一种扩大普陀鹅耳枥种群数量的方法

摘要

本发明涉及一种扩大普陀鹅耳枥(Carpinus putoensis Cheng)种群数量的方法。本发明人对普陀鹅耳枥的离体快速繁殖进行了深入的研究和改进，克服了现有技术中难以获得再生植株的缺陷，成功获得了相当数量的再生植株，缓解量普陀鹅耳枥的濒危状况。

权利要求

1.一种栽培普陀鹅耳枥(Carpinus putoensis Cheng)的基本培养基，其特征在于，所述基本培养基包含： 其中，组分(1)～(8)在培养基中的含量±10%，组分(9)～(23)在培养基中的含量±5%。

2.一种用于普陀鹅耳枥生根的培养基，其特征在于，其中包含1/2-3/4倍含 量的权利要求1的组分(1)～(8)，1/2-1倍含量的权利要求1的组分(9)～(23)，以及0.1～0.5mg/L吲哚丁酸。

3.如权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述的香蕉提取物如下制备：新鲜香蕉去皮捣碎，按照1g加入4～8mL水的比例加水煮沸，冷却后过滤，收集滤液。

4.一种栽培普陀鹅耳枥的方法，其特征在于，包括：

(1)取普陀鹅耳枥枝条切段，获得外植体；

(2)将外植体接种于包含0.5～3mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.1～0.5mg/L萘乙酸的权利要求1的培养基上进行分化培养，获得包含芽的愈伤组织； (3)将包含芽的愈伤组织转接于包含0.5～3mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.1～0.5mg/L萘乙酸、0-0.01mg/L噻二唑苯基脲的权利要求1的培养基上进行伸长培养，获得形态清晰的芽；将形态清晰的芽转接于包含0.3mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.02mg/L萘乙酸、0.2mg/L赤霉素的权利要求1的培养基或包含0.03mg/L萘乙酸、0.4mg/L赤霉素的权利要求1的培养基上进行伸长培养，获得伸长的芽； (4)将伸长的芽苗在包含1.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.2mg/L萘乙酸、0.005mg/L噻二唑苯基脲的权利要求1的培养基，或在包含2mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L萘乙酸、0mg/L噻二唑苯基脲的权利要求1的培养基上暗培养2-9天，获得暗培养之后的芽苗； (5)将暗培养之后的芽苗分离成单株，转接于包含0.1～0.5mg/L吲哚丁酸、0.5-5%w/v蔗糖和0.1-0.5w/v Gelrite的权利要求2的培养基中进行生根培养，获得生根苗； (6)将生根苗进行耐受培养和炼苗； (7)炼苗后转入大棚中培养，获得普陀鹅耳枥再生植株。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，枝条切段后还进行清洗除菌；

或

外植体的长度是0.5-6cm。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，6-苄氨基腺嘌呤的浓度是1～

2.5mg/L；萘乙酸的浓度是0.2～0.4mg/L。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，包括至少一次的转接步骤，2-4周继代一次。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，分离单株后，还包括：将芽苗用

40-60mg/L的吲哚丁酸处理5-48小时，切除形态学下端0.5-3mm茎段，之后再转接。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)-(3)的光照条件是：60±10μmol.-2 -1m .s 、16±2h/d；

-2 -1

步骤(5)-(6)的光照条件是：80±10μmol.m .s 、16±2h/d；或 步骤(7)的光照条件是：自然光照。

10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)-(4)的培养温度为23±2℃； 步骤(5)的培养温度为24±2℃；或 步骤(6)-(7)的培养温度为28±3℃。

说明书

一种扩大普陀鹅耳枥种群数量的方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物学领域，更具体地，本发明涉及一种扩大普陀鹅耳枥种群数量的方法。

