丹参酮ⅡA衍生物及其制备和应用

摘要

本发明涉及丹参酮ⅡA衍生物及其制备和应用。本发明所提供的丹参酮ⅡA衍生物如式（I）所示本发明所提供的丹参酮ⅡA衍生物在心血管疾病的治疗，肝、肾疾病的治疗，呼吸系统疾病的治疗，肿瘤的治疗，脑血管疾病的治疗中，均具有良好的治疗效果，且对光、酸、碱、高温均较稳定。

权利要求

1.丹参酮ⅡA衍生物，如式（I）所示：

2.制备权利要求1所述丹参酮ⅡA衍生物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）取1重量份的丹参酮ⅡA、15～50重量份的二氯甲烷和1.5～4重量份的锌粉混合，得溶液1；

（2）在10～40重量份的水中溶解1～4重量份的氢氧化钾和0.5～1.5重量份的四丁基硫酸氢铵，得溶液2；

（3）将溶液1和溶液2混合，密封条件下，加热条件下反应，反应温度为60～100℃，反应时间为4～6小时；

（4）取反应液中的有机相，用水洗至中性，蒸干，得残留物1。

3.权利要求2所述方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）取1重量份的丹参酮ⅡA、15～20重量份的二氯甲烷和1.5～2.5重量份的锌粉混合，得溶液1；

（2）在10～20重量份的水中溶解1～2重量份的氢氧化钾和0.5～1重量份的四丁基硫酸氢铵，得溶液2；

（3）将溶液1和溶液2混合，密封条件下，加热反应；

（4）取反应液中的有机相，用水洗至中性，蒸干，得残留物1。

4.权利要求2所述方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）取1重量份的丹参酮ⅡA、15重量份的二氯甲烷和2重量份的锌粉混合，得溶液1；

（2）在10重量份的水中溶解1.2重量份的氢氧化钾和0.8重量份的四丁基硫酸氢铵，得溶液2；

（3）将溶液1和溶液2混合，密封条件下，加热反应；

（4）取反应液中的有机相，用水洗至中性，蒸干，得残留物1。

5.权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤（3）中的反应温度为80～90℃，反应时间为5～6小时。

6.权利要求2所述方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：（5）取步骤（4）得到的残留物1，加溶剂溶解，脱色过滤，经冷却、析晶、过滤、洗涤后干燥。

7.权利要求6所述方法，其特征在于，步骤（5）所述溶剂是乙醇、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷或其任意比混合溶剂。

8.权利要求1所述丹参酮ⅡA衍生物在制备治疗心血管疾病药物，治疗肝、肾疾病药物，治疗呼吸系统疾病药物，治疗肿瘤药物中的应用。

说明书

丹参酮ⅡA衍生物及其制备和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及丹参酮ⅡA衍生物及其制备和应用。

背景技术

[0002] 现代医学临床应用表明，丹参酮ⅡA在心血管疾病的治疗，肝、肾疾病的治疗，呼吸系统疾病的治疗，肿瘤的治疗，脑血管疾病的治疗，具有良好的治疗效果。

[0003] 目前，已有的商品是丹参酮ⅡA磺酸钠注射液，丹参注射液，丹参片，丹参胶囊，丹参酮胶囊，丹参颗粒，丹参膏，丹参冲剂，注射用丹参多酚酸盐等。

[0004] 丹参酮ⅡA和丹参酮ⅡA磺酸钠注射液的缺陷主要有：在丹参酮ⅡA在溶液中对光极敏感，会发生光化反应，生成多种产物，丹参酮ⅡA磺酸钠注射液在较低温度贮藏下会有析出结晶的倾向，这对于注射用药，特别是静脉注射用药来说，存在一定的安全隐患。

发明内容

[0005] 为了解决现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供一种丹参酮ⅡA衍生物及其制备和应用。

[0006] 本发明涉及一种丹参酮ⅡA衍生物，如式（I）所示：

[0007]

[0008] 本发明还涉及制备上述参酮ⅡA衍生物的方法，所述方法包括如下步骤：

[0009] （1）取1重量份的丹参酮ⅡA，与15～50重量份，优选15～20重量份，最优选15重量份的二氯甲烷，和1.5～4重量份，优选1.5～2.5重量份，最优选2重量份的锌粉混合，得溶液1；

