一种家蚕天然膜蛋白PRMC2的纯化方法

摘要

本发明涉及一种家蚕天然膜蛋白PRMC2的纯化方法，属于蛋白质纯化技术领域。本发明以发病蚕蛹作为原料，通过匀浆，差速离心，密度梯度离心，超滤，及HA活性标定，得到膜含量高的组分，然后用去垢剂将膜蛋白提取出来，再经三步层析分离纯化，得到所述家蚕天然膜蛋白PRMC2。本发明提供的纯化方法，对较难分离的天然膜蛋白的纯化提出了一种全新的解决方法，具有重要意义。

权利要求

1.一种家蚕天然膜蛋白PRMC2的纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)制备家蚕生物膜组分：将保存于-80℃的蚕蛹粉与4℃预冷的灭菌ddH2O等体积混合匀浆2 min，停2 min，置于冰上冷却，重复9次；8000 rpm、4℃离心60min，重复3次；上清于15000 rpm、4℃离心60 min，重复3次，最后一次4层纱布过滤；过滤上清液进行0.1μm膜包超滤，其中料液体积比为1:1，重复10次，体积恢复到过滤前体积；上清液于50000rpm，

10℃离心40分钟；上清密度梯度离心；铺制蔗糖密度：PB (150ml)，样品(350ml)，30wt %(400ml)，40wt %(400ml)，55%充满，30000rpm密度梯度离心3 h；用56%蔗糖溶液下样，按

30ml/管收集，取样3ml，做比活测定；将区带离心后收集的样品进行测活；将活性高的膜组分混合，分别用超滤液100kD膜包超滤10次脱糖；

(2)利用去垢剂提取家蚕天然膜蛋白PRMC2：将脱好糖的细胞膜组分与含有1%去垢剂CHAPS的膜蛋白提取液按体积比1:2的比例混合，4℃轻微搅拌过夜至少8小时；将提取好的膜蛋白混合液于8000 rpm离心20分钟后取上清，准备装柱过阴离子交换；

(3)分级纯化所述家蚕天然膜蛋白PRMC2：将准备好的蛋白样品600ml在4℃与

280mlDEAE填料缓慢均匀搅拌混合，每隔10分钟搅拌一次，共混合2小时，每次装柱前都应将填料搅拌均匀，同时将柱子下方出样口打开，并收集流出液，直到柱子全部装好；将装好的DEAE柱连接到AKTA液相色谱仪上后，用20mMTris平衡600ml,平衡好后，用梯度提高NaCl浓度的方法进行分布洗脱，共出现4个大峰，并对每个峰走电泳检测；将含有目的蛋白的峰收集浓缩，用SuperdexTM 200进一步分离，并对每个峰走电泳检测；将含有目的蛋白的峰收集浓缩，用RESCOURCE Q，1 mL进一步梯度洗脱分离，共分得7个峰，并对每个峰走电泳检测，以获得较纯的家蚕天然膜蛋白PRMC2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

说明书

一种家蚕天然膜蛋白PRMC2的纯化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种家蚕天然膜蛋白PRMC2的纯化方法，属于蛋白质纯化技术领域。

背景技术

[0002] 膜蛋白(特别是膜内在蛋白)在生物体与外界环境进行物质和能量的交换以及信号传递等方面起着非常重要的作用。并且大部分膜蛋白是研究新药的潜在靶点，是新药研发的重要领域之一。

[0003] 常规研究的膜蛋白大部分都是原核表达后获取的，所以不具有翻译后修饰，天然蛋白具有最真实的糖基化修饰和空间结构，是最接近该蛋白的生物活性的，因此纯化天然膜蛋白具有重要意义。

[0004] 但是纯化天然膜蛋白有三个难点，第一个是富集大量膜蛋白，第二个是有效地溶解膜蛋白，第三个是有效地纯化方法。我们利用细胞膜表面HA活性标记可以拿到大量的膜蛋白组分，筛选出有效地去垢剂及其浓度去溶解膜蛋白，最后用一系列色谱柱分级纯化目的蛋白。整个方案对膜蛋白的纯化方法起到一定的推进作用。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明的目的是提供一种家蚕天然膜蛋白PRMC2的纯化方法，其利用细胞膜表面HA活性标记可以获取膜蛋白含量高的组分，并利用各种层析技术进一步富集我们的目标蛋白。

