一种鉴定大葱中与CMS相关的线粒体基因的分子标记转让专利
申请号 : CN201210365130.6
文献号 : CN102839220B
文献日 : 2014-08-13
发明人 : 王永勤 , 王婵 , 李洪有
申请人 : 北京市农林科学院
摘要 :
本发明提供一种鉴定大葱中与细胞质雄性不育（CMS）相关的线粒体基因的分子标记，及该分子标记的制备方法和使用方法；所述的与细胞质雄性不育（CMS）相关的线粒体基因的分子标记的核苷酸序列如序列表中SEQNo：1所示；用于扩增所述分子标记的引物的核苷酸序列如序列表中SEQNo：2和SEQ No：3所示。本发明将大葱中与细胞质雄性不育（CMS）相关的线粒体基因的AFLP分子标记转化为SCAR分子标记，所以可以快速检测大量样品，结果稳定性好，重现性高，操作简便；本发明中的SCAR标记可以检测该实验的所有品种，即8个不育系品种、8保持系品种以及4个杂交品种，该标记适用范围广泛，可以方便地鉴定大葱细胞质类型，辅助分子育种的发展。
权利要求 :
1.一种大葱中与细胞质雄性不育相关的线粒体基因的分子标记的检测方法，其特征在于：所述的与细胞质雄性不育相关的线粒体基因的分子标记的核苷酸序列如 序列表中SEQ No：1所示；
该检测方法的步骤包括：
A、提取被检测的大葱的总DNA；
B、以所述的被检测的大葱的总DNA作为模板进行PCR扩增反应，得到扩增产物；
C、判断所述的扩增产物中是否存在所述的与细胞质雄性不育相关的线粒体基因的分子标记；
B步骤中PCR扩增反应的引物的核苷酸序列如序列表中 SEQ No：2和SEQ No：3所示。
2.根据权利要求1所述的分子标记的检测方法，其特征在于：B步骤中PCR扩增反应的体系为20μl，包括有：
2+
10×Buffer：2μl，该Buffer中含有Mg ；
dNTPs：1.6μl；
核苷酸序列如核苷酸序列如序列表中SEQ No：2所示的上游引物：1μl；
核苷酸序列如核苷酸序列如序列表中SEQ No：3所示的下游引物：1μl；
Taq酶：0.2μl；
模板：2μl；
ddH2O：补至20μl。
3.根据权利要求1所述的分子标记的检测方法，其特征在于：B步骤中PCR扩增反应的程序为：第一步：94℃，预变性5min；第二步：94℃， 变性30s；
第三步：50℃ ，退火 45s；第四步：72℃ 延伸 90s，第二步至第四步共40个循环；第五步，
72℃，最后延伸10min；第六步：4℃保存。
说明书 :
一种鉴定大葱中与CMS相关的线粒体基因的分子标记
技术领域
[0001] 本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种鉴定大葱中与细胞质雄性不育（CMS）相关的线粒体基因的分子标记，及该分子标记的制备方法和使用方法。
背景技术
[0002] 细胞质雄性不育（Cytoplasmic male sterility，CMS）属于母系遗传，不能产生可育花粉。目前已经在300多种植物中发现了细胞质雄性不育现象，并且广泛用于杂交制种。迄今为止，所报道的与CMS相关的基因大多数都位于线粒体基因组中，而且这些基因通常是发生重排，包括移位、插入与缺失。
[0003] 大葱(Allium fistulosum L.)是亚洲东部广泛栽培的重要蔬菜作物之一。张启沛等最早报道了国内大葱雄性不育（Zhang Q P,Wei YY,Zhang Q.1987.Male sterility of welsh onion(Allium fistulosum L.)in a natural population.Journal of Shandong Agricultural University,18,1-10.(in Chinese)）。相关研究表明大葱雄性不育是由细胞质和核基因共同控制的（Mouse T,Uehara T.1985b.Inheritance of cytoplasmic male sterility in Allium fistulosum L.Journal of Japanese Society for Horticultural Science,53:423-437）。由于大葱是两年生植物以及传统育种方法的复杂性，所以发展分子标记来辅助育种至关重要。