[0010] （2）在10～40重量份的水中溶解1～4重量份，优选1～2重量份，最优选1.2重量份的氢氧化钾和0.5～1.5重量份，优选0.5～1重量份，最优选0.8重量份的四丁基硫酸氢铵，得溶液2；

[0011] （3）将溶液1和溶液2混合，密封条件下，加热条件下反应，反应温度优选为60～100℃，更优选为80～90℃，反应时间优选为4～6小时，更优选为5～6小时；

[0012] （4）取反应液中的有机相，用水洗至中性，蒸干，得残留物1。

[0013] 以上方法还可包括步骤（5）：取步骤（4）得到的残留物1，加溶剂溶解，脱色过滤，经冷却、析晶、过滤、洗涤后干燥。所述溶剂优选乙醇、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷或其任意比混合溶剂，更优选四氢呋喃或四氢呋喃和乙醇的混合溶剂。

[0014] 本发明涉及上述方法制备的化合物，如式（I）所示：

[0015]

[0016] 本发明还涉及上述丹参酮ⅡA衍生物在制备治疗心血管疾病药物，治疗肝、肾疾病药物，治疗呼吸系统疾病药物，治疗肿瘤药物以及治疗脑血管疾病药物中的应用。

具体实施方式

[0017] 以下列举实施例具体说明本发明的制备方法及其应用。但本发明并不限于下述实施例。

[0018] 实施例1

[0019] 本实施例的的制备方法，包括如下步骤：

[0020] （1）在5升高压反应釜中加入120克丹参酮ⅡA，1800克二氯甲烷，240克锌粉，搅拌溶解；

[0021] （2）在3000毫升烧杯中加入1200克水，144克氢氧化钾，96克四丁基硫酸氢铵，搅拌溶解；

[0022] （3）将步骤（2）制成的溶液加入到步骤（1）制成的溶液中，密闭高压反应釜，加热升温，于80～90℃下强力搅拌反应5-6小时；

[0023] （4）反应结束，将反应液冷却至35℃以下，打开釜盖，抽出反应液，过滤，滤液静置分层，分去水层，要有机层，有机层每次用1200毫升水洗涤，测水层PH值，直至洗涤水中PH值7为止，有机层蒸干，加500毫升四氢呋喃加热溶解，加8克活性炭回流脱色40分钟，过滤，滤液冷却、析晶、过滤、洗涤得湿品103克。

[0024] 103克湿品加400毫升四氢呋喃加热溶解，加6克活性炭回流脱色30分钟，过滤，滤液冷却、析晶、过滤、洗涤得湿品76克，真空干燥，得微红色干品58克。收率46%。熔点：180～182℃。高效液相色谱面积归一化法纯度99.2%。

[0025] 经核磁共振检测、质谱检测、红外检测、紫外检测和元素分析，确定该微红色干品的结构式如式（I）所示，命名为3,8,8-三甲基3,4-亚甲二氧基5,6,7,8四氢菲并[1,2a]呋喃。

[0026]

[0027] 实施例2

[0028] 本实施例的的制备方法，包括如下步骤：

[0029] （1）在5升高压反应釜中加入120克丹参酮ⅡA，2400克二氯甲烷，300克锌粉，搅拌溶解；

[0030] （2）在3000毫升烧杯中加入2400克水，240克氢氧化钾，120克四丁基硫酸氢铵，搅拌溶解；

[0031] （3）将步骤（2）制成的溶液加入到步骤（1）制成的溶液中，密闭高压反应釜，加热升温，于80～90℃下强力搅拌反应5-6小时；

[0032] （4）反应结束，将反应液冷却至35℃以下，打开釜盖，抽出反应液，过滤，滤液静置分层，分去水层，要有机层，有机层每次用1200毫升水洗涤，测水层PH值，直至洗涤水中PH值7为止，有机层蒸干，加500毫升四氢呋喃加热溶解，加8克活性炭回流脱色40分钟，过滤，滤液冷却、析晶、过滤、洗涤得湿品101克。

[0033] 101克湿品加400毫升四氢呋喃加热溶解，加6克活性炭回流脱色30分钟，过滤，滤液冷却、析晶、过滤、洗涤得湿品73克，真空干燥，得微红色干品56克。收率44%。熔点：180～182℃。高效液相色谱面积归一化法纯度99.1%。

