鬼臼衍生物及其组合物、制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种鬼臼衍生物及其组合物、制备方法和应用，动物试验证明，本发明的鬼臼衍生物具有很好的抗肿瘤活性，可用于治疗白血病、肝癌、肺癌等疾病，且毒性很小，能够满足临床的需要。所述鬼臼衍生物，为具有如下结构通式(I)的化合物：

权利要求

1.鬼臼衍生物，其特征在于，为：

(化合物1－6726-17-1) N-((5S,5aS,8aR,9R)-9-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5,5a,6,8,8a,9-六氢呋喃并[3’,4’:6,7]萘并[2,3-d][1,3]二氧5环-5-基)-3-三氟甲基苯甲酰胺、(化合物2－6726-19-1) 2-氯-N-((5S,5aS,8aR,9R)-9-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-

8-氧代-5,5a,6,8,8a,9-六氢呋喃并[3’,4’:6,7]萘并[2,3-d][1,3]二氧5环-5-基)-3,4-二甲氧基苯甲酰胺、(化合物4－6726-41-1) (4) 2-(2-氟苯基)-N-((5S,5aS,8aR,9R)-9-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5,5a,6,8,8a,9-六氢呋喃并[3’,4’:6,7]萘并[2,3-d][1,3]二氧5环-5-基)乙酰胺、(化合物5－6726-33-1) 5-氯-2-羟基-N-((5S,5aS,8aR,9R)-9-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5,5a,6,8,8a,9-六氢呋喃并[3’,4’:6,7]萘并[2,3-d][1,3]二氧5环-5-基)-4-(甲氧基甲氧基)苯甲酰胺、(化合物6－6726-43-1) 5-氯-2,4-二羟基-N-((5S,5aS,8aR,9R)-9-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5,5a,6,8,8a,9-六氢呋喃并[3’,4’:6,7]萘并[2,3-d][1,3]二氧5环-5-基)苯甲酰胺、(化合物7－6726-35-1) 4-溴-N-((5S,5aS,8aR,9R)-9-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-

8-氧代-5,5a,6,8,8a,9-六氢呋喃并[3’,4’:6,7]萘并[2,3-d][1,3]二氧5环-5-基)-3,5-二甲氧基苯甲酰胺、(化合物8－6726-36-1) N-((5S,5aS,8aR,9R)-9-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5,5a,6,8,8a,9-六氢呋喃并[3’,4’:6,7]萘并[2,3-d][1,3]二氧5环-5-基)-4-三氟甲基苯甲酰胺、(化合物9－6726-37-1) 4-羟基-N-((5S,5aS,8aR,9R)-9-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5,5a,6,8,8a,9-六氢呋喃并[3’,4’:6,7]萘并[2,3-d][1,3]二氧5环-5-基)-

3-甲基苯甲酰胺、

(化合物10－6726-38-1) 4-溴-3,5-二羟基-N-((5S,5aS,8aR,9R)-9-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5,5a,6,8,8a,9-六氢呋喃并[3’,4’:6,7]萘并[2,3-d][1,3]二氧5环-5-基)-苯甲酰胺或(化合物12－6726-40-1) 2-(2,4-二氟苯基)-N-((5S,5aS,8aR,9R)-9-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5,5a,6,8,8a,9-六氢呋喃并[3’,4’:6,7]萘并[2,3-d][1,3]二氧5环-5-基)乙酰胺。

2.一种组合物，包括治疗有效量的权利要求1所述的化合物与药学上可接受的载体。

3.权利要求1所述的化合物在制备治疗白血病药物中的应用。

说明书

鬼臼衍生物及其组合物、制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及鬼臼衍生物及其组合物、制备方法和应用，以及该组合物在制备抗肿瘤药剂中的应用。

背景技术

[0002] 肿瘤病是多因素引起的恶性疾患，干扰某一(些)重要环节，就有可能阻止肿瘤生长。

[0003] 本申请项目是研究小分子的鬼臼衍生物抗肿瘤活性，为抗肿瘤药物提供新的选择。

[0004] 鬼臼毒素具有显著的抗肿瘤活性，但因毒性强、副作用大而使其应用受到限制。由鬼臼毒素结构改造所得的衍生物依托泊甙(etoposid，vepesid，鬼臼乙叉苷，足草乙苷，VP16)和替尼泊甙(teniposide，鬼臼噻吩苷，特尼泊苷，VM26)已成为应用于临床的抗癌代表药物。它们对小细胞肺癌、睾丸癌、急性白血病及恶性淋巴瘤等有效。鬼臼毒素能和微管蛋白相结合，抑制微管聚合，从而破坏纺锤丝的形成。但VP16和VM26则与鬼臼毒素不同，主要抑制DNA拓扑异构酶2，从而干扰DNA的复制。属细胞周期非特异性药物，主要作用于S期和G2期细胞。VP16单用虽也有效，但临床上常与顺铂联合用于治疗肺癌及睾丸肿瘤，疗效较好，也用于淋巴瘤治疗。VM26对脑瘤亦有效。不良反应有骨髓抑制及胃肠道反应等。

[0005] 因此，鬼臼衍生物及其组合物的显著抗肿瘤活性，发展其作为新型的抗癌药物或与其它抗癌药物联合应用新药，将具有很大的市场，亦将产生较大的社会效益和经济效益。