背景技术

[0002] 普陀鹅耳枥(Carpinus putoensis Cheng)是我国著名佛教胜地普陀山的一棵“圣树”，于上世纪三十年代被国内学者钟观光先生发现、郑万钧先生鉴定并发表。这种树在全球仅存1棵野生植株，俗称“地球独生子”，加之它地处浙江舟山普陀风景区，且富有浓厚的神话色彩和丰富的文化底蕴，每天来普陀山朝圣拜树者络绎不绝，对普陀风景区旅游经济的振兴可谓功不可没。然而，该树树龄已经超过200年，日趋老化，长势堪忧，一旦死亡，不但导致普陀鹅耳枥这一重要物种的灭绝，而且对普陀风景区的旅游经济也会产生严重的影响。

[0003] 鉴于普陀鹅耳枥“天下唯一”的濒危状况，早在1987年国际物种保护委员会(SSC)就将其列为全球最濒危的12种植物之一，1999年经国务院正式批准为我国一级保护树种，2004年普陀鹅耳枥被《中国物种红色名录》列为极危(CRD)物种(汪松，解炎，2004，北京：
高等教育出版社，312)。在植物分类学上，普陀鹅耳枥也具有重要的研究和保护价值。

[0004] 长期以来，对该濒危物种的保护措施却不尽人意，仅限于采用传统方法(如播种、嫁接等)繁殖获得极少量幼树。1990年，卢小根等就普陀鹅耳枥播种繁殖发芽率特低的问题对普陀鹅耳枥的开花授粉习性及结实饱满程度进行了调查研究，发现该物种雌雄蕊花期相遇时间短且雄蕊活力低是其濒临灭绝的主要原因(卢小根，邹达明，1990。普陀鹅耳枥濒危原因的调查研究，浙江林业科技，第10卷，第5期：61-64)。1991年，冯玉宝等以庐山野生雷公鹅耳枥为砧木对普陀鹅耳枥进行嫁接繁殖，获得了50余株苗木(冯玉宝，文林，1996。庐山普陀鹅耳枥移地保存试验，林业科技通讯，第5期：23-25)，且未见植株成活的后续报道。目前，舟山林科所也采用传统繁殖方法获得少量幼树，但数量仍十分有限，不能满足物种自然更替对种群数量的基本要求，更谈不上用于城市景观绿化和回归大自然发挥其应有的生态效应。

[0005] 普陀鹅耳枥是被子植物门双子叶植物纲山毛榉目桦木科鹅耳枥属的高大落叶乔木，因其在地球上的“唯一性”，在植物分类学、系统进化等方面具有不可或缺的保护价值和研究地位。

[0006] 因此，快速有效离体培养普陀鹅耳枥试管苗，扩大普陀鹅耳枥的种群数量，从而缓解或解决其濒危状况迫在眉睫，具有重要的物种保护价值和商业开发前景。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种扩大普陀鹅耳枥种群数量的方法。