[0034] 经核磁共振检测、质谱检测、红外检测、紫外检测和元素分析，确定该微红色干品的结构式如式（I）所示，命名为3,8,8-三甲基3,4-亚甲二氧基5,6,7,8四氢菲并[1,2a]呋喃。

[0035]

[0036] 实施例3

[0037] 本实施例的制备方法，包括如下步骤：

[0038] （1）在5升高压反应釜中加入50克丹参酮ⅡA，2500克二氯甲烷，200克锌粉，搅拌溶解；

[0039] （2）在3000毫升烧杯中加入2000克水，200克氢氧化钾，75克四丁基硫酸氢铵，搅拌溶解；

[0040] （3）将步骤（2）制成的溶液加入到步骤（1）制成的溶液中，密闭高压反应釜，加热升温，于110～120℃下强力搅拌反应8小时；

[0041] （4）反应结束，将反应液冷却至35℃以下，打开釜盖，抽出反应液，过滤，滤液静置分层，分去水层，要有机层，有机层每次用1000毫升水洗涤，测水层PH值，直至洗涤水中PH值7为止，有几层蒸干，加2500毫升乙醇加热溶解，加12克活性炭回流脱色40分钟，过滤，滤液蒸去1800毫升乙醇，冷却、析晶、过滤、洗涤得湿品60克。

[0042] 60克湿品加400毫升二氯甲烷加热溶解，加4克活性炭回流脱色30分钟，过滤，滤液中加入乙醇2000毫升，冷却、析晶、过滤、洗涤得湿品32克，真空干燥，得微红色干品22克。收率42%。熔点：179～182℃。高效液相色谱面积归一化法纯度99.0%。

[0043] 经核磁共振检测、质谱检测、红外检测、紫外检测和元素分析，确定该微红色干品的结构式如式（I）所示，命名为3,8,8-三甲基3,4-亚甲二氧基5,6,7,8四氢菲并[1,2a]呋喃。

[0044]

[0045] 实施例4

[0046] 本实施例的制备方法，包括如下步骤：

[0047] （1）在5升高压反应釜中加入60克丹参酮ⅡA，900克二氯甲烷，90克锌粉，搅拌溶解；

[0048] （2）在1000毫升烧杯中加入600克水，60克氢氧化钾，30克四丁基硫酸氢铵，搅拌溶解；

[0049] （3）将步骤（2）制成的溶液加入到步骤（1）制成的溶液中，密闭高压反应釜，加热升温，于60～100℃下强力搅拌反应4～6小时；

[0050] （4）反应结束，将反应液冷却至35℃以下，打开釜盖，抽出反应液，过滤，滤液静置分层，分去水层，要有机层，有机层每次用800毫升水洗涤，测水层PH值，直至洗涤水中PH值8为止，有几层蒸干，加2500毫升甲醇加热溶解，加10克活性炭回流脱色40分钟，过滤，滤液蒸去2000毫升甲醇，冷却、析晶、过滤、洗涤得湿品60克。

[0051] 60克湿品加2500毫升甲醇加热溶解，加6克活性炭回流脱色30分钟，过滤，滤液蒸去2000毫升甲醇，冷却、析晶、过滤、洗涤得湿品48克，真空干燥，得橙红色干品37克。收率58％。熔点：155～157℃。高效液相色谱面积归一化法纯度96.7%。

[0052] 经核磁共振检测、质谱检测、红外检测、紫外检测和元素分析，确定该微红色干品的结构式如式（I）所示，命名为3,8,8-三甲基3,4-亚甲二氧基5,6,7,8四氢菲并[1,2a]呋喃。

[0053]

[0054] 实施例5

[0055] 本实施例的制备方法，包括如下步骤：

[0056] （1）在1000毫升四口反应瓶中加入10克丹参酮ⅡA，200克二氯甲烷，30克锌粉，搅拌溶解；

[0057] （2）在500毫升烧杯中加入100克水，12克氢氧化钾，8克四丁基硫酸氢铵，搅拌溶解；

[0058] （3）将步骤（2）制成的溶液加入到步骤（1）制成的溶液中，30～120℃搅拌反应4～8小时；

[0059] （4）反应结束，将反应液过滤，滤液静置分层，分去水层，要有机层，有机层每次用200毫升水洗涤，测水层PH值，直至洗涤水中PH值7为止，有几层蒸干，加200毫升四氢呋喃加热溶解，加4克活性炭回流脱色45分钟，过滤，滤液冷却、析晶、过滤、洗涤得湿品6克。