[0004] 目前，分子标记在葱属植物（如：洋葱A.cepa,.、细香葱A.schoenoprasum、韭葱A.ampeloprasum)中已经取得较大进展。最初，育种工作者以线粒体基因作为探针，利用RFLP(restriction fragment length polymorphism)技术来鉴定细胞质类型（de Courcel et al.1989;Holford et al.1991;Havey 1993;Havey and Leite 1999;Engelka and Tatlioglu2000）。虽然RFLP方法明显快于杂交育种，但是它仍然需要很长的时间来完成育种，这主要是因为从植株中分离出大量完整的DNA、用限制性内切酶消化DNA以及杂交都比较困难。因此，PCR（polymerase chain reaction）成为一个很好的选择，可以方便快速地区分单株植物的细胞质类型。Havey于1995年提出N型细胞质的叶绿体基因间隔区中存在100bp的插入，因此在该类型的细胞质中扩增出了较大的片段（Havey MJ1995 Identification of cytoplasms using the polymerase chain reaction to aid in the extraction of maintainer lines from open-pollinated populations of onion.Theor Appl Genet,90:263–268）；1998年Sato Y揭示了在S型细胞质cob基因的上游区域插入了一段叶绿体DNA序列（Sato Y.(1998).PCR amplification of CMS-specific mitochondrial nucleotide sequences to identify cytoplasmic genotypes of onion(Allium cepa L.).Theoretical and Applied Genetics,96,367-370）；紧接着Engelke等人于2002、
2003年从细香葱中提出了一个新的PCR标记——orfA501（Engelke T,Tatlioglu T(2002)A PCR-marker for the CMS1 inducing cytoplasm in chives derived from recombination events affecting the mitochondrial gene atp9.Theor Appl Genet,104:698–702；
Engelke T,Terefe D,Tatlioglu T.(2003)A PCR-based marker system monitoring CMS-(S),CMS-(T)and(N)-cytoplasm in the onion(Allium cepa L.).Theoretical and Applied Genetics,107,162-167）；2009年，Sunggil Kim等设计了一个依赖于ofr725及cox1的PCR分子标记，从而区分洋葱的三种细胞质类型（Sunggil Kim,Eul-Tai Lee,Dong Youn Cho,et al(2009)Identi Wcation of a novel chimeric gene,orf725,and its use in development of a molecular marker for distinguishing among three cytoplasm types in onion(Allium cepa L.)Theor Appl Genet,118:433–441）。然而，迄今为止国内外有关大葱雄性不育分子标记的研究报道还很少，盖树鹏等发展了一个SCAR标记和一个RAPD标记，用来区分大葱N型和S型细胞质（Gai S P,Meng X D(2010).Application of Molecular Markers Linking to Cytoplasmic Male Sterile Loci to Assist Maintainer Line Selection and Their Selection Efficiency in Welsh Onion(Allium fistulosum L.).Agricultural Sciences in China,9(11):1571-1576）。在该报道中，虽然RAPD标记可以鉴定多个品种的细胞质类型，但是由于其引物为随机引物，结果具有不稳定性；该SCAR标记SCS13虽然稳定可靠，但是只能鉴定4个大葱品种，具有一定的局限性。
2003年从细香葱中提出了一个新的PCR标记——orfA501（Engelke T,Tatlioglu T(2002)A PCR-marker for the CMS1 inducing cytoplasm in chives derived from recombination events affecting the mitochondrial gene atp9.Theor Appl Genet,104:698–702；