[0008] 在本发明的第一方面，提供一种栽培普陀鹅耳枥(Carpinus putoensis Cheng)的培养基，所述培养基包含：

[0009] (1)KNO3 1500mg/L；

[0010] (2)NH4NO3 730mg/L；

[0011] (3)MgSO4·7H2O 150mg/L；

[0012] (4)KH2PO4 170mg/L；

[0013] (5)CaCl·2H2O 220mg/L；

[0014] (6)NH4Cl 530mg/L；

[0015] (7)Ca(NO3)2·2H2O 660mg/L；

[0016] (8)KCl 65mg/L；

[0017] (9)H3BO3 6.2mg/L；

[0018] (10)ZnSO4·7H2O 8.6mg/L；

[0019] (11)MnSO4·H2O 22.3mg/L；

[0020] (12)Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L；

[0021] (13)KI 0.83mg/L；

[0022] (14)CuSO4·5H2O 0.25mg/L；

[0023] (15)CoCl2 0.025mg/L；

[0024] (16)FeSO4·7H2O 27.8mg/L；

[0025] (17)Na2·EDTA·H2O 37.3mg/L；

[0026] (18)Myo-Insitol 150mg/L；

[0027] (19)甘氨酸(Glycine) 2.0mg/L；

[0028] (20)盐酸硫胺(Thiamine·HCl) 0.5mg/L；

[0029] (21)烟酸(Nicotinic·acid) 0.2mg/L；

[0030] (22)盐酸吡哆醇(Pyridoxine·HCl) 0.2mg/L；

[0031] (23)香蕉提取物 10ml/L；

[0032] 其中，组分(1)～(8)在培养基中的含量可±10％，组分(9)～(23)在培养基中的含量可±5％。

[0033] 在本发明的另一方面，提供一种用于普陀鹅耳枥生根的培养基，其中包含1/2-3/4倍含量的所述的组分(1)～(8)，以及1/2-1倍含量的所述的组分(9)～(23)。

[0034] 在另一优选例中，其中还含有生长因子，所述的生长因子选自：6-苄氨基腺嘌呤(BA)，萘乙酸(NAA)，噻二唑苯基脲(TDZ)，赤霉素(GA3)，吲哚丁酸(IBA)。

[0035] 在另一优选例中，所述的生长因子是：

[0036] 0.5～3mg/L(较佳地1-2.5mg/L)6-苄氨基腺嘌呤，0.1～0.5mg/L(较佳地是0.2-0.4mg/L)萘乙酸和0～0.01mg/L(较佳地是0.002-0.008mg/L)噻二唑苯基脲；或者[0037] 0.5～3mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(较佳地1-2.5mg/L)，0.1～0.5mg/L(较佳地是
0.2-0.4mg/L)萘乙酸和0-0.6mg/L赤霉素(较佳地是0.1-0.5mg/L)；或者

[0038] 0.1～0.5mg/L吲哚丁酸(较佳地是0.2-0.4mg/L)。

[0039] 在另一优选例中，所述的香蕉提取物如下制备：新鲜香蕉去皮捣碎，按照1g加入4～8mL(较佳地5-8mL)水的比例加水煮沸，冷却后过滤，收集滤液。

[0040] 在另一优选例中，所述的培养基的PH值是5.5～6.5。

[0041] 在本发明的另一方面，提供一种栽培普陀鹅耳枥的方法，包括：

[0042] (1)取普陀鹅耳枥枝条切段，获得外植体；

[0043] (2)将外植体接种于包含6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸的所述的培养基上进行分化培养，获得包含芽(包括定芽和不定芽)的愈伤组织；

[0044] (3)将包含芽的愈伤组织转接于包含6-苄氨基腺嘌呤和萘乙酸、及选择性包含噻二唑苯基脲或赤霉素的所述的培养基上进行伸长培养，获得伸长的芽；

[0045] (4)将伸长的芽苗(较佳地，芽苗基部带有少量愈伤组织)在包含6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、噻二唑苯基脲的所述的培养基上暗培养2-9天(较佳地3-7天)，获得暗培养之后的芽苗；

[0046] (5)将暗培养之后的芽苗分离成单株，转接于包含吲哚丁酸、蔗糖和Gelrite的1/2-3/4培养基中进行生根培养，获得生根苗；

[0047] (6)将生根苗进行耐受培养和炼苗；

[0048] (7)炼苗后转入大棚中培养，获得普陀鹅耳枥再生植株。

[0049] 在另一优选例中，步骤(1)之取枝条前，还包括：将普陀鹅耳枥的枝条用0.1mm×0.1mm的尼龙网袋套住1-3个月。

[0050] 在另一优选例中，在每年的4-7月取枝条。

[0051] 在另一优选例中，步骤(1)中，枝条切段后还进行清洗除菌；或

[0052] 外植体的长度是0.5-6cm(较佳地是1-3cm)。

[0053] 在另一优选例中，采用水、乙醇和/或升汞清洗除菌。

[0054] 在另一优选例中，步骤(2)中，6-苄氨基腺嘌呤的浓度是0.5～3mg/L(较佳地是1-2.5mg/L)；或萘乙酸的浓度是0.1～0.5mg/L(较佳地是0.2-0.4mg/L)。