发明内容

[0006] 本发明的目的之一是公开一种鬼臼衍生物，以克服现有技术存在的上述缺陷，满足临床的需要；

[0007] 本发明的目的之二是公开上述的药物组合物；

[0008] 本发明的目的之三是公开所述鬼臼衍生物的制备方法；

[0009] 本发明的目的之四是公开所述鬼臼衍生物在制备抗肿瘤药剂中的应用。

[0010] 本发明的鬼臼衍生物为具有如下结构通式(I)化合物：

[0011]

[0012] 其中：

[0013] R1代表H、卤素、羟基、C1～C4烷氧基或C1～C4烷氧烷氧基；

[0014] R2代表H、羟基、C1～C3卤代烷基或C1～C4烷氧基；

[0015] R3代表H、羟基、卤素、C1～C3卤代烷基或C1～C4烷氧基；

[0016] R4代表H、羟基、卤素或C1～C4烷氧基；

[0017] 其中，当n＝0、R3为C1～C4烷氧基时，R1为卤素、羟基、C1～C4烷氧基或C1～C4烷氧烷氧基，R2同时为羟基、卤素、C1～C3卤代烷基或C1～C4烷氧基；

[0018] 当n＝0时，R1、R2、R3和R4中，有任意三个基团同时为氢时，则剩余第四个基团为C1～C3卤代烷基。

[0019] 在本发明中，C1～C4烷氧基，作为一种基团，意指含有1至4个碳原子的支链号直链烷氧基，它包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基 和叔丁氧基，优选的，所述的C1～C4烷氧基为OCH3；

[0020] 同样，C1～C3卤代烷基是指被一个或多个相同或不同的卤代原子取代的C1～C3烷基，例如氯甲基、氟甲基、三氟甲基、氯乙基、二氟乙基、氯丙基等，优选的，所述C1～C3卤代烷基为三氟甲基；

[0021] 所述的卤素为氟、氯、溴或碘，优选的，R1代表的卤素为氟或氯，R3代表的卤素为氟或溴，R4代表的卤素为氯；

[0022] 本发明中，R1优选H、氟、氯、OH或OCH3、OCH2OCH3；

[0023] R2优选H、OH、CF3或OCH3；

[0024] R3优选H、OH、氟、溴、CF3或OCH3；

[0025] R4优选H、OH、Cl或OCH3；

[0026] 最优选的化合物为：

[0027] (化合物1-6726-17-1)N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)-3-三氟甲基苯甲酰胺、

[0028] (化合物2-6726-19-1)2-氯-N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)-3，4-二甲氧基苯甲酰胺、

[0029] (化合物3-6726-20-1)N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)-2，3，4-三甲氧基苯甲酰胺、

[0030] (化合物4-6726-41-1)(4)2-(2-氟苯基)-N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)乙酰胺、

[0031] (化合物5-6726-33-1)5-氯-2-羟基-N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯 基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)-4-(甲氧基甲氧基)苯甲酰胺、

[0032] (化合物6-6726-43-1)5-氯-2，4-二羟基-N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)苯甲酰胺、

[0033] (化合物7-6726-35-1)4-溴-N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)-3，5-二甲氧基苯甲酰胺、

[0034] (化合物8-6726-36-1)N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)-4-三氟甲基苯甲酰胺、

[0035] (化合物9-6726-37-1)4-羟基-N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)-3-甲基苯甲酰胺、

[0036] (化合物10-6726-38-1)4-溴-3，5-二羟基-N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)-苯甲酰胺、

[0037] (化合物11-6726-39-1)N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺或

[0038] (化合物12-6726-40-1)2-(2，4-二氟苯基)-N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)乙酰胺。

[0039] 表一优选化合物结构式列表

[0040]

[0041]  No.   n   R1   R2   R3   R4   分子式
  1   0   H   CF3   H   H   C29H24F3NO8
  2   0   Cl   OCH3   OCH3   H   C30H28ClNO10
  3   0   OCH3   OCH3   OCH3   H   C31H31NO11
  4   1   F   H   H   H   C29H26FNO8
  5   0   OCH2OCH3   H   OH   Cl   C30H28ClNO11
  6   0   OH   H   OH   Cl   C28H24ClNO10
  7   0   H   OCH3   Br   OCH3   C30H28BrNO10
  8   0   H   H   CF3   H   C29H24F3NO8
  9   0   H   OCH3   OH   H   C29H27NO9
  10   0   H   OH   Br   OH   C28H24BrNO10
  11   1   H   OCH3   H   H   C30H29NO9
  12   1   F   H   F   H   C29H25F2NO8

[0042] 上述的化合物可采用如下的反应路线进行制备：合成路线通式：

[0043]

[0044] 式(II)            式(III)                        式(I)

[0045] R1、R2、R3和R4的定义如前所述。

[0046] 将式II化合物与式III化合物在有机溶剂中，缩合剂存在下和碱的作用下进行反应。反应温度为-15-100℃，反应时间为1-120小时，然后从反应产物中收集式(I)目标产物；