[0060] 6克湿品加60毫升四氢呋喃加热溶解，加2克活性炭回流脱色35分钟，过滤，滤液冷却、析晶、过滤、洗涤得湿品3克，真空干燥，得微红色干品2.5克。收率24%。熔点：180～183℃。高效液相色谱面积归一化法纯度99.0%。

[0061] 经核磁共振检测、质谱检测、红外检测、紫外检测和元素分析，确定该微红色干品的结构式如式（I）所示，命名为3,8,8-三甲基3,4-亚甲二氧基5,6,7,8四氢菲并[1,2a]呋喃。

[0062]

[0063] 实施例6

[0064] 本实施例的制备方法，包括如下步骤：

[0065] （1）在1000毫升四口反应瓶中加入10克丹参酮ⅡA，500克二氯甲烷，40克锌粉，搅拌溶解；

[0066] （2）在1000毫升烧杯中加入400克水，40克氢氧化钾，15克四丁基硫酸氢铵，搅拌溶解；

[0067] （3）将步骤（2）制成的溶液加入到步骤（1）制成的溶液中，加热升温，强力搅拌，回流反应8小时；

[0068] （4）反应结束，将反应液过滤，滤液静置分层，分去水层，要有机层，有机层每次用300毫升水洗涤，测水层PH值，直至洗涤水中PH值7为止，有几层蒸干，加2000毫升乙醇加热溶解，加5克活性炭回流脱色45分钟，过滤，滤液蒸去乙醇1500毫升，冷却、析晶、过滤、洗涤得湿品8克。

[0069] 8克湿品加1000毫升乙醇加热溶解，加3克活性炭回流脱色35分钟，过滤，滤液蒸去乙醇800毫升，冷却、析晶、过滤、洗涤得湿品6克，真空干燥，得橙红色干品5克。收率47%。熔点：151～153℃。高效液相色谱面积归一化法纯度94.8%。

[0070] 经核磁共振检测、质谱检测、红外检测、紫外检测和元素分析，确定该微红色干品的结构式如式（I）所示，命名为3,8,8-三甲基3,4-亚甲二氧基5,6,7,8四氢菲并[1,2a]呋喃。

[0071]

[0072] 实施例7

[0073] 本实施例的制备方法，包括如下步骤：

[0074] （1）在1000毫升四口反应瓶中加入10克丹参酮ⅡA，150克二氯甲烷，15克锌粉，搅拌溶解；

[0075] （2）在500毫升烧杯中加入100克水，10克氢氧化钾，5克四丁基硫酸氢铵，搅拌溶解；

[0076] （3）将步骤（2）制成的溶液加入到步骤（1）制成的溶液中，加热升温，强力搅拌，回流反应4小时；

[0077] （4）反应结束，将反应液过滤，滤液静置分层，分去水层，要有机层，有机层每次用100毫升水洗涤，测水层PH值，直至洗涤水中PH值7为止，有几层蒸干，加2000毫升乙醇加热溶解，加5克活性炭回流脱色45分钟，过滤，滤液蒸去乙醇1700毫升，冷却、析晶、过滤、洗涤得湿品9克。

[0078] 9克湿品加1200毫升乙醇加热溶解，加4克活性炭回流脱色35分钟，过滤，滤液蒸去乙醇1000毫升，冷却、析晶、过滤、洗涤得湿品7克，真空干燥，得橙红色干品6克。收率57%。熔点：148～157℃。高效液相色谱面积归一化法纯度87.6%。

[0079] 经核磁共振检测、质谱检测、红外检测、紫外检测和元素分析，确定该微红色干品的结构式如式（I）所示，命名为3,8,8-三甲基3,4-亚甲二氧基5,6,7,8四氢菲并[1,2a]呋喃。

[0080]

