的剂量-效应关系。当多糖浓度降低到10μg·mL时，仍表现出促细胞增殖活性，增殖效率接近于正常组。以上结果显示，在含2%牛血清培养-1
基中，鲍鱼内脏多糖在10μg·mL 添加量时细胞生长和增殖与10%血清相当，可替代8%牛血清。
基中，鲍鱼内脏多糖在10μg·mL 添加量时细胞生长和增殖与10%血清相当，可替代8%牛血清。
[0033] 实施例4血清及多糖梯度添加对替代血清的影响
[0034] （1）实验方法
[0035] 细胞布板方式如实施例1。待24h贴壁后更换为含2%、4%、6%和8%血清且对应多-1糖含量分别为10、8、6、4μg·mL 的培养液，每个浓度设4个复孔，200μL/孔。分别以加等量含10%血清的完全培养基组和对应血清含量组为空白对照组。37℃、5%CO2条件下分别培养48h，测定各组细胞存活率。
[0036] （2）数据统计
[0037] 实验数据利用SPSS 17.0统计软件进行处理，各组数据均以平均值±标准差（M±SD）表示，多组之间的比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示有统计学差异。
[0038] （3）实验结果
[0039] 结果见图4，与10%血清处理组相比，单纯的血清梯度递减的细胞存活率呈现梯度-1减小的趋势，但鲍鱼内脏多糖在10、8、6、4μg·mL 添加量，血清含量分别为2%、4%、6%和8%-1
时细胞生长和增殖与10%血清相当，细胞生长恢复正常。说明10、8、6、4μg·mL 的鲍鱼内脏多糖分别可以替代8%、6%、4%和2%的血清，用于细胞培养。
时细胞生长和增殖与10%血清相当，细胞生长恢复正常。说明10、8、6、4μg·mL 的鲍鱼内脏多糖分别可以替代8%、6%、4%和2%的血清，用于细胞培养。
[0040] 所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。
[0041] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。