[0055] 在另一优选例中，步骤(2)中，包括至少一次(较佳地2-6次；更佳地3-5次)的转接步骤，2-4周继代(转接)一次。

[0056] 在另一优选例中，步骤(3)中，6-苄氨基腺嘌呤的浓度是0.5～3mg/L(较佳地是1-2.5mg/L)；萘乙酸的浓度是0.1～0.5mg/L(较佳地是0.2-0.4mg/L)；噻二唑苯基脲的浓度是0-0.01mg/L(较佳地是0.002-0.008mg/L)；或赤霉素的浓度是0-0.6mg/L(较佳地是
0.1-0.5mg/L)。

[0057] 在另一优选例中，步骤(3)中，包括：

[0058] (a)将包含芽的愈伤组织转接于包含6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、噻二唑苯基脲的所述的培养基上进行伸长培养，获得形态清晰的芽；

[0059] (b)将(a)获得的芽转接于包含6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、赤霉素的所述的培养基上进行伸长培养，获得伸长的芽。

[0060] 在另一优选例中，步骤(4)中，6-苄氨基腺嘌呤的浓度是0.5～3mg/L(较佳地是1-2.5mg/L)；萘乙酸的浓度是0.1～0.5mg/L(较佳地是0.2-0.4mg/L)；或赤霉素的浓度是
0-0.6mg/L(较佳地是0.1-0.5mg/L)。

[0061] 在另一优选例中，步骤(5)中，吲哚丁酸的浓度是0.1～0.5mg/L(较佳地是0.2-0.4mg/L)；蔗糖的浓度是0.5-5％(w/v)(较佳地是1-4％；更佳地是2-3％)；或Gelrite的浓度是0.1-0.5(w/v)(较佳地是0.15-0.4％；更佳地是0.2-0.3％)。

[0062] 在另一优选例中，步骤(5)中，分离单株后，还包括：将芽苗用40-60mg/L的吲哚丁酸处理5-48小时(较佳地10-36小时)，切除形态学下端0.5-3mm(较佳地0.8-1.5mm)茎段，之后再转接。

[0063] 在另一优选例中，步骤(2)-(3)的光照条件是：60±10μmol.m-2.s-1、16±2h/d；

[0064] 步骤(5)-(6)的光照条件是：80±10μmol.m-2.s-1、16±2h/d；或

[0065] 步骤(7)的光照条件是：自然光照。

[0066] 在另一优选例中，步骤(2-(4)的培养温度为23±2℃(较佳地22-23℃)；

[0067] 步骤(5)的培养温度为24±2℃(较佳地24±1℃)；或

[0068] 步骤(6)-(7)的培养温度为28±3℃(较佳地28±2℃)。

[0069] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

[0070] 图1、普陀鹅耳枥离体再生体系。

[0071] A：初始外植体切段，比例尺为3cm；

[0072] B：原始不定芽和定芽，比例尺为4mm；

[0073] C：芽，比例尺为5mm；

[0074] D：伸长的丛芽，比例尺为6mm；

[0075] E：生根小苗，比例尺为1cm；

[0076] F：再生植株，比例尺为5cm。

具体实施方式

[0077] 为尽快缓解普陀鹅耳枥(Carpinus putoensis Cheng)的濒危状况与合理利用其生态功能，本发明人对普陀鹅耳枥的离体快速繁殖进行了深入的研究和改进，克服了现有技术中难以获得再生植株的缺陷，成功获得了相当数量的再生植株。