[0047] 具体的，包括如下步骤：

[0048] 将式II化合物与式III化合物在有机溶剂中，缩合剂存在下和碱的作用下进行反应。反应条件为，反应温度为-15～100℃，优选10～50℃；反应时间为1～120小时，优选2～48小时；式II化合物与式III化合物的投料摩尔比为1∶1～1∶5，优选1∶1～1∶3。

[0049] 所述的有机溶剂选自四氢呋喃、吡啶、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮和二甲亚砜中的一种或几种；优选二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺。

[0050] 所述的碱选自有机碱或无机碱中的一种以上。有机碱如吡啶、三乙胺、N，N-二甲胺基吡啶和二异丙基乙胺(DIEA)中的一种或几种，无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠和碳酸氢钠中的一种或几种；优选有机碱。

[0051] 所述的缩合剂选自一般的脱水剂，较佳的是二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、N，N′-羰基二咪唑(CDI)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、甲基膦酸酐、乙基膦酸酐、正丙基膦酸酐、丙膦酸环酸酐(T3P)和苯并三唑基磷酸二乙酯中的一种或是几种。

[0052] 式II化合物(4β-氨基-4’-O-去甲基表鬼臼毒素)可采用文献Journal of Natural Products，1989，Vol52，No3，606-613文献报道的方法进行制备；

[0053] 式III化合物1-4和7-14对应的酸市购(Aldrich)，化合物5对应的酸的制备参考文献WO2006/117669(2006)中“example 153”，化合物6对应的酸的制备参考文献WO2006/117669(2006)中“G10compound C”，Journal ofthe American Chemical Society，1935，
1077-1078文献报道的方法进行制备；

[0054] 本发明还涉及一种组合物，包括治疗有效量的式(1)的化合物与药学上可接受的载体，所述载体是指药学领域常规的药物载体，如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等，粘合剂如纤维素衍生物、明胶和聚乙烯吡咯烷酮等，润湿剂如甘油等，表面活性剂如十六烷醇等，崩解剂如碳酸钙等，润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁等；

[0055] 可采用本领域公知的方法，将治疗有效量的本发明的化合物与一种或多种药学上可接受的载体相混合，制备成常规的固体制剂如片剂、粉剂、胶囊或针剂等。

[0056] 按照本发明，片剂、粉剂、胶囊或针剂中，本发明的化合物的重量百分比含量为0.1％-99.5％，优选0.5％-19.5％。

[0057] 本发明的鬼臼衍生物，对于肿瘤具有明显的治疗效果，尤其是用于治疗白血病、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、人口腔上皮癌或肺癌，可以用于制备治疗抗肿瘤的药物；

[0058] 本发明的化合物可以通过口服、注射等方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制备成常规的固体制剂如片剂、粉剂或胶囊等；用于注射时，可将其制备成注射液。本发明的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等进行变化，其日剂量可以是2-50mg/kg体重(po)或1-20mg/kg(iv)。

[0059] 动物试验证明，本发明的鬼臼衍生物具有很好的抗肿瘤活性，可用于治疗白血病、肝癌、肺癌等疾病，且毒性很小，能够满足临床的需要。

具体实施方式

[0060] 下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但这些实施例而不是对本发明的任何限制。所有实施例中化合物的熔点用SGW X-4显微熔点仪测定，温度计未校正。1HNMR由Varian AM-400型核磁共振仪测定，以TMS为内标，化学位移以δ(ppm)表示；质谱 用Q-TOF型质谱仪测定；柱层析所用硅胶为国药集团化学试剂有限公司(硅胶100-200目)，薄层层析板为烟台芝罘实验化工产生产的HSGF 254型。

[0061] 实施例1

[0062] N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)-3-三氟甲基苯甲酰胺的制备(化合物1)

[0063] 将3-三氟甲基苯甲酸(475mg，2.5mmol)，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(525mg，2.76mmol)，1-羟基苯并三唑(350mg，2.6mmol)，加入到二氯甲烷(10ml)中，搅拌30min，再加入化合物II(1.0g，2.5mmol)，25-30℃下反应4h。反应液水洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸除溶剂，所得的粗品经柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/丙酮梯度洗脱)纯化，得白色固体化合物1(728mg)。熔点：168.9～173.3℃。ESI-MS：572(M++H)，594(M++Na)，610(M++K)。1HNMR/(CDCl3)δppm：8.051(1H，s，Ar-H)，7.979(1H，d，J＝7.6Hz，Ar-H)，7.831(1H，d，J＝7.6Hz，Ar-H)，7.602-7.641(1H，m，Ar-H)，6.836(1H，s，DMEP-H，H5)，6.596(1H，s，DMEP-H，H8)，6.351(2H，s，DMEP-H，H-2’，6’)，6.286(1H，d，J＝6.8Hz，NH)，
6.006(2H，d，J＝6.4Hz，DMEP-H，H13)，5.460-5.488(1H，m，DMEP-H，H4)，5.418(1H，s，OH，重水交换)，4.655(1H，d，J＝5.2Hz，DMEP-H，H1)，4.490-4.532(1H，m，DMEP-H，H11a)，3.871-
3.921(1H，m，DMEP-H，H11b)，3.816(6H，s，OCH3，H-7’，8’)，3.064-3.102(1H，m，DMEP-H，H3)，
2.922-2.970(1H，dd，J1＝4.8Hz，J2＝14.0Hz，DMEP-H，H2)。