Engelke T,Terefe D,Tatlioglu T.(2003)A PCR-based marker system monitoring CMS-(S),CMS-(T)and(N)-cytoplasm in the onion(Allium cepa L.).Theoretical and Applied Genetics,107,162-167）；2009年，Sunggil Kim等设计了一个依赖于ofr725及cox1的PCR分子标记，从而区分洋葱的三种细胞质类型（Sunggil Kim,Eul-Tai Lee,Dong Youn Cho,et al(2009)Identi Wcation of a novel chimeric gene,orf725,and its use in development of a molecular marker for distinguishing among three cytoplasm types in onion(Allium cepa L.)Theor Appl Genet,118:433–441）。然而，迄今为止国内外有关大葱雄性不育分子标记的研究报道还很少，盖树鹏等发展了一个SCAR标记和一个RAPD标记，用来区分大葱N型和S型细胞质（Gai S P,Meng X D(2010).Application of Molecular Markers Linking to Cytoplasmic Male Sterile Loci to Assist Maintainer Line Selection and Their Selection Efficiency in Welsh Onion(Allium fistulosum L.).Agricultural Sciences in China,9(11):1571-1576）。在该报道中，虽然RAPD标记可以鉴定多个品种的细胞质类型，但是由于其引物为随机引物，结果具有不稳定性；该SCAR标记SCS13虽然稳定可靠，但是只能鉴定4个大葱品种，具有一定的局限性。
[0005] AFLP（Amplified fragment length polymorphism）是近年来发展起来的最有效的分子标记之一，它结合了RFLP和RAPD技术并且克服了二者的不足之处（Vos P,Hoigers R,Bleeker M,Reijans M,Van De Lee T,Hornes M,Frijters A,Pot J,Peleman J,Kuiper M(1995)AFLP:a new concept for DNA fingerprinting.Nucleic Acids Res23:4407-4414）。然而，AFLP也存在着一些局限性，这主要是因为它费时费力，成本高，显性遗传。因此，育种工作者迫切地将AFLP标记转化成简单的PCR分子标记。
[0006] 序列特异性扩增区(Sequence-characterized Amplified Region，SCAR）标记是在RAPD技术基础上发展起来的。SCAR标记是将目标RAPD片段进行克隆并对其末端测序，根据RAPD片段两端序列设计特异引物，对基因DNA片段再进行PCR特异扩增，把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来。SCAR标记是共显性遗传，待检DNA间的差异可直接通过有无扩增产物来显示。SCAR标记方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高。已经报道的鉴定大葱细胞质类型的SCAR分子标记只有一个，即上文中的SCS13，但该标记检测的大葱品种有限，不能广泛地应用于多个品种大葱细胞质类型的检测中。
[0007] 因此，在科研和实践中，故需要一种适用品种广泛、检测结果稳定、操作简便易行的鉴定大葱中与CMS相关的线粒体基因的分子标记，用于辅助分子育种。
发明内容
[0008] 本发明提供一种鉴定大葱中与细胞质雄性不育（CMS）相关的线粒体基因的分子标记，及该分子标记的制备方法和使用方法；所述的与细胞质雄性不育（CMS）相关的线粒体基因的分子标记的核苷酸序列如序列表中SEQNo：1所示。
[0009] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0010] 一种鉴定大葱中与细胞质雄性不育相关的线粒体基因的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如序列表中SEQ No：1所示。
[0011] 进一步地，用于扩增所述分子标记的引物的核苷酸序列如序列表中SEQ No：2和SEQ No：3所示。