[0081] 实施例8

[0082] 对本发明所提供的式（I）所示化合物进行各种效果验证实验。

[0083] 对大鼠肢体缺血再灌注损伤的影响

[0084] 方法：

[0085] 健康雄性Wistar大鼠48只，体重（210±20）g，由山西医科大学动物实验中心提供，动物合格证号为医动字第070101。将大鼠随机分为三组，每组16只，分别为试验组、对照组、假手术组。试验组于术前3、2、1d及术前30min，给予腹腔注射丹参酮I IA衍生物注射液（20mg/kg）；同时对照组及假手术组给予腹腔注射等量生理盐水。术前大鼠禁食12h，自由饮水，采用乌拉坦（40mg/100g）腹腔注射麻醉，取腹部正中切口，分离出腹主动脉，在髂总动脉分叉处上方0.5cm处用动脉夹阻断腹主动脉，以远端动脉变扁及搏动消失为标准，阻断2h后，再灌注4h。假手术组不做腹主动脉阻断，其他步骤同试验组。

[0086] 结果：

[0087] 丹参酮对血清SOD(超氧化物歧化酶)活性和MDA(丙二醛)含量的影响如下：缺血2h及再灌注4h，与对照组比较，假手术组血清SOD活性均升高（P<0.05），MDA含量均减少（P<0.05）。对照组大鼠再灌注4h与缺血2h比较，血清SOD活性进一步降低（P<0.05），MDA含量进一步增多（P<0.05）；而试验组大鼠再灌注4h与缺血2h血清SOD活性和MDA含量无明显变化（P>0.05）。结果见表1。

[0088] 表1：各组大鼠血清SOD活性和MDA含量比较

[0089]

[0090] 注：与对照组比较，*P<0.05；与缺血2h比较，ΔP<0.05

[0091] 以上试验结果表明,本化合物对心血管疾病具有一定的疗效.

[0092] 对雌激素受体阴性人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）的生长抑制作用

[0093] 细胞增殖抑制试验（MTT法）：

[0094] 取对数生长期细胞，细胞浓度为5×105/ml，接种于96孔培养板中，每孔100μl。24h后，加入含不同浓度丹参酮IIA衍生物（终浓度分别为0、0.0625、0.125、0.25、0.5、
1.0μg/ml）的新培养基100μl，设丹参酮IIA衍生物0μg/ml为空白对照，5-氟尿嘧啶
10μg/ml为阳性对照，每浓度4个复孔，分别作用24、48、72、96h后，加入新配置的MTT液，置37℃、5%CO2培养箱内培养作用6h，加入二甲基亚砜，15min后，酶标仪于570nm处测吸光度值A570。取4个复孔平均值，计算细胞抑制率及I C50。根据公式：细胞抑制率（%）=（1-实验组A570/对照组A570）×100%。实验重复3次。

[0095] 克隆形成实验：

[0096] 调整MDA-MB-231细胞浓度，按5×102/孔接种于6孔板，培养过夜使细胞贴壁，次日分别用不同剂量的丹参酮I IA衍生物(0.0625、0.125、0.25μg/ml)处理细胞，对照组不处理，每个剂量组设4个复孔，置37℃、5%CO2培养箱内培养作用12d，甲醇固定，Giemsa染色，低倍镜下观察克隆形成（以﹥50个细胞为标准），计数各克隆数，取其平均值，实验重复3次。

[0097] 结果：

[0098] 丹参酮IIA衍生物对MDA-MB-231的生长抑制作用与空白对照呈正常对数增长。各实验组丹参酮IIA对MDA-MB-231的增殖有明显抑制作用，呈浓度、时间依赖性（见表2），半效抑制浓度（IC50）为0.125μg/ml。

[0099] 丹参酮IIA衍生物对肿瘤细胞克隆形成的抑制作用：

[0100] 对照组MDA-MB-231细胞克隆形成数为236±11，用0.0625、0.125、0.25μg/ml丹参酮IIA衍生物处理后，克隆形成数分别为112±7、63±5、32±3，与空白对照组相比差异均有统计学意义（P﹤0.05）,其抑制作用呈剂量-效应关系。

[0101] 表2：各组不同时间点MDA-MB-231抑制率比较

[0102]