[0078] 培养基

[0079] 鉴于本领域目前难以培育普陀鹅耳枥的技术难题，本发明人致力于研究其离体再生技术，发现普陀鹅耳枥离体再生成功的一个关键在于找到适宜的培养基。

[0080] 通常地，植物培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。本发明人对这些主要成分均进行了反复地优化，并添加了一些个性化的材料如香蕉提取物，从而给予了普陀鹅耳枥适宜分化、伸长、生根的营养环境。

[0081] 如本文所用，所述培养基中各成分的计量是以培养基总体积计。

[0082] 本发明的培养基成分中，包含“大量成分”和“小量成分”。所述的“大量成分”是指在培养基中浓度相对高的成分；而“小量成分”则是指在培养基中浓度相对低的成分。

[0083] 本发明的基本培养基(简称PT培养基)中，大量成分包括表1中所列的编号为1-8的成分，它们在培养基中的含量还可上下浮动10％；较佳地浮动5％。

[0084] 本发明的基本培养基中，小量成分包括表1中所列的编号为9-23的成分，它们在它们在培养基中的含量还可上下浮动5％；较佳地浮动3％。

[0085] 根据本发明提供的基本培养基，在植株培育的不同阶段上，还可添加不同的生长因子以促进植株在该阶段的生长。植物生长因子是植物细胞、组织、器官离体培养中重要的物质，是启动细胞脱分化、分裂和再分化的关键性激素。因此，本发明的培养基中，还可添加选自以下的一种或多种生长因子：细胞分裂素6-苄氨基腺嘌呤(BA)及噻二唑苯基脲(TDZ)，生长素萘乙酸(NAA)，赤霉素(GA3)和/或吲哚丁酸(IBA)。所述的赤霉素后可使芽得到有效伸长；而所述的吲哚丁酸可促进芽苗的生根。

[0086] 更佳地，本发明的培养基中，添加的生长因子选自：0.5～3mg/L(较佳地1-2.5mg/L)6-苄氨基腺嘌呤，0.1～0.5mg/L(较佳地是0.2-0.4mg/L)萘乙酸和0～0.01mg/L(较佳地是0.002-0.008mg/L)噻二唑苯基脲；或者0.5～3mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(较佳地1-2.5mg/L)，0.1～0.5mg/L(较佳地是0.2-0.4mg/L)萘乙酸和0-0.6mg/L赤霉素(较佳地是0.1-0.5mg/L)；或者0.1～0.5mg/L吲哚丁酸(较佳地是0.2-0.4mg/L)。

[0087] 所述的培养基中还可包括支持物，例如琼脂、Gelrite等。适当还可加入抗生物质实现抑菌的目的；或者还可加入抗氧化物。这些都是本领域技术人员可以常规确定的。

[0088] 本发明也包含基于所述的基本培养基的稀释形式的培养基，或部分成分稀释后获得的培养基。例如，在进行生根培养时，需要将培养基中的大量成分进行适当的稀释，以适于生根阶段的生长。

[0089] 因此，作为本发明的优选方式，还包括基于所述的基本培养基，其中大量成分稀释1/2-3/4倍，小量成分稀释1/2-1倍。培养基的稀释及其应用是本领域常规的技术，在植物培养领域的技术人员均了解如何配制和使用1/2培养基或3/4培养基。

[0090] 栽培方法

[0091] 本发明的普陀鹅耳枥离体再生成功的另一个关键是确定较佳的培养方法和培养条件。

[0092] 本发明人反复研究后，提出了一个较佳的普陀鹅耳枥的培养方法，包括：(1)取普陀鹅耳枥枝条切段，获得外植体；(2)将外植体接种于包含6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸的PT培养基上进行分化培养，获得包含芽的愈伤组织；(3)将包含芽的愈伤组织转接于包含6-苄氨基腺嘌呤和萘乙酸、及选择性包含噻二唑苯基脲或赤霉素的PT培养基上进行伸长培养，获得伸长的芽；(4)将伸长的芽苗在包含6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、噻二唑苯基脲的PT培养基上暗培养2-9天，获得暗培养之后的芽苗；(5)将暗培养之后的芽苗分离成单株，转接于包含吲哚丁酸、蔗糖和Gelrite的PT培养基中进行生根培养，获得生根苗；(6)将生根苗进行耐受培养和炼苗；(7)炼苗后转入大棚中培养，获得普陀鹅耳枥再生植株。