[0064] 实施例2

[0065] 2-氯-N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)-3，4-二甲氧基苯甲酰胺(化合物2)的制备

[0066] 将2-氯-3，4-二甲氧基苯甲酸(216mg，1mmol)，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(191mg，1mmol)，1-羟基苯并三唑(135mg，1mmol)，加入到二氯甲烷(5ml)中。搅拌2h，再加入化合物II(399mg，1mmol)，25-30℃下反应4h。反应液水洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸除溶剂，所得的粗品经柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/丙酮梯度洗脱)纯化，得白色固体化合物2(308mg)。熔点：132.1～136.2℃。 ESI-MS：598(M++H)，620(M++Na)，1217(2M++Na)。1HNMR/(CDCl3)δppm：7.490(1H，d，J＝8.4Hz，Ar-H)，6.893(1H，d，J＝8.8Hz，Ar-H)，6.872(1H，s，DMEP-H，H5)，6.533(1H，s，DMEP-H，H8)，6.470(1H，d，J＝6.8Hz，NH)，6.325(2H，s，DMEP-H，H-2’，6’)，5.958-5.981(2H，dd，J1＝1.2Hz，J2＝8.4Hz，DMEP-H，H13)，5.416-5.445(1H，m，DMEP-H，H4)，5.394(1H，s，OH，重水交换)，4.600(1H，d，J＝4.8Hz，DMEP-H，H1)，4.474-4.516(1H，m，DMEP-H，H11a)，3.995-4.045(1H，m，DMEP-H，H11b)，3.908(3H，s，OCH3)，3.848(3H，s，OCH3)，3.789(6H，s，OCH3，H-7’，8’)，3.002-3.047(1H，m，DMEP-H，H3)，2.879-2.926(1H，dd，J1＝4.8Hz，J2＝14.0Hz，DMEP-H，H2)。

[0067] 实施例3

[0068] N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)-2，3，4-三甲氧基苯甲酰胺(化合物3)的制备

[0069] 将2，3，4-三甲氧基苯甲酸(212mg，1mmol)，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(191mg，1mmol)，1-羟基苯并三唑(135mg，1mmol)，加入到二氯甲烷(5ml)中。搅拌2h，再加入化合物II(399mg，1mmol)，25-30℃下反应4h。反应液水洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸除溶剂，所得的粗品经柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/丙酮梯度洗脱)纯化，得白色固体化合物3(298mg)。熔点：137.4～141.9℃。ESI-MS：594(M++H)，616(M++Na)，+ 1632(M+K)。HNMR/(CDCl3)δppm：8.078(1H，d，J＝6.8Hz，NH)，7.868(1H，d，J＝9.2Hz，Ar-H)，
6.846(1H，s，DMEP-H，H5)，6.800(1H，d，J＝8.8Hz，Ar-H)，6.558(1H，s，DMEP-H，H8)，6.344(2H，s，DMEP-H，H-2’，6’)，5.969(2H，s，DMEP-H，H13)，5.428-5.457(1H，m，DMEP-H，H4)，
5.392(1H，s，OH，重水交换)，4.630(1H，d，J＝5.2Hz，DMEP-H，H1)，4.454-4.495(1H，m，DMEP-H，H11a)，3.918(3H，s，OCH3)，3.864-3.898(1H，m，DMEP-H，H11b)，3.846(3H，s，OCH3)，3.827(3H，s，OCH3)，3.794(6H，s，OCH3，H-7’，8’)，3.007-3.051(1H，m，DMEP-H，H3)，2.878-2.925(1H，dd，J1＝4.8Hz，J2＝14.0Hz，DMEP-H，H2)。

[0070] 实施例4

[0071] 2-(2-氟苯基)-N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)乙酰胺(化合物4)[0072] 将2-二氟苯乙酸(160mg，1mmol)，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(191mg，1mmol)，1-羟基苯并三唑(135mg，1mmol)，加入到二氯甲烷(5mL)中。搅拌
30min，再加入化合物II(399mg，1mmol)，25-30℃下反应4h。反应液水洗，无水硫酸钠干燥。
过滤，减压蒸除溶剂，所得的粗品经柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/丙酮梯度洗脱)纯化，得白色固体化合物13(366mg)。熔点：154.5～157.8℃。ESI-MS：536(M++H)，553(M++NH4)，558(M++Na)，574(M++K)。1HNMR/(CDCl3)δppm：7.066-7.326(4H，m，Ar-H)，6.688(1H，s，DMEP-H，H5)，6.499(1H，s，DMEP-H，H8)，6.279(2H，s，DMEP-H，H-2’，6’)，5.967(2H，s，DMEP-H，H13)，
5.641(1H，d，J＝7.6Hz，NH)，5.374(1H，s，OH，重水交换)，5.191-5.220(1H，m，DMEP-H，H4)，
4.540(1H，d，J＝4.8Hz，DMEP-H，H1)，4.333-4.374(1H，m，DMEP-H，H11a)，3.763(6H，s，OCH3，H-7’，8’)，3.695-3.746(1H，m，DMEP-H，H11b)，3.621(2H，s，CH2)，2.897-2.932(1H，m，DMEP-H，H3)，2.679-2.727(1H，dd，J1＝5.2Hz，J2＝14.4Hz，DMEP-H，H2)。