[0103] 与24h对照组比较aP﹤0.05；与48h对照组比较bP﹤0.05

[0104] 该试验结果表明,本化合物对癌细胞（MDA-MB-231）的生长具有一定的抑制作用.[0105] 对小鼠免疫性肝损伤的保护作用

[0106] 健康KM小鼠60只，随机分为6组，即为正常对照组，模型组，联苯双酯150mg/kg组，丹参酮I IA衍生物组（30,20,10mg/kg），每组10只。各给药组灌胃（每10g给予0.2ml）给予相应药物，正常对照组和模型组灌胃给予等量生理盐水，每日1次，15d后，除正常对照组外，其余各组均尾静脉注射20mg/kg刀豆A，禁食12h后，全部动物摘眼球取全血，其中一部分血液经16%肝素钠润过的EP管中制成抗凝血，另一部分离心（3000r/min，离心10min）取血清-20℃冻存备用。采用自动化生化分析仪测定血清中天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶(ALT)的活性，所有动物取肝脏并置入10%甲醛溶液中固定，进行病理组织学检查。

[0107] 结果：

[0108] （1）对免疫性肝损伤小鼠ALT、AST的影响：

[0109] 模型组小鼠血清中AST、ALT活性较正常对照组明显升高，与正常组比较差异有显著性（P＜0.01），说明造模成功；与模型组比较，丹参酮I IA衍生物20,30mg/kg组和联苯双酯组AST、ALT活性明显降低（P＜0.05或P＜0.01），而丹参酮I IA衍生物10mg/kg组AST、ALT活性的降低均无统计学意义，说明丹参酮I IA衍生物大和中剂量治疗组能明显降低免疫性肝损伤小鼠ALT和AST活性，见表3。

[0110] 表3：对免疫性肝损伤小鼠ALT、AST的影响

[0111]组别 剂量（mg/kg) AST(U/L) ALT(U/L)
正常组 187.25±50.5 85.06±23.3
模型组 480.21±166.41) 210.35±117.21)
实验组 30 205.16±82.23) 62.63±15.93)
20 319.94±110.32) 104.16±50.62)
10 378.29±144.1 123.96±52.2
联苯双酯组 150 257.46±50.23) 78.17±35.93)

[0112] 注：与正常组相比，1)P＜0.01；与模型组相比，2)P＜0.01，3)P＜0.01[0113] （2）对小鼠肝组织病理变化的影响：

[0114] 光镜下观察显示，与正常对照组比较，刀豆蛋白A注射12h后模型组可见肝小叶内炎症细胞呈围管性浸润，肝窦淤血，肝细胞变性、水肿，少量肝细胞凋亡和坏死；与模型组比较，丹参酮IIA衍生物30mg/kg组和联苯双酯组小鼠肝组织未见明显的病理变化；丹参酮IIA衍生物20、10mg/kg组可见少量炎症细胞围管性浸润及肝窦淤血，肝细胞变性和凋亡较模型组都有不同程度的改善。说明丹参酮IIA衍生物各剂量治疗组肝损伤明显低于模型组，尤其是大剂量比中、小剂量组能明显保护刀豆蛋白A介导的肝组织的损伤。

[0115] 该试验结果表明,本化合物对肝脏的损伤及疾病具有一定的疗效.

[0116] 对糖尿病大鼠肾脏的保护作用

[0117] 将36只大鼠随机分为对照组(NC组)、糖尿病组（DM组）和丹参酮IIA衍生物治疗组（DMT组），对照组大鼠12只，普通饲料喂养，6周时腹腔注射ph值为4.2的等体积枸橼酸缓冲液。其余大鼠24只予高糖、高脂饲料喂养，6周时腹腔注射30mg/kg链脲佐菌素，8周时口服葡糖糖耐量试验，异常者入选。成模大鼠共20只，其中糖尿病组（DM组）9只，糖尿病治疗组11只。12周时治疗组每日给予丹参酮IIA衍生物注射液1,42mg/kg灌胃，其余两组每日给予等体积的高压消毒水灌胃。24周时，所有大鼠收集24h尿液，保存、待测；麻醉后经腹主静脉取血，迅速取出左肾，滤纸吸干水分，去包膜，称重，制备大鼠肾脏组织标本。采用免疫组化法进行肾脏组织病理学检测。