[0093] 本发明的方法中，首先是获取合适的普陀鹅耳枥的枝条，较佳地取其健壮枝条，较佳地在每年的4-7月获取枝条。所述的枝条被切段以制备成外植体，较佳地对外植体进行清洗消毒，例如使用70-75％体积的乙醇溶液，0.1-0.2％体积的升汞溶液，无菌水进行清洗消毒，整个操作可在无菌超净台中进行。

[0094] 切段清洗后的外植体被置于包含6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸的PT培养基上，进行分化培养，首先出现绿色的芽点，之后转变为清晰的定芽或不定芽。

[0095] 获得清晰的不定芽或定芽之后，将芽转接于包含6-苄氨基腺嘌呤和萘乙酸、及选择性包含噻二唑苯基脲或赤霉素的PT培养基上进行伸长培养，获得伸长的不定芽或定芽。噻二唑苯基脲或赤霉素是有利于芽伸长的成分，但它们的添加量不能太高，否则会使得芽过于伸长而导致生根困难。

[0096] 芽伸长之后，将伸长的芽苗进行适当时间的暗培养，这样将有利于植株排出有毒的物质，有利于愈伤组织的闭合。

[0097] 暗培养之后，将芽苗分离成单株，转接于生根培养基。生根培养基较佳地选用3/4PT培养基，其中还加入吲哚乙酸以促进根的生长。较佳地，还在生根培养基中加入蔗糖以有利于根的生长。

[0098] 生根的苗需要进行耐受培养以及炼苗，以使其能够适应大棚或普通环境的生长。之后，将小苗已在到自然光照的大棚中，栽培、成长。在大棚中的培养基质较佳地选自：泥炭、菜园土或珍珠岩。较佳地，培养基质是泥土、菜园土、珍珠岩的混合物；更佳地，它们的比例是(2-4)∶(5-7)∶1。

[0099] 较为适宜的温度是有利于植物的生长分化的，不同植物培养的适温不同。对于主要生长在我国我国著名佛教胜地普陀山的普陀鹅耳枥，其较适合的温度是在20-30℃之间。因此，作为本发明的优选方式，分化和伸长的培养温度为23±2℃，较佳地22-23℃；生根的培养温度为24±2℃，较佳地24±1℃；在耐受培养和炼苗的阶段，培养温度为28±3℃，较佳地28±2℃，这样有利于其适应自然的生长环境。

[0100] 较为适宜的光照是有利于植物的生长分化的，不同植物培养的适温不同。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。本申请中诱导和生长-2 -1 -2 -1阶段的光照强度为40-80μmol.m .s ，优选为60μmol.m .s 。在生根阶段，可适当增加光-2 -1
照强度，优选为80μmol.m .s 。之后在大棚培养后，可采用自然光照。在不同的组织培养阶段，光照时间视情况有所不同。对于普陀鹅耳枥来说，其光照时间一般为12-20个小时，优选16个小时。

[0101] 本发明获得的普陀鹅耳枥再生植株，可以进一步培育成为园林绿化的行道树和作为其它实验的起始材料，或用于作为杂交生成植物新品种的材料。

[0102] 本发明人以野外套袋处理的普陀鹅耳枥枝条为起始材料，经培养产生一定量不定芽或定芽，由此已经获得了近200株普陀鹅耳枥再生植株，表型一致性高。由此再生系统可以再生百年老树，由定芽来的再生植株能保持亲本的遗传表型，保证了原始亲本“地球独生子”种质的稳定性。