[0073] 实施例5

[0074] 5-氯-2-羟基-N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)-4-(甲氧基甲氧基)苯甲酰胺(化合物5)

[0075] 将5-氯-2，4-二(甲氧基甲氧基)苯甲酸(830mg，3mmol)(WO2006/117669(2006)中“example 153”)，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(606mg，3.2mmol)，1-羟基苯并三唑(431mg，3.2mmol)，加入到二氯甲烷(10ml)中。搅拌3h，再加入化合物II(1273mg，3.2mmol)，25-30℃下反应过夜。反应液水洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸除溶剂，所得的粗品经柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/丙酮梯度洗脱)纯化，得白色固体化合物5(405mg)。熔点：160.9～165.4℃。ESI-MS：614(M++H)，631(M++NH4)，636(M++Na)，652(M++K)。1HNMR/(CDCl3)δppm：12.124(1H，s，OH，重水交换)，7.398(1H，s，，Ar-H)，6.802(1H，s，Ar-H)，6.789(1H，s，DMEP-H，H5)，6.557(1H，s，DMEP-H，H8)6.404(1H，d，J＝6.4Hz，NH，重水交换)，6.327(2H，s，DMEP-H，H-2’，6’)，5.996(2H，d，J＝4.0Hz，DMEP-H，H13)，5.409-
5.437(2H，m，DMEP-H，H4、OH，重水交换)，5.275(2H，s，CH2)，4.587(1H，d，J＝4.8Hz，DMEP-H，H1)，4.436-4.477(1H，m，DMEP-H，H11a)，3.836-3.885(1H，m，DMEP-H，H11b)，3.790(6H，s，OCH3，H-7’，8’)，3.516(3H，s，OCH3)，3.031-3.059(1H，m， DMEP-H，H3)，2.919-2.967(1H，dd，J1＝5.2Hz，J2＝14.4Hz，DMEP-H，H2)。

[0076] 实施例6

[0077] 5-氯-2，4-二羟基-N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)苯甲酰胺(化合物6)

[0078] 方法一：

[0079] 将5-氯-2，4-二羟基苯甲酸(188mg，1mmol)(Journal of the American Chemical Society，1935，1077-1078)，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(191mg，1mmol)，1-羟基苯并三唑(135mg，1mmol)，加入到二氯甲烷(5ml)中。搅拌3h，再加入化合物II(399mg，1mmol)，25-30℃下反应过夜。反应液水洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸除溶剂，所得的粗品经柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/丙酮梯度洗脱)纯化，得白色固体化合物6(138mg)。

[0080] 方法二：

[0081] 将化合物5(70mg)溶于异丙醇中(5ml)，再加入氯化锆(13mg)加热回流过夜。减压蒸除溶剂，残留物用乙酸乙酯溶解，水洗，无水硫酸钠干燥；抽虑除去无水硫酸钠，减压蒸除溶剂，得化合物6。(58mg)。熔点：174.5～179.7℃。ESI-MS：570(M++H)，592(M++Na)，608(M++K)。1HNMR/(CDCl3)δppm：12.024(1H，s，OH，重水交换)，7.298(1H，s，Ar-H)，6.792(1H，s，DMEP-H，H5)，6.688(1H，s，Ar-H)，6.613(1H，s，DMEP-H，H8)，6.324(2H，s，DMEP-H，H-2’，6’)，6.138(1H，d，J＝6.8Hz，NH)，5.997(2H，d，J＝4.8Hz，DMEP-H，H13)，5.900(1H，s，OH，重水交换)，5.390-5.417(2H，m，DMEP-H，H4、OH，重水交换)，4.634(1H，d，J＝4.4Hz，DMEP-H，H1)，
4.433-4.474(1H，m，DMEP-H，H11a)，3.829-3.880(1H，m，DMEP-H，H11b)，3.793(6H，s，OCH3，H-7’，8’)，3.028-3.055(1H，m，DMEP-H，H3)，2.893-2.941(1H，dd，J1＝4.8Hz，J2＝14.0Hz，DMEP-H，H2)。

[0082] 实施例7

[0083] 4-溴-N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)-3，5-二甲氧基苯甲酰胺(化合物7)

[0084] 将4-溴-2，5-二甲氧基苯甲酸(65mg，0.25mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(114mg，0.3mmol)，N，N-二异丙基乙胺(65mg，0.5mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(5ml)中搅拌均匀后，加入化合物II(100mg，0.25mmol)，25-30℃下反应5h。减压蒸除大部分溶剂，水洗，用二氯甲烷萃取；合并有机层，无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸除溶剂，所得的粗品经柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/丙酮梯度洗脱)纯化，得白色固体化合物7(99.2mg)。熔点：208.3～211.3℃。ESI-MS：644(M++H)，661(M++NH4)，666(M++Na)，682(M++K)。1HNMR/(CDCl3)δppm：6.939(1H，s，Ar-H)，6.847(1H，s，DMEP-H，H5)，6.661(1H，s，DMEP-H，H8)，6.356(2H，s，DMEP-H，H-2’，6’)，6.133(1H，d，J＝6.8Hz，NH，重水交换)，6.014(2H，d，J＝3.6Hz，DMEP-H，H13)，5.433-5.462(1H，m，DMEP-H，H4)，5.424(1H，s，OH，重水交换)，4.667(1H，d，J＝4.8Hz，DMEP-H，H1)，4.496-4.539(1H，m，DMEP-H，H11a)，3.886-
3.936(1H，m，DMEP-H，H11b)，3.980(6H，s，Ar-OCH3)，3.825(6H，s，OCH3，H-7’，8’)，3.060-
3.099(1H，m，DMEP-H，H3)，2.922-2.970(1H，dd，J1＝4.8Hz，J2＝14.0Hz，DMEP-H，H2)。

