磁珠分离筛选具脂肪酶抑制活性化合物及用途

摘要

本发明提供了一种快速筛选枳壳中具脂肪酶抑制活性的化合物的方法，采用磁珠分离与液相色谱－质谱联用相结合的技术快速筛选枳壳中具脂肪酶抑制活性的化合物，与传统方法相比，与现有方法相比，能够从混合物中快速筛选并鉴定具有潜在脂肪酶抑制活性的化合物，进一步分离制备该类目标化合物，进行活性验证，大大减少了分离有效成分的盲目性，提高了活性筛选效率。该筛选过程无须制备分离化合物，显著提高了筛选效率、缩短了筛选时间。此外，本筛选方法具有快速、准确、重现性好等的特点。可推广用于天然药物或中药混合物中具有脂肪酶抑制活性的化合物的快速筛选。本发明方法获得的具脂肪酶抑制活性的化合物可在制备减肥及降脂药物中应用。

权利要求

1.一种磁珠分离筛选具脂肪酶抑制活性化合物的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）键合脂肪酶的磁珠制备：

（a）磁珠活化：取磁珠使用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗后加入1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液混合均匀，孵育活化30min后移去上清液，并用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗；

（b）磁珠键合：在活化磁珠上，加入含脂肪酶的乙磺酸溶液，震荡混合均匀，在室温孵育30 min进行包被，移去上清液，再用三羟甲基氨基甲烷缓冲液清洗包被的磁珠，弃去清洗液，待用；

（2）键合磁珠质量考察：将制备的键合磁珠分散在磷酸盐缓冲液中，使用扫描式电子显微镜对空白磁珠、脂肪酶键合磁珠的表面分别分析，检查磁珠键合情况；采用傅里叶变换红外光谱仪，测定空白磁珠、脂肪酶、脂肪酶键合磁珠的红外光谱，检查酶结合情况；

（3）筛选具脂肪酶抑制活性的化合物：

（a）具脂肪酶抑制活性化合物的初筛：取100 μl枳壳提取物水溶液2份，分别加到180 μl分散于磷酸盐缓冲液的键合脂肪酶磁珠和空白磁珠中，放在振荡器上混匀，孵育，弃去上清液，再加入纯水清洗3次，弃去清洗液，最后使用含10%乙腈水溶液洗脱，吸取洗脱液备用，取空白磁珠和酶键合磁珠的洗脱液进行液相色谱-质谱联用分析，记录峰面积；

（b）目标化合物获取及活性验证：采用常规柱色谱分离技术分离获取目标化合物群，再采用制备液相色谱分离、纯化目标化合物或购置相对应的目标化合物标准品；采用酶抑制活性实验验证纯化的目标化合物是否具有脂肪酶抑制活性，计算其半数抑制浓度。

2.根据权利要求1所述的一种磁珠分离筛选具脂肪酶抑制活性化合物的方法，其特征在于，所述的具脂肪酶抑制活性的化合物分别是柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枸橘苷。

说明书

磁珠分离筛选具脂肪酶抑制活性化合物及用途

技术领域

[0001] 本发明属于药物筛选方法领域，涉及应用磁珠分离和液相色谱-质谱联用技术，分析靶标蛋白结合物，尤其涉及枳壳中具有脂肪酶抑制活性的化合物的筛选。 背景技术

[0002] 肥胖表现为脂肪细胞中三酰甘油大量堆积，脂肪组织中脂肪细胞增大增多并伴有脂肪分解受损。而脂肪分解调节异常可导致体内的游离脂肪酸浓度增高，从而使肝脏和肌肉中糖类和脂肪代谢紊乱加重，进而导致Ⅱ型糖尿病等慢性疾病的发生。

[0003] 脂肪酶是催化体内三酰甘油第一步水解的关键酶。食物中的脂肪在脂肪酶的作用下被水解为单酰甘油和游离脂肪酸，在肠道被吸收，然后在体内重新合成脂肪，造成脂肪堆积，最终可导致肥胖。因此，应用脂肪酶抑制剂可有效抑制肠道中脂肪酶对脂肪的分解催化作用，达到减少脂肪吸收、控制和降低血脂的作用。具有脂肪酶抑制活性的化合物常被用于制备减肥及降脂药物，人们已经从天然植物中发现了很多天然的脂肪酶抑制剂。现有的脂肪酶酶抑制剂筛选方法主要采用体外酶活性抑制实验，仅能对纯化合物的活性进行评价，难以用于中药等复杂混合物中脂肪酶抑制剂的发现。