[0012] 一种重组表达载体、一种转基因细胞系、一种宿主菌，均含所述的与细胞质雄性不育（CMS）相关的线粒体基因的分子标记。
[0013] 本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的：
[0014] 一种鉴定大葱中与细胞质雄性不育相关的线粒体基因的分子标记的制备方法，所述的的分子标记的核苷酸序列如序列表中SEQ No：1所示；
[0015] 该制备方法的步骤包括：
[0016] A、进行大葱线粒体基因组提取，得到大葱雄性不育系线粒体DNA（mtDNA）和大葱保持系线粒体DNA（mtDNA）；
[0017] B、将所述的大葱雄性不育系线粒体DNA（mtDNA）和大葱保持系线粒体DNA（mtDNA）进行AFLP分析，得到与细胞质雄性不育相关的AFLP条带；
[0018] C、将所述的与细胞质雄性不育相关的AFLP条带进行分离、回收、克隆、测序、分析，得到与细胞质雄性不育相关的AFLP标记；
[0019] D、将所述的细胞质雄性不育相关的AFLP标记进行转化处理，得到细胞质雄性不育相关的SCAR分子标记，即为所述的与细胞质雄性不育（CMS）相关的线粒体基因（mtDNA）的分子标记。
[0020] 本发明的目的是通过以下又一技术方案实现的：
[0021] 一种鉴定大葱中与细胞质雄性不育相关的线粒体基因的分子标记的检测方法，所述的与细胞质雄性不育相关的线粒体基因的分子标记的核苷酸序列如序列表中SEQ No：1所示；
[0022] 该检测方法的步骤包括：
[0023] A、提取被检测的大葱的总DNA；
[0024] B、以所述的被检测的大葱的总DNA作为模板进行PCR扩增反应，得到扩增产物；
[0025] C、判断所述的扩增产物中是否存在所述的与细胞质雄性不育相关的线粒体基因的分子标记。
[0026] 进一步地，B步骤中PCR扩增反应的引物的核苷酸序列如序列表中SEQ No：2和SEQ No：3所示。
[0027] 进一步地，B步骤中PCR扩增反应的体系为20μl，包括有：10×Buffer（含有Mg2+）：2μl；dNTPs：1.6μl；
[0028] 核苷酸序列如序列表中SEQ No：1所示的分子标记的上游引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ No：2所示：1μl；
[0029] 核苷酸序列如SEQ No：1所示的分子标记的下游引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ No：3所示：1μl；
[0030] Taq酶：0.2μl；模板：2μl；ddH2O：补至20μl。
[0031] 进一步地，B步骤中PCR扩增反应的程序为：第一步：94℃，预变性5min；第二步：94℃，变性30s；第三步：50℃，退火45s；第四步：72℃延伸90s，第二步至第四步共40个循环；第五步，72℃，最后延伸10min；第六步：4℃保存。
[0032] 本发明相比现有技术具有以下有益效果：
[0033] 1、本发明将大葱中与细胞质雄性不育（CMS）相关的线粒体基因的AFLP分子标记转化为SCAR分子标记，所以可以快速检测大量样品，结果稳定性好，重现性高，操作简便。
[0034] 2、本发明中的SCAR标记可以检测该实验的所有品种，即8个不育系品种、8保持系品种以及4个杂交品种，该标记适用范围广泛，可以方便地鉴定大葱细胞质类型，辅助分子育种的发展。
附图说明
[0035] 图1为实施例1中大葱样本AFLP分析聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
[0036] 图2为实施例1中片段k1与k2的核苷酸序列比对图。
[0037] 图3为实施例1中大葱样本的SCAR标记检测电泳图。
[0038] 图4为实施例2中被检测大葱的SCAR标记检测电泳图。
具体实施方式
[0039] 实施例1：
[0040] 本实施例为一种鉴定大葱中与细胞质雄性不育（CMS）相关的线粒体基因的分子标记及其制备方法。
[0041] 一种鉴定大葱中与CMS相关的线粒体基因的分子标记，所述的与CMS相关的线粒体基因的分子标记的核苷酸序列如序列表中SEQ No：1所示。
[0042] 用于扩增所述的与CMS相关的线粒体基因分子标记的引物的核苷酸序列如序列表中SEQ No：2和SEQ No：3所示。
[0043] 一种重组表达载体、一种转基因细胞系、一种宿主菌，均含所述的与CMS相关的线粒体基因的分子标记。
[0044] 一种鉴定大葱中与CMS相关的线粒体基因的分子标记的制备方法，所述的与CMS相关的线粒体基因的分子标记的核苷酸序列如SEQ No：1所示；该制备方法的步骤包括：
[0045] A、大葱线粒体基因组提取：