[0085] 实施例8

[0086] N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)-4-三氟甲基苯甲酰胺(化合物8)

[0087] 将4-三氟甲基苯甲酸(190mg，1mmol)，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(191mg，1mmol)，1-羟基苯并三唑(135mg，1mmol)，加入到二氯甲烷(5ml)中。搅拌30min，再加入化合物II(399mg，1mmol)。25-30℃下反应4h。反应液水洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸除溶剂，所得的粗品经柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/丙酮梯度洗脱)纯化，得白色固体化合物8(330mg)。熔点：181.5～183.2℃。ESI-MS：572(M++H)，589(M++NH4)，594(M++Na)，610(M++K)。1HNMR/(CDCl3)δppm：7.912(2H，d，J＝7.6Hz，Ar-H)，7.748(2H，d，J＝7.6Hz，Ar-H)，6.838(1H，s，DMEP-H，H5)，6.598(1H，s，DMEP-H，H8)，6.352(2H，s，DMEP-H，H-2’，6’)，6.276(1H，d，J＝6.8Hz，NH，重水交换)，6.010(2H，d，J＝7.2Hz，DMEP-H，H13)，
5.454-5.482(1H，m，DMEP-H，H4)，5.426(1H，s，OH，重水交换)，4.655(1H，d，J＝4.8Hz，DMEP-H，H1)，4.498-4.539(1H，m，DMEP-H，H11a)，3.875-3.925(1H，m，DMEP-H，H11b)，3.820(6H，s， OCH3，H-7’，8’)，3.066-3.103(1H，m，DMEP-H，H3)，2.909-2.958(1H，dd，J1＝5.2Hz，J2＝
14.4Hz，DMEP-H，H2)。

[0088] 实施例9

[0089] 4-羟基-N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)-3-甲基苯甲酰胺(化合物9)

[0090] 将4-羟基-3-甲基苯甲酸(152mg，1mmol)，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(191mg，1mmol)，1-羟基苯并三唑(135mg，1mmol)，加入到二氯甲烷(5ml)中。搅拌30min，再加入化合物II(399mg，1mmol)。25-30℃下反应4h。反应液水洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸除溶剂，所得的粗品经柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/丙酮梯度洗脱)纯化，得白色固体化合物9(107mg)。熔点：135.5～137.4补℃。ESI-MS：534(M++H)，551(M++NH4)，556(M++Na)，572(M++K)。1HNMR/(CDCl3)δppm：7.560(1H，d，J＝2.0Hz，Ar-H)，7.464-7.491(1H，dd，J1＝2.4Hz，J2＝8.4Hz，Ar-H)，6.770(1H，d，J＝8.8Hz，Ar-H)，6.804(1H，s，DMEP-H，H5)，6.533(1H，s，DMEP-H，H8)，6.222(1H，d，J＝6.8Hz，NH)，6.317(2H，s，DMEP-H，H-
2’，6’)，5.962(2H，d，J＝6.0Hz，DMEP-H，H13)，5.389-5.417(2H，m，DMEP-H，H4、OH，重水交换)，4.587(1H，d，J＝4.8Hz，DMEP-H，H1)，4.433-4.473(1H，m，DMEP-H，H11a)，3.853-3.902(1H，m，DMEP-H，H11b)，3.770(6H，s，OCH3，H-7’，8’)，2.915-3.029(2H，m，DMEP-H，H2、H3)，
2.259(3H，s，CH3)。

[0091] 实施例10

[0092] 4-溴-3，5-二羟基-N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)-苯甲酰胺(化合物10)

[0093] 将4-溴-2，5-二羟基苯甲酸(233mg，1mmol)，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(210mg，1.1mmol)，1-羟基苯并三唑(150mg，1.1mmol)，溶于N，N-二甲基甲酰胺(5ml)中。搅拌3h，再加入化合物II(399mg，1mmol)，25-30℃下反应过夜。减压蒸除大部分溶剂，水洗，用二氯甲烷萃取。合并有机层，无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸除溶剂，所得的粗品经柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/丙酮梯度洗脱)纯化，得白色固体化合物10+ + 1(275mg)。熔点：207.9～210.7℃。ESI-MS：612(M -H)，614(M+H)。HNMR/(CDCl3)δppm ：
7.032(2H，s，Ar-H)，6.819(1H，s，DMEP-H，H5)，6.578(1H，s，DMEP-H， H8)，6.350(2H，s，DMEP-H，H-2’，6’)，6.253(1H，s，NH，)，6.012(2H，d，J＝6.8Hz，DMEP-H，H13)，5.401-5.429(2H，m，DMEP-H，H4，OH，重水交换)，4.637(1H，d，J＝4.8Hz，DMEP-H，H1)，4.461-4.501(1H，m，DMEP-H，H11a)，3.845-3.895(1H，m，DMEP-H，H11b)，3.823(6H，s，OCH3，H-7’，8’)，3.639(1H，s，OH)，2.942-3.079(2H，m，DMEP-H，H2、H3)。