[0004] 发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种磁珠分离筛选具脂肪酶抑制活性化合物的方法，是一种快速发现枳壳中具脂肪酶酶抑制活性的化合物的方法，采用磁珠分离与液相色谱－质谱联用相结合的技术快速发现枳壳中具脂肪酶抑制活性的化合物，并进一步分离获取该化合物。具体通过以下步骤实现。

[0006] 1. 键合脂肪酶的磁珠制备

[0007] （1）磁珠活化：取磁珠使用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗后加入1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液混合均匀，孵育活化30min后移去上清液，并用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗；

[0008] （2）磁珠键合：在活化磁珠上，加入含脂肪酶的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液，震荡混合均匀，在室温孵育30 min进行包被，移去上清液。再用三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris) 清洗包被的磁珠4次，弃去清洗液，待用。

[0009] 2. 键合磁珠质量考察：将制备的键合磁珠分散在磷酸盐缓冲液（PBS）中，使用扫描式电子显微镜对空白磁珠、脂肪酶键合磁珠的表面分别分析，检查磁珠键合情况。采用傅里叶变换红外光谱仪，测定空白磁珠、脂肪酶、脂肪酶键合磁珠的红外光谱，检查酶结合情况。

[0010] 3. 筛选具脂肪酶抑制活性的化合物

[0011] （1）具潜在脂肪酶抑制活性的化合物初筛：取100 μl枳壳提取物水溶液2份，分别加到180 μl分散于PBS溶液的键合脂肪酶磁珠和空白磁珠中，放在振荡器上混匀，孵育1 h。弃去上清液，再加入100 μl纯水清洗3次，弃去清洗液，最后使用含10%乙腈水溶液洗脱，吸取洗脱液备用，平行操作三份，取空白磁珠和酶键合磁珠的洗脱液进行液相色谱-质谱联用分析，记录峰面积；

[0012] （2）目标化合物获取及活性验证：采用常规柱色谱分离技术分离获取目标化合物群，再采用制备液相色谱分离、纯化目标化合物或购置相对应的目标化合物标准品；采用酶抑制活性实验验证纯化的目标化合物是否具有脂肪酶抑制活性，计算其半数抑制浓度。

[0013] 所述的具脂肪酶抑制活性的化合物经活性验证后确定为柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枸橘苷。

[0014] 本发明的另一个目的是提供从枳壳中筛选获得的具脂肪酶抑制活性的化合物在制备减肥及降脂药物中的应用。

[0015] 本发明通过一种快速筛选枳壳中具脂肪酶抑制活性的化合物的方法，提供一类具有脂肪酶抑制活性的化合物。与传统方法相比，与现有方法相比，能够从混合物中快速筛选并鉴定具有潜在脂肪酶抑制活性的化合物，进一步分离制备该类目标化合物，进行活性验证，大大减少了分离有效成分的盲目性，提高了活性筛选效率。该筛选过程无须制备分离化合物，显著提高了筛选效率、缩短了筛选时间。此外，本筛选方法具有快速、准确、重现性好等的特点。可推广用于天然药物或中药混合物中具有脂肪酶抑制活性的化合物的快速筛选。本发明方法获得的具脂肪酶抑制活性的化合物可在制备减肥及降脂药物中应用。 附图说明

[0016] 图 1是空白磁珠、脂肪酶、脂肪酶键合磁珠的红外光谱图，其中1A、1B、1C分别为脂肪酶、空白磁珠以及键合脂肪酶磁珠的红外光谱图。

[0017] 图 2是脂肪酶键合磁珠洗脱液的液相色谱－质谱联用分析谱图。

具体实施方式

[0018] 下面将结合附图和实施例进一步说明本发明的实质内容及有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。

[0019] 实施例所用仪器：

[0020] Agilent 1100型液相色谱系统；Finnigan LCQ Deca XPplus 离子阱质谱仪，配有电喷雾（ESI）电离源和Xcalibur 1.3工作站（美国Thermo Finnigan公司) ；Spectramax M2 酶标仪（北京九宇鑫泰生物技术有限公司）；傅里叶变换红外光谱仪（日本Jasco公司）。

[0021] 实施例1 键合脂肪酶的磁珠制备

[0022] 1、试剂：

[0023] 脂肪酶（提自猪胰酶）、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)均购自Simga公司；羧基磁珠（规格：10 mg/ml）购自Invitrogen公司；其它试剂均为分析纯。