[0103] 采用本发明的方法能够在短时间内生产大量的普陀鹅耳枥优质种苗，而且这种种苗的发生已不受季节限制，可以常年生产。这种种苗生产方法公开后，有利于迅速扩大该物种的种群数量，从而起到保护该物种的作用。

[0104] 200年历史的普陀鹅耳枥老树可靠再生，迄今未见成功的报道。而本发明首次使普陀鹅耳枥老树枝条培养成功再生成植株。按本发明的方法重复三次试验，平均每个枝条切段能产生再生植株1.34株，且与亲本表型一致性高。

[0105] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

[0106] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

[0107] 实施例1、基本培养基的制备

[0108] 基本培养基(Putoensis basal medium，简称PT培养基)的制备如下：

[0109] 按照表1配制基本培养基，pH5.8，121℃灭菌15-25分钟。其中，香蕉提取物的制备方法是：称取去皮新鲜香蕉100g捣碎、加蒸馏水500ml煮沸，冷却后用纱布过滤，收集滤液，滤液用蒸馏水定容至1000ml，4℃保存备用。芽的诱导和伸长均使用该培养基。

[0110] 表1、PT培养基的组成成分

[0111]

[0112]

[0113] 实施例2、普陀鹅耳枥离体培养方法1

[0114] (1)将普陀鹅耳枥枝条用孔径为0.1mm×0.1mm的尼龙网袋套住1-3个月(每年较适时间为4-7月)，待新枝长成后取健壮枝条以备用。

[0115] (2)将上述健壮枝条剪成10cm左右的切段，用自来水洗净，吸干表面水珠，用注射器盛装70％的乙醇冲洗枝条的叶腋3次，再用注射器盛装无菌水冲洗枝条的叶腋5次，切除绝大部分叶面，将材料整理成初始外植体(图1A)。

[0116] 在超净工作台上用70％的乙醇消毒80秒，0.1％的升汞浸泡5分钟，无菌水冲洗8次，无菌滤纸吸干无菌材料表面水珠，将初始外植体切成1-3cm的切段以备用。

[0117] (3)将上述切段接种于附含2mg/l BA和0.3mg/l NAA的PT培养基中培养5天后，切段的近培养基端膨大并见绿色芽点(图1B)，在此培养基上培养5周后，起始外植体-2 -1基本上被致密的愈伤组织包裹。培养条件：光照(60μmol.m .s )16h/d培养，培养温度为
23±1℃，2.5周继代(即指转接)一次，培养基不变。

[0118] (4)将步骤(3)所得的待可见绿色芽点的培养物整体转接在附含2mg/l BA和0.2mg/l NAA的PT培养基上培养4-6周后，绿色芽点开始转变为形态清晰的不定芽或定芽-2 -1
(图1C)。光照(60μmol.m .s )16h/d培养，培养温度为23±1℃，2.5周继代一次，培养基不变。

[0119] (5)将附带芽的愈伤组织在附含1.5mg/l BA，0.005mg/l TDZ和0.2mg/lNAA的PT-2 -1培养基上培养3周后，诱导出形态清晰的芽(图1C)。光照培养(60μmol.m .s )16h/d，培养温度为23±1℃。

[0120] (6)将芽转入附含0.3mg/l BA、0.02mg/l NAA和0.2mg/l GA3的PT培养基培养-2 -14.5周后，芽得到有效伸长(图1D)。光照(60μmol.m .s )16h/d，培养温度22±1℃。

[0121] (7)将伸长的芽苗(此时其基部可带有少量愈伤组织)在步骤(5)的培养基中暗培养(22±1℃)5天。

[0122] (9)将暗培养后的芽苗分离成单株，剥去小苗形态学下端叶片，用50mg/lIBA预处理20h，切除形态学下端1mm茎段后，转入附含0.3mg/l IBA的3/4PT培养基(即生根培养基，还含有蔗糖和Gelrite)中培养4-6周后不定根被诱导出来(图1E)。生根培养基附加-2 -1蔗糖2％，且用0.25％Gelrite固化。培养条件：光照(80μmol.m .s )16h/d，培养温度
24±1℃。