[0046] 选取大葱不育系和大葱保持系，采用蔗糖沉淀差速离心法分别进行mtDNA提取处理，得到大葱雄性不育系mtDNA和大葱保持系mtDNA；
[0047] 所述的mtDNA提取处理的步骤为：
[0048] a.从上述品种的大葱中取新鲜的葱白30-80g，优选为50g；
[0049] b.向上述的葱白中加入五倍的预冷的缓冲液A（0.5mol/L蔗糖、50mmol/LTris-Cl、20mmol/L EDTA、0.1％BSA、10mmo 1/L巯基乙醇，pH 8.0)，再用榨汁机破碎组织，纱布过滤，得到滤液，再分装到50ml的离心管中；
[0050] c.将所述的滤液进行离心处理，离心力为1500g，时间为10min，取上清液a；
[0051] d.将所述的上清液a进行离心处理，离心力为2600g，时间为10min，取上清b；
[0052] e.将所述的上清液b进行离心处理，离心力为13000g，时间为15min，弃上清，得到粗线粒体沉淀；
[0053] f.向所述的粗线粒体沉淀中加入预冷的10ml缓冲液B(0.5mol/L蔗糖、50mmol/LTris-Cl,pH7.5)，悬浮沉淀后进行离心处理，离心力为800g，时间为10min，得到上清c；
[0054] g.在所述的上清c中加入500μl 1M的MgCl和1.5μl DNaseI，冰浴2h，EDTA终止反应，得到反应液；
[0055] h.将所述的反应液小心地转入盛有25ml缓冲液C(0.6mol/L蔗糖、10mmol/L Tris-Cl、20mmol/LEDTA)的离心管中，进行离心处理，离心力为13000g，时间为20min，收集沉淀即为较纯的线粒体；
[0056] i.将所述的较纯的线粒体进行裂解处理，DNA提取处理，得到大葱mtDNA；
[0057] 所述的大葱mtDNA分为大葱雄性不育系mtDNA和大葱保持系mtDNA。
[0058] 本实施例的大葱样本为：所述的大葱雄性不育系（4-6A、64A、58A1、58A2、23-24A）及相应的大葱保持系（1-3B、63B、57B、19-22B），由北京市农林科学院蔬菜研究中心提供。
[0059] B、将所述的大葱雄性不育系mtDNA和大葱保持系mtDNA进行AFLP分析，得到与CMS相关的AFLP条带；
[0060] a.将所述的不育系mtDNA和大葱保持系mtDNA选用EcoRI/MseI进行酶切处理，得到酶切产物，然后与相应的接头进行连接处理，得到连接产物；
[0061] 所述的酶切处理和连接处理在同一反应体系中进行；该反应体系为20μl，包括有：11μl ddH2O,2μl 10xNBE Buffer2,0.4μl ATP（10mM）,0.4μl EcoRI接 头 ,0.4μl MseI接头,0.25μl EcoRI(10U/μl),0.25μl MseI(10U/μl),0.2μlT4DNA ligase（400U/μl），0.1μl 100xBSA,5μl DNA模版（5μl总共达到250ng）；该反应体系的反应程序为：先于37℃进行酶切处理5h，再于16℃进行连接6h，得到连接产物；
[0062] b.将所述的连接产物进行预扩增反应，得到预扩增产物；所述的预扩增选用的引物为：两条末端各有1个选择性核苷酸，
[0063] 上游引物：3-GTAGACTGCGTACCAATTCA-5，
[0064] 下游引物：3-GACGATGAGTCCTGAGTAAC-5；
[0065] 该预扩 增反应 体系为 20μl，包括 有：5μl连接 产物，2μl 10xBufer，2+
1.6μldNTPs，1.2μl Mg ,0.6μl EA00,0.6μl MC00，0.2μl Taq酶，8.8μl ddH2O；
1.6μldNTPs，1.2μl Mg ,0.6μl EA00,0.6μl MC00，0.2μl Taq酶，8.8μl ddH2O；
[0066] 所述的预扩增反应的程序为：72℃预变性2min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共29个循环；72℃最后延伸10min；4℃保存；
[0067] c.将所述的预扩增产物进行扩增反应，得到扩增产物；所述的扩增反应选用的引物为：两个末端各含有3个选择性核苷酸（EANN和MCNN），共有256对；
[0068] 以上的256对引物由以下A组、B组各16条核苷酸序列全排列而成：
[0069]
[0070]
[0071] d.对所述的扩增产物进行电泳检测和显影处理，得到与CMS相关的AFLP条带；所述的电泳检测为6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（75W，2h），所述的显影处理采用银染法；