[0024] 25 mmol/L的MES溶液配制：称取MES适量，加水溶解，加1 mol/L氢氧化钠溶液调pH至6，制成浓度为25mmol/L的MES溶液。

[0025] 50 mg/ml EDC溶液配制：称取EDC适量，快速溶解在冷的25 mmol/L的MES溶液中，制成浓度为50 mg/ml的EDC溶液。临用时新鲜配制。

[0026] 50 mg/ml NHS溶液配制：称取NHS适量，快速溶解在冷的25mmol/L的MES溶液中，制成浓度为50 mg/ml的NHS溶液。临用时新鲜配制。

[0027] 1mg/ml 脂肪酶酶溶液配制：称取脂肪酶1mg，快速溶解在冷的25 mmol/L的MES溶液中，制成浓度为1 mg/ml的脂肪酶溶液。临用时新鲜配制。

[0028] 10 mmol/L磷酸盐（PBS）缓冲液配制：称取磷酸二氢钠适量，加水溶解，制成浓度为10 mmol/L的磷酸二氢钠溶液，另称取磷酸氢二钠适量，加水溶解，制成浓度为10 mmol/L的磷酸氢二钠溶液。量取10 mmol/L的磷酸二氢钠溶液81.5 ml与磷酸氢二钠溶液18.5 ml，混匀即得。

[0029] 50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液配制：称取三羟甲基氨基甲烷适量，加水溶解，加0.1 mol/L盐酸溶液调节pH 至7.4，制成50 mmol/L Tris缓冲溶液。

[0030] 2、键合脂肪酶的磁珠的制备

[0031] （1）磁珠活化：取100 μl磁珠于1.5 ml离心管中，加入等体积25mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸（pH 6）溶液清洗两次，每次10 min，弃去清洗液，加入50 μl新鲜配置50 mg/ml EDC溶液和50 μl的50 mg/ml NHS溶液溶液，混合均匀，在室温下缓慢倾斜旋转孵育30 min。孵育后，把管子放于磁铁上4 min，移除上清液，使用100 μl的25mmol/L MES溶液清洗两次。

[0032] （2）磁珠键合：在活化磁珠中，加入1 mg/ml 脂肪酶溶液60 μl，再加入25 mmol/L MES溶液40 μl，震荡混合均匀，在室温孵育30 min，或4℃缓慢倾斜旋转孵育2 h，孵育后，把管子放于磁铁上4 min，移除上清液。加50 mmol/L Tris缓冲液300 μl冲洗包被的磁珠4次，加质量分数为0.25 %的牛血清白蛋白Tris缓冲液100 μl，震荡混合均匀，弃去上清液。

[0033] 3、 键合磁珠质量考察

[0034] （1）电镜分析：将制备的键合磁珠分散在10 mmol/L PBS缓冲液中，使用扫描式电子显微镜对空白磁珠、脂肪酶键合磁珠的表面分别进行扫描成像，检查磁珠键合情况。空白磁珠表面非常粗糙，脂肪酶键合磁珠表面比较光滑，可见明显的蛋白积聚情况，表明脂肪酶已键合于磁珠表面。

[0035] （2）键合情况考察：将空白磁珠、脂肪酶、脂肪酶键合磁珠离心浓缩至干后，溴化钾压片后，使用傅里叶变换红外光谱仪，测定空白磁珠、脂肪酶、脂肪酶键合的磁珠的红外光谱，表征其性状见附图1。图1A、1B、1C分别为脂肪酶、空白磁珠以及键合脂肪酶磁珠的-1红外光谱图。由图可见，脂肪酶在1655cm 处存在酰胺键的红外吸收(图1A)，空白磁珠在-1 -1
1655cm 处无红外吸收（图1B），而图1C中在1655cm 处也出现了酰胺键的红外吸收。由此表明，磁珠表面已经成功键合上脂肪酶。

[0036] :实施例2 枳壳总黄酮提取物中具有脂肪酶抑制活性的化合物筛选[0037] 1、药品与试剂：

[0038] 柚皮苷、4-甲基伞形酮油酸酯标准品购自Sigma公司，橙皮苷、新橙皮苷标准品购自上海融禾医药科技发展有限公司，枸橘苷标准品购自上海同田生物技术股份有限公司，枳壳总黄酮提取物购自长沙康尔佳制药集团有限公司。