[0123] (10)将步骤(9)所得生根苗连同培养基、培养瓶等一起转入28±2℃、光照-2 -1(80μmol.m .s )16h/d的培养条件下进行耐受培养1.5周后，打开培养瓶盖子，注入15ml无菌水或去离子水，炼苗6天。

[0124] (11)将生根小苗移栽到泥炭、菜园土和珍珠岩(3∶6∶1)的基质中，在28±2℃、自然光照的大棚中生长良好，成长为普陀鹅耳枥再生植株(图1F)。

[0125] 实施例3、普陀鹅耳枥离体培养方法2

[0126] (1)取普陀鹅耳枥干净、健壮的枝条以备用。

[0127] (2)将上述健壮枝条剪成9cm左右的切段，用自来水洗净，吸干表面水珠，用注射器盛装70％的乙醇冲洗枝条的叶腋5次，再用注射器盛装无菌水冲洗枝条的叶腋3次，切除绝大部分叶面，将材料整理成初始外植体。

[0128] 在超净工作台上用70％的乙醇消毒40秒，0.1％的升汞浸泡8分钟，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干无菌材料表面水珠，将初始外植体切成1-3cm的切段以备用。

[0129] (3)将上述切段接种于附含1mg/l BA和0.4mg/l NAA的PT培养基中培养5天后，切段的近培养基端膨大并见绿色芽点，在此培养基上培养5周后，起始外植体基本上被致-2 -1密的愈伤组织包裹。培养条件：光照(60μmol.m .s )16h/d培养，培养温度为23±1℃，3周继代一次，培养基不变。

[0130] (4)将步骤(3)所得的待可见绿色芽点的培养物整体转接在附含1.5mg/lBA和0.3mg/l NAA的PT培养基上培养4-6周后，绿色芽点开始转变为形态清晰的不定芽或定芽。
-2 -1
光照(60μmol.m .s )16h/d培养，培养温度为23±1℃，3周继代一次，培养基不变。

[0131] (5)将附带芽的愈伤组织在附含2mg/l BA，0mg/l TDZ和0.3mg/l NAA的PT培-2 -1养基上培养4周后，诱导出形态清晰的芽。光照培养(60μmol.m .s )16h/d，培养温度为
23±1℃。

[0132] (6)将芽转入附含0mg/l BA、0.03mg/l NAA和0.4mg/l GA3的PT培养基培养5周-2 -1后，芽得到有效伸长。光照(60μmol.m .s )16h/d，培养温度22±1℃。

[0133] (7)将伸长的芽苗(此时其基部可带有少量愈伤组织)在步骤(5)的培养基中暗培养(22±1℃)4天。

[0134] (9)将暗培养后的芽苗分离成单株，剥去小苗形态学下端叶片，用50mg/lIBA预处理12h，切除形态学下端1mm茎段后，转入附含0.4mg/l IBA的3/4PT培养基(即生根培养基，还含有蔗糖和Gelrite)中培养4-6周后不定根被诱导出来。生根培养基附加蔗糖2％，-2 -1且用0.25％Gelrite固化。培养条件：光照(80μmol.m .s )16h/d，培养温度24±1℃。

[0135] (10)将步骤(9)所得生根苗连同培养基、培养瓶等一起转入28±2℃、光照-2 -1(75μmol.m .s )16h/d的培养条件下进行耐受培养2周后，打开培养瓶盖子，注入18ml无菌水或去离子水，炼苗7天。

[0136] (11)将生根小苗移栽到泥炭、菜园土和珍珠岩(3∶6∶1)的基质中，在28±2℃、自然光照的大棚中生长良好，成长为普陀鹅耳枥再生植株。

[0137] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。