[0072] AFLP分析表明:共有65条多态性条带，这些条带的大小范围是50-700bp；从图1中可以看出：用引物组合Eaac/Mcat扩增后，有2个AFLP条带与CMS相关，命名为k1和k2，并且k1只出现在雄性不育植株中；k1、k2均为与所述的CMS相关的AFLP条带。图1：与雄性不育密切相关的AFLP标记（Eaac/Mcat）；4-6A,64A,58A1.58A2,23-24A为不育系；其他的为可育系；箭头表示多态性条带，并命名为k1、k2；
[0073] C、将所述的与CMS相关的AFLP条带进行分离、回收、克隆、测序、分析，得到与CMS相关的AFLP标记；
[0074] 具体的操作为：
[0075] a.分离：将所述的CMS相关的AFLP条带（k1和k2）从PAGE胶上切下，置于含有50μl蒸馏水的0.2mL离心管中，95℃温育30min，并自然冷却至室温，离心处理后取5μl上清作为PCR模板，进行扩增反应，得到扩增产物；
[0076] b.回收：将该扩增产物进行电泳检测，所述的电泳检测为1%琼脂糖凝胶电泳；将检测后的扩增产物进行回收纯化处理，得到纯化产物；所述的回收纯化处理采用胶回收试剂盒（全氏金），具体的步骤参照该试剂盒的说明书进行；
[0077] c.将所述的纯化产物克隆至pGM-T载体，再转化至感受态E．coli DH5α中，在含100mg/L氨苄（Amp）的LB平板上于37℃进行过夜培养，得到转化平板；从该转化平板上挑取单菌落，进行菌落PCR反应，筛选出重组质粒；再将所述的重组质粒进行测序、分析，得到与CMS相关的AFLP标记；所述的测序由上海生工生物工程技术服务有限公司进行；
[0078] 上述分析方法为：在美国国家生物技术信息中心（Genbank）网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)对上述k1、k2片段进行比对，再用DNAMAN软件比较二者之间的同源性。
[0079] k1也可以叫做Eaac/Mcat302，表示为用引物EAAC和MCAT扩增出的大小为302bp的多态性片段；同样k2也可以叫做Eaac/Mcat297。用DNAMAN软件对测序结果进行分析发现：二者的相似性为98.35%。图2中，方框里的序列为引物序列；椭圆框中为插入位点；下划线1为洋葱cox1基因的同源序列；下划线2为未知序列。从图2可以看出：k1为302bp，k2为297bp；k1中存在5bp的插入位点（ATTGA），并且为短的重复序列。
[0080] 将这两个序列在GenBank中进行比对，发现这两个序列中有140bp（下划线1与洋葱cox1基因同源，且插入位点位于cox1基因的3’非编码区；方框内是引物序列，而下划线2的序列为未知序列。
[0081] D、将所述的CMS相关的AFLP标记进行转化处理，得到CMS相关的SCAR分子标记，即为所述的与CMS相关的线粒体基因的分子标记。
[0082] 为了更方便地将所述的与CMS相关的AFLP标记用于杂交育种研究当中，应当将AFLP标记转化成了SCAR标记；由于上述两个片段的部分序列与洋葱cox1基因序列同源，因此根据NCBI中洋葱cox1基因序列以及k1、k2序列，设计了SCAR标记的引物。
[0083] 上游引物cox1F（核苷酸序列如序列表中SEQ No：2所示）设在cox1基因的起始密码子处，下游引物302R（核苷酸序列如序列表中SEQ No：3所示）设在上述k1片段插入位点处。由于该插入位点与其前面的序列为重复序列，故下游引物设计比较困难，考虑到这一因素，设计了下游引物302R，成功地将AFLP标记转化为SCAR标记，记为SCAR1，即为所述的与CMS相关的线粒体基因的分子标记（核苷酸序列如SEQ No：1所示）。
[0084] 具体的操作为：
[0085] a.以所述的大葱雄性不育系mtDNA和大葱可育系mtDNA为模板，利用所述的上游引物cox1F（5-ATGCCACTTCTCCTTCCTCA-3，SEQ No：2所示）、下游引物302R（5-TCTTCTGTTAGGTTCTTATC-3，SEQ No：3所示）进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；
[0086] 该PCR扩 增 反应 的 体 系为 20μl，包 括 有：2μl 10xBufer（含有 Mg2+），1.6μldNTPs,1μlCox1F引物，1μl 302R引物，0.2μlTaq酶，2μl模板，ddH2O补至20μl；
[0087] 该PCR扩增反应的程序为：94℃预变性5min；94℃变形30s，50℃退火45s，72℃延伸90s，共40个循环；72℃最后延伸10min；4℃保存。