[0039] 10 mmol/L磷酸盐（PBS）缓冲液配制 称取磷酸二氢钠适量，加水溶解，制成浓度为10 mmol/L的磷酸二氢钠溶液，另称取磷酸氢二钠适量，加水溶解，制成浓度为10 mmol/L的磷酸氢二钠溶液。量取10 mmol/L的磷酸二氢钠溶液81.5 ml与磷酸氢二钠溶液18.5 ml，混匀即得。

[0040] 脂肪酶键合磁珠溶液配制 取上述用1 mg空白磁珠制备的键合脂肪酶的磁珠，加入10 mmol/L PBS缓冲液180 μl ，震荡混合均匀。

[0041] 空白磁珠溶液配制 取100 μl空白磁珠（含空白磁珠1 mg），活化后加入10 mmol/L 的PBS缓冲液180 μl，震荡混合均匀。

[0042] 2、脂肪酶抑制活性筛选系统：由环形磁铁、键合脂肪酶的磁珠、液相色谱-质谱联用仪组成。

[0043] 3、枳壳总黄酮提取物中具有脂肪酶抑制活性的化合物筛选：

[0044] 称取10 mg枳壳总黄酮提取物加入1 ml纯水，超声15 min，10000 rpm离心5 min，吸取上清液备用。取 20 μl上清液，分别加到180 μl 脂肪酶键合磁珠和空白磁珠溶液中，放在振荡器上混匀，孵育1 h。然后放于磁铁上，使磁珠与溶液分开，弃去溶液， 加100 μl水振摇清洗3次，每次15 min。最后使用10%乙腈水溶液，使脂肪酶变性，配体洗脱下来，置于磁铁上静置后吸取上清洗脱溶液进行液相色谱－质谱联用分析。

[0045] 液相色谱－质谱联用分析条件为：Agilent SB-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）。流动相A：0.1%的甲酸-水，流动相B：乙腈。线性洗脱梯度：0 min，10%B；50 min, 20%B；
65 min, 55%B；75 min, 60%B；90 min, 95%B；流速1mL/min，柱温30℃，进样量20μL，检测器：二极管阵列检测器，波长扫描范围为190-400 nm。质谱采用负离子扫描模式检测，扫描方式为一级、二级全扫描，质量扫描范围：m/z 100–2000，碰撞气：高纯氦，雾化气：高纯氮，喷雾电压-4.5kV，毛细管电压-15V，毛细管温度350℃，鞘气流速：30 arb，辅助气流速：
10 arb。

[0046] 脂肪酶键合磁珠洗脱液分析谱图参见附图2。由图2看出酶键合磁珠的洗脱液有4个明显的色谱峰。说明枳壳总黄酮中这4个化合物对脂肪酶有潜在抑制活性。表1列出了这4个化合物的保留时间、紫外、质谱碎片等信息，其紫外最大吸收为280/330nm，鉴定推断化合物1~4分别是黄酮类化合物柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枸橘苷。经过与购置的标准品比对，最终鉴定化合物1为柚皮苷，化合物2与化合物3分别为橙皮苷与新橙皮苷，化合物4为枸橘苷，其化学结构如下。

[0047]

[0048] 目标化合物获取：

[0049] 根据分析鉴定结果，从Sigma公司购置柚皮苷标准品，从上海融禾医药科技发展有限公司购置橙皮苷和新橙皮苷标准品，从上海同田生物技术股份有限公司购置枸橘苷标准品，供后续脂肪酶活性验证实验使用。

[0050] 3、脂肪酶抑制活性验证

[0051] 取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枸橘苷等4个标准品配制成浓度为1、5、10、50、100、250 μg/ml 的待测品溶液，各取20 μl加入20 μl浓度为1mg/ml的脂肪酶溶液，置于在96孔板中，在37℃震荡混匀孵育10 min后，加0.1 mmol/L 4-甲基伞形酮油酸酯溶液20 μl，在37℃震荡混匀孵育30 min后，再加入0.2 mol/L碳酸氢钠溶液80 μL停止反应，在37℃震荡10 min，于405 nm波长处测定吸收值，计算脂肪酶抑制抑制活性。

[0052] 测试结果参见表2，4个化合物中有3个化合物具有较好的脂肪酶抑制活-1性，其中柚皮苷的IC50大于250μg·mL ，无显著的脂肪酶抑制活性，而其余三个化合-1
物均具有脂肪酶抑制活性。其中橙皮苷和新橙皮苷IC50值分别为48.04　μg·mL 与-1
52.45μg·mL ，枸橘苷的IC50值为46.18，其脂肪酶抑制活性未见报道。

[0053] 。