[0094] 实施例11

[0095] N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺(化合物11)

[0096] 将4-甲氧基苯乙酸(166mg，1mmol)，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(191mg，1mmol)，1-羟基苯并三唑(135mg，1mmol)，加入到二氯甲烷(5ml)中。搅拌30min，再加入化合物II(399mg，1mmol)，25-30℃下反应4h。反应液水洗，无水硫酸钠干燥。
过滤，减压蒸除溶剂，所得的粗品经柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/丙酮梯度洗脱)纯化，得白色固体化合物11(353mg)。熔点：138.5～143.4℃。ESI-MS：548(M++H)，565(M++NH4)，570(M++Na)。1HNMR/(CDCl3)δppm：6.772-7.273(4H，m，Ar-H)，6.638(1H，s，DMEP-H，H5)，6.468(1H，s，DMEP-H，H8)，6.257(2H，s，DMEP-H，H-2’，6’)，5.946(2H，d，J＝4.4Hz，DMEP-H，H13)，5.497(1H，d，J＝7.2Hz，NH)，5.362(1H，s，OH，重水交换)，5.179-5.208(1H，m，DMEP-H，H4)，4.498(1H，d，J＝5.2Hz，DMEP-H，H1)，4.345-4.386(1H，m，DMEP-H，H11a)，3.783(3H，s，OCH3)，
3.755(6H，s，OCH3，H-7’，8’)，3.691-3.741(1H，m，DMEP-H，H11b)，3.577(2H，s，CH2)，2.880-
2.908(1H，m，DMEP-H，H3)，2.581-2.628(1H，dd，J1＝4.8Hz，J2＝14.0Hz，DMEP-H，H2)。

[0097] 实施例12

[0098] 2-(2，4-二氟苯基)-N-((5S，5aS，8aR，9R)-9-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-8-氧代-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并[3’，4’：6，7]萘并[2，3-d][1，3]二氧5环-5-基)乙酰胺(化合物12)

[0099] 将2，4-二氟苯乙酸(177mg，1mmol)，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(191mg，1mmol)，1-羟基苯并三唑(135mg，1mmol)，加入到二氯甲烷(5mL)中。搅拌30min，再加入化合物II(399mg，1mmol)，25-30℃下反应4h。反应液水洗， 无水硫酸钠干燥。
过滤，减压蒸除溶剂，所得的粗品经柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/丙酮梯度洗脱)纯化，得+ +
白色固体化合物12(196mg)。熔点：159.6～162.3℃。ESI-MS：554(M+H)，571(M+NH4)，576(M++Na)，592(M++K)。1HNMR/(CDCl3)δppm：6.825-7.308(3H，m，Ar-H)，6.673(1H，s，DMEP-H，H5)，6.502(1H，s，DMEP-H，H8)，6.273(2H，s，DMEP-H，H-2’，6’)，5.980(2H，d，J＝0.8Hz，DMEP-H，H13)，5.600(1H，d，J＝7.6Hz，NH)，5.367(1H，s，OH，重水交换)，5.176-5.205(1H，m，DMEP-H，H4)，4.548(1H，d，J＝4.8Hz，DMEP-H，H1)，4.333-4.374(1H，m，DMEP-H，H11a)，3.763(6H，s，OCH3，H-7’，8’)，3.697-3.747(1H，m，DMEP-H，H11b)，3.561(2H，s，CH2)，2.900-2.929(1H，m，DMEP-H，H3)，2.699-2.748(1H，dd，J1＝4.8Hz，J2＝14.0Hz，DMEP-H，H2)。

[0100] 实施例13

[0101] MTT法测定各化合物对不同肿瘤细胞的敏感性

[0102] 收获对数生长期细胞，计数后调整浓度至20×104/ml，96孔板，每孔加90μl细胞悬液。药物按比例稀释后10μl/孔加样，计算终浓度。混匀后37℃、5％CO2培养箱中培养48小时后，加5mg/ml MTT(PBS)溶液20μl/孔，37℃、5％CO2培养箱中再培养4小时后，加溶解液(10％SDS，5％异丁醇，0.02M HCl)100μl/孔，37℃、5％CO2培养箱中放置过夜。次日观察各孔中沉淀完全溶解即可用酶标仪在570nm测定OD值。

[0103] 结果分析：抑制率％＝(对照孔OD-测试孔OD)/对照孔OD×100％

[0104] 与浓度对数进行回归，计算IC50。

[0105] 各化合物对不同肿瘤细胞的敏感性

[0106]