[0088] b.取该PCR扩增产物5μL进行电泳检测，该电泳检测为在1.0%琼脂糖凝胶上水平电泳，恒定电压110V，时间为35min，用凝胶成像系统观察并拍照；该电泳检测的结果如图3所示，泳道M：Marker2k；泳道1-9分别为4-6A、1-3B、64A、63B、58A1、58A2、57B、23-24A、19-22B；其中1、3、5、6、8为不育系，其余的为保持系。
[0089] 在不育系中能扩增出1646bp大小的条带，而保持系中并没有此条带，而且该条带大小与预期的大小一致；为了进一步确定，将该条带回收、克隆后测序发现：该条带的核苷酸序列与洋葱cox1基因序列基本相同。因此说AFLP标记（k1片段）成功地转化为SCAR标记SCAR1，即为所述的与CMS相关的线粒体基因的分子标记（核苷酸序列如SEQ No：1所示）。
[0090] 实施例2：
[0091] 本实施例为所述的与CMS相关的线粒体基因的分子标记在鉴定大葱细胞质类型中的应用。
[0092] 为了检测所述的与CMS相关的线粒体基因的分子标记的可靠性，本实施例选育了4对不育系与保持系（分别选自章丘大葱、鞭杆葱、五叶齐、冬灵白）以及4个日本引进的杂交品种（天光一本、山本晚抽F1、寿峰F1、光剑F1）作为被检测的大葱。
[0093] 该检测方法的步骤包括：
[0094] A、取新鲜的大葱的叶片，采用CTAB法进行大葱DNA的提取，得到被检测的大葱的总DNA；
[0095] 所述的大葱总DNA提取处理的步骤为：
[0096] a.从上述品种的大葱中取叶片0.05-0.2g，优选为0.1g放入研钵中，加入1mlCTAB缓冲液，快速研磨，分装到离心管中，65℃水浴1h，期间定时摇动，得到研磨物；
[0097] b.将所述的研磨物冷却后，进行离心处理，转速为12000rpm，时间为10min，得到上清液d；
[0098] c.取所述的上清液d转移至离心管中，加入等体积的Tris酚/氯仿/异戊醇（体积比25：24：1），温和振动，进行离心处理，转速为12000rpm，时间为10min，得到上清液e；
[0099] d.取所述的上清液e，加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），进行离心处理，转速为12000rpm，时间为10min，得到上清液f；
[0100] e.取所述的上清液f，加入等体积的异丙醇，混匀后于-20℃沉淀4-12小时，离心后弃上清，保留沉淀a；
[0101] f.在所述的沉淀a中加入预冷的75%乙醇，洗涤一次，离心后弃上清，得到沉淀b，再通风橱中风干，得到风干后的沉淀b；
[0102] g.将所述的风干后的沉淀b溶解于30-50μl ddH2O，得到所述的被检测的大葱的总DNA；
[0103] B、以所述的被检测的大葱的总DNA作为模板进行PCR扩增反应，得到扩增产物；
[0104] 该PCR扩增反应的引物为：
[0105] 上游引物cox 1F（5-ATGCCACTTCTCCTTCCTCA-3，序列表中SEQ No：2所示），[0106] 下游引物302R（5-TCTTCTGTTAGGTTCTTATC-3，序列表中SEQ No：3所示）；
[0107] 该PCR扩增反 应的体系 为20μl，包括 有：2μl 10xBuffer（含有 Mg2+），1.6μldNTPs，1μlCox1F引物，1μl 302R引物，0.2μlTaq酶，2μl模板，ddH2O补至20μl；
[0108] 该PCR扩增反应的程序为：第一步：94℃，预变性5min；第二步：94℃，变性30s；第三步：50℃，退火45s；第四步：72℃延伸90s，第二步至第四步共40个循环；第五步，72℃，最后延伸10min；第六步：4℃保存。C、判断所述的扩增产物中是否存在所述的与CMS相关的线粒体基因的分子标记。如图4中所示：泳道M：Marker2k；泳道1、3、5、7为不育系；2、4、6、8为保持系；①-④为4个不育杂交品种在1、3、5、7、①-④这八个不育品种中均扩增出了1646bp大小的条带，而其余4个可育并没有该条带。因此说该标记能够方便地区分N及S型细胞质类型，可以辅助筛选出稳定的保持系，以推动分子育种的发展。
[0109] 实施例1至实施例2中，所采用的PCR、酶切、连接、转化等基因工程基本操作方法记载于《分子克隆实验指南第三版》中（（美〕J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，2002年出版）。
[0110] 实施例1至实施例2中，所采用的试剂和仪器均为市场常规产品。
[0111] 显然，本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所做的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。