[0118] 结果：

[0119] 血生化指标及尿液检查：对24h尿液和血液进行检测，结果见表4。可见DM组的空腹血糖、胰岛素、甘油三酯、总胆固醇、尿白蛋白分泌率较同期NC组均显著升高，肌酐清除率明显下降（P＜0.01）。治疗组胰岛素、甘油三酯、总胆固醇、尿白蛋白分泌率较同期DM组均好转（P＜0.05），胰岛素下降程度较大，接近NC组水平。

[0120] 表4：各组大鼠一般情况及生化指标比较

[0121]* Δ * Δ

[0122] 注：与NC组比较，P＜0.05，P＜0.01；与DM组比较，P＜0.05，P＜0.01[0123] 免疫组化结果：

[0124] 见表5。NC组大鼠近曲小管上皮细胞胞浆内α-SMA和vimentin无表达,TGF-β1在胞浆和间质中微量表达；DM组大鼠近曲小管上皮细胞胞浆内有棕黄色颗粒，α-SMA、vimentin、TGF-β1呈强阳性；与同期DM组相比，治疗组各项指标表达减轻，范围缩小，表达水平介于NC组与DM组之前。

[0125] 表5：大鼠肾脏细胞免疫组化结果

[0126]组别 α-SMA TGF-β1 viment in
NC(n=12) 0.01±0.02 0.03±0.01 0.02±0.01
DM(n=9) 0.37±0.04* 0.33±0.06* 0.39±0.01*
DMT(n=11) 0.23±0.05*# 0.21±0.02#△ 0.22±0.03#△

[0127] 注：与NC组比较，*P＜0.05，ΔP＜0.01；*与DM组比较，P＜0.05，ΔP＜0.01[0128] 该试验结果表明,本化合物对肾脏具有保护作用。

[0129] 对脂多糖性急性肺损伤大鼠组织ACE2表达的影响

[0130] 45只健康雄性Wistar大鼠，随机分为3组：正常生理盐水对照组（NS组）、急性肺损伤组（LPS组）、丹参酮IIA衍生物干预组（干预组），LPS组和干预组通过股静脉注射LPS（5mg/kg）建立急性肺损伤模型。干预组在注射LPS前30min静脉给药10mg/kg，NS组和LPS组给予等量NS。3组又分为6h、12h、24h3个时间点亚组，每组5只，检测血气分析、肺组织湿/干重比（W/D）、ACE2免疫组织化学表达。

[0131] 结果：

[0132] 动脉血气分析结果：LPS注射后大鼠表现为呼吸增快，精神萎靡，对外界反应淡漠。LPS各亚组PaO2较对照组显著降低（P＜0.05），而干预组PaO2各时间点较LPS组有明显改善。见表6。

[0133] 表6：各组动脉血气分析PaO2结果（㎜Hg）

[0134]组别 例数 Ⅰ亚组（6h） Ⅱ亚组（12h） Ⅲ亚组（24h）
NS 5 94.0±1.87 93.6±3.71 94.4±1.14
LPS 5 76.0±2.911） 69.2±2.581） 62.4±2.071）
干预组 5 82.2±3.341)2） 75.2±2.161)2） 72.4±3.511)2）
1)

[0135] 与NS对照组比较，P＜0.05；与LPS组相应时点比较，2）P＜0.05肺组织湿/干重（W/D）比值测定：

[0136] LPS组大鼠肺湿干比W/D值随时间点的延长而上升，较对照组显著升高（P＜0.05），而干预组虽也随时间点延长而上升，但明显低于LPS组同时间点，差异有统计学意义（P＜0.05），见表7。

[0137] 表7：肺组织湿/干重（W/D）比值的比较

[0138]组别 例数 Ⅰ亚组（6h） Ⅱ亚组（12h） Ⅲ亚组（24h）
NS 5 4.39±0.54 4.46±0.29 5.00±0.69
LPS 5 5.64±0.741） 6.22±0.901） 7.47±0.821）
干预组 5 4.60±0.362） 4.91±0.222） 5.88±0.892）