[0107] 实施例14

[0108] MTT法测定化合物2、化合物5、化合物6，对不同肿瘤细胞的敏感性

[0109] 收获对数生长期细胞，计数后调整浓度至20×104/ml，96孔板，每孔加90μl细胞悬液。化合物按比例稀释后10μl/孔加样，计算终浓度。混匀后37℃、5％CO2培养箱中培养48小时后，加5mg/ml MTT(PBS)溶液20μl/孔，37℃、5％CO2培养箱中再培养4小时后，加溶解液(10％SDS，5％异丁醇，0.02M HCl)100μl/孔，37℃、5％CO2培养箱中放置过夜。次日观察各孔中沉淀完全溶解即可用酶标仪在570nm测定OD值。

[0110] 结果分析：抑制率％＝(对照孔OD-测试孔OD)/对照孔OD×100％

[0111] 与浓度对数进行回归，计算IC50。

[0112] 化合物2，化合物5，化合物6对不同肿瘤细胞的敏感性

[0113]

[0114] 实施例15

[0115] 化合物1及化合物2对ICR小鼠S180移植瘤的药效学研究

[0116] 取生长旺盛期的小鼠S180腹水瘤3只，无菌条件下抽取腹水，用生理盐水稀释至2×107，按0.2ml/只给小鼠腋皮下接种。次日将小鼠随机均分为11组，每组6只。

[0117] 分别为空白对照组、化合物1 1.5mg/kg组、3mg/kg组、6mg/kg组；化合物21.5mg/kg组、3mg/kg组、6mg/kg组；VP-163mg/kg组。

[0118] 各组小鼠均为尾静脉注射给药，给药体积0.5ml/20克，接种次日起每天给药一次。并于接种后第10天处死解剖剥离肿瘤并称重，计算抑瘤率。

[0119]

[0120] 化合物1及化合物2ICR小鼠S180移植瘤的药效学研究

[0121] 化合物26mg/kg组连续给药5天后出现明显毒性反应，第7天死亡2只，剩余动物体重明显减轻。

[0122]

[0123] 实施例16

[0124] 化合物5对ICR小鼠S180移植瘤的药效学研究

[0125] 取生长旺盛期的小鼠S180腹水瘤3只，无菌条件下抽取腹水，用生理盐水稀释至2×107，按0.2ml/只给小鼠腋皮下接种。次日将小鼠随机均分为8组，每组6只。

[0126] 分别为空白对照组，化合物5 15mg/kg组、30mg/kg组、60mg/kg组；VP-16 10mg/kg组。

[0127] 各组小鼠均为尾静脉注射给药，给药体积0.5ml/20克，接种次日起每天给药一次。并于接种后第10天处死解剖剥离肿瘤并称重，计算抑瘤率。

[0128]

[0129] 化合物5对ICR小鼠S180移植瘤的药效学研究：

[0130] VP-16 10mg/kg组开始给药后第5天后出现明显毒性反应，第6天死亡3只，剩余3只第7天全部死亡。

[0131]

[0132] 实施例17

[0133] 化合物2及化合物5对ICR小鼠S180移植瘤的药效学研究

[0134] 取处于对数生长期的的K111细胞，稀释至25×104个/ml，每只小鼠(C57BL/6小鼠)静脉注射0.2mL，随机分组，设相应溶剂对照组和环磷酰胺阳性对照组(30mg/kg/d，ip×7d)，样品I-1给药组为40mg/kg，次日起给药，连续静脉注射14天，第21天脱颈椎处死，取肺脏，计数转移灶数。

[0135]

[0136] VP-16 10mg/kg组开始给药后第5天后出现明显毒性反应，第6天死亡3只，剩余3只第7天全部死亡。

[0137]

[0138]

[0139] 实施例18

[0140] 化合物5对F1小鼠C26移植瘤的药效学研究

[0141] 取生长旺盛期的F1小鼠C26实体瘤3只，无菌条件下解剖取瘤块，匀浆为细胞悬液，用生理盐水稀释至2×107，按0.2ml/只给小鼠腋皮下接种。次日将小鼠随机均分为11组，每组6只。

[0142] 分别为空白对照组、化合物5 15mg/kg组、30mg/kg组、60mg/kg组；VP-16 3mg/kg组。

[0143] 各组小鼠均为尾静脉注射给药，给药体积0.5ml/20克，接种次日起每天给药一次。并于接种后第10天处死解剖剥离肿瘤并称重，计算抑瘤率。

[0144]

[0145] 化合物5对F1小鼠C26移植瘤的药效学研究

[0146]

[0147] 实施例19

[0148] 化合物5小鼠静脉注射急性毒性试验

[0149] 小鼠初测毒试验

[0150] 实验方法：

[0151] 取18-20g雌性和雄性KM小鼠各15只，适应一周后，随机分为5组，分别为化合 物5的1g/kg，500mg/kg，250mg/kg，125mg/kg，62.5mg/kg，分别按标示量腹腔单次给药，观测其死亡情况和体重变化以及生存状态等。

[0152] 经bliss法计算出LD50值为222mg/kg。

[0153] 实施例20

[0154] 片剂： 

[0155] 制备方法：

[0156] 将本发明的化合物与淀粉、糖粉充分混合均匀，用10％淀粉浆混和制粒，60℃以下通风干燥，加入硬脂酸镁，整粒，混匀，压片，即得。

[0157] 实施例21

[0158] 片剂： 

[0159] 制备方法同实施例20。

[0160] 实施例22

[0161] 片剂：