[0139] 与NS对照组比较，1)P＜0.05；与LPS组相应时点比较，2）P＜0.05

[0140] 肺组织病理改变：

[0141] 光镜下，正常肺组织结构清晰，肺泡壁完整，肺间质无渗出。LPS组肺泡间隔增宽，部分肺泡内见渗出、水肿、出血，肺间质内见大量炎症细胞浸润，较对照组同时间点明显增多。而干预组肺组织间隔略有增宽，肺间质少量炎症细胞浸润。

[0142] 肺组织ACE2免疫组织化学的表达：ACE2在正常肺细胞膜上有表达。在肺泡上皮细胞，细支气管上皮细胞，内皮细胞和肺血管平滑肌细胞大致相似。各时间点未见明显区别。LPS组肺组织ACE2表达明显减弱，且以12h为最弱，干预组肺组织ACE2阳性表达较LPS组相同时间点有明显增强。图像分析软件测定的积分光密度值显示，NS Ⅱ亚组是LPS Ⅱ亚组的4.72倍（P＜0.05），干预组Ⅱ亚组是LPS Ⅱ亚组的2.24倍，干预组3个亚组较LPS 3个亚组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表8。

[0143] 表8：3组大鼠不同时间点肺组织ACE2的免疫组织化学表达（I OD×105）[0144]组别 例数 Ⅰ亚组 Ⅱ亚组 Ⅲ亚组
NS 5 1.22±0.04 1.18±0.07 1.18±0.07
LPS 5 0.37±0.021） 0.25±0.041） 0.46±0.031）
干预组 5 0.79±0.031）2） 0.56±0.041）2） 0.85±0.071）2）

[0145] 与NS对照组比较，1)P＜0.05；与LPS组相应时点比较，2）P＜0.05

[0146] 该试验结果表明,丹参酮I IA衍生物能减轻LPS导致的肺部急性炎性反应，这种防治作用可能与上调ACE2的表达有关。

[0147] 光稳定性实验

[0148] 取本发明所制备式（I）化合物3克于称量瓶中，摊成＜10毫米厚的薄层，放置于4500lx±500lx的强光照射药物稳定性检查仪中，强光连续照射，于第5天和第10天取样检测。结果如表9。

[0149] 表9：取本发明所制备式（I）化合物的光稳定性实验结果

[0150]外观 熔点 含量 有关物质
0天 微红色 180～182℃ 99.2% 0.8%
5天 微红色 180～182℃ 99.1% 0.9%
10天 微红色 180～182℃ 99.2% 0.8%

[0151] 同样条件下实验，丹参酮IIA强光连续照射实验结果见表10。

[0152] 表10：丹参酮IIA的光稳定性实验结果

[0153]外观 熔点 含量 有关物质
0天 橙红色 209～210℃ 98.6% 1.4%
5天 紫红色 192～194℃ 90.2% 9.8%
10天 红黑色 186～189℃ 86.4% 13.6%

[0154] 温度稳定性实验

[0155] 取本发明所制备式（I）化合物3克于称量瓶中，摊成＜10毫米厚的薄层，放置于60℃恒温药物稳定性检查仪中高温试验，于第5天和第10天取样检测。结果如表11。

[0156] 表11：温度稳定性实验结果

[0157]外观 熔点 含量 有关物质
0天 微红色 180～182℃ 99.2% 0.8%
5天 微红色 180～182℃ 99.1% 0.9%
10天 微红色 180～182℃ 99.1% 0.9%

[0158] 酸稳定性实验

[0159] 取本发明所制备式（I）化合物3克于100毫升烧瓶中，加50毫升四氢呋喃溶解，再加10毫升1N盐酸，于40℃下搅拌，于2小时和4小时取样检测。结果如表12。

[0160] 表12：算稳定性实验结果

[0161]外观 熔点 含量 有关物质
0小时(固体) 微红色 180～182℃ 99.2% 0.8%
2小时(溶液) 红色 / 99.0% 1.0%
4小时(溶液) 红色 / 99.0% 1.0%

[0162] 碱稳定性实验

[0163] 取本发明所制备式（I）化合物3克于100毫升烧瓶中，加50毫升四氢呋喃溶解，再加10毫升1N氢氧化钠，于40℃下搅拌，于2小时和4小时取样检测。结果如表13。

[0164] 表13：酸稳定性实验结果

[0165]外观 熔点 含量 有关物质
0小时(固体) 微红色 180～182℃ 99.2% 0.8%