[0006] 为达到上述目的，本发明提供一种家蚕天然膜蛋白PRMC2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0007] 上述家蚕天然膜蛋白PRMC2的纯化方法，包括以下步骤：

[0008] (1)制备家蚕生物膜组分：将500g蚕蛹粉(保存于4℃)与1500ml(4℃预冷)的灭菌ddH2O混合匀浆2 min，停2 min，置于冰上冷却，重复9次；8000 rpm 4℃离心60min，重复3次；上清15000 rpm 4℃离心60 min，重复3次，最后一次4层纱布过滤；过滤上清液进行0.1μm膜包超滤(料液比：1:1)，重复10次，恢复到原体积；上清液50000rpm 10℃离心40分钟。上清密度梯度离心；铺制蔗糖密度：PB(150ml)，样品(350ml)，30 wt%(400ml)，40wt %(400ml)，55%充满，30000rpm密度梯度离心3 h；用56%蔗糖溶液下样，按30ml/管收集(取样3ml)，做比活测定；将区带离心后收集的样品进行测活；将活性高的膜组分混合，分别用超滤液100kD膜包超滤10次脱糖;

[0009] (2)利用去垢剂提取家蚕天然膜蛋白：将脱好糖的细胞膜组分与膜蛋白提取液(含1%的去垢剂CHAPS)按体积比1:2的比例混合，4℃轻微搅拌8小时左右；将提取好的膜蛋白混合液于8000 rpm离心20分钟后取上清，准备装柱过阴离子交换；

[0010] (3)分级纯化家蚕天然膜蛋白PRMC2：将准备好的蛋白样品600ml在4度与280mlDEAE填料缓慢均匀搅拌混合，每隔10分钟搅拌一次，共混合2小时，每次装柱前都应将填料搅拌均匀，同时将柱子下方出样口打开，并收集流出液，直到柱子全部装好(特别要注意整个装柱过程禁止填料干掉)；将装好的DEAE柱连接到AKTA液相色谱仪上后，用
20mMTris平衡600ml,平衡好后，用梯度提高NaCl浓度的方法进行分布洗脱；共出现4个大峰，并对每个峰走电泳检测；将含有目的蛋白的峰收集浓缩，用SuperdexTM 200(分子筛层析)进一步分离，并对每个峰走电泳检测；将含有目的蛋白的峰收集浓缩，用RESCOURCE Q(分子筛层析)，1 mL进一步梯度洗脱分离，共分得7个峰，并对每个峰走电泳检测，以获得较纯的家蚕天然膜蛋白PRMC2。

[0011] 本发明利用家蚕杆状病毒在细胞的感染初期以出芽病毒的方式穿过细胞膜,被病毒穿膜后的破碎细胞膜融合后形成各种囊泡，经过低速离心，超速离心，密度梯度离心等一系列操作，可以有效地分离细胞膜成分，同时以HA活性为Marker标定细胞膜，从而有效获得膜蛋白质；也为我们更好的拿到高含量膜蛋白组分提供了很好的解决方法，这是一种全新的有效的膜蛋白分离技术，具有重要的意义。

附图说明

[0012] 图1是将区带离心后收集的样品进行测活，1，2，3，4，5，6，7，8：区带后收集的样品，9为区带前的样品，并倍比稀释8个孔，NC为阴性对照，结果显示1，2，3，5，6，7样品HA活性较高；

[0013] 图2是家蚕天然膜蛋白PRMC2的DEAE(300ml)离子交换初步分离色谱图；

[0014] 图3是DEAE(300ml)分离天然膜蛋白PRMC2的电泳分析图；M:低分子质量蛋白质标准；1:原样(膜蛋白提取液提取后的蛋白组分)；2：穿透液；4：第4管产物；5：第5管产物；17:第17管产物；21：第21管产物；25:第25管产物；32：第32管产物；其中家蚕天然膜蛋白PRMC2在第17管中；

[0015] 图4是家蚕天然膜蛋白PRMC2的SuperdexTM 200 进一步分离色谱图；

[0016] 图5是SuperdexTM 200 进一步分离家蚕天然膜蛋白PRMC2的电泳分析图；20:第20管产物；21：第21管产物；M:低分子质量蛋白质标准；23:第23管产物；24：第24管产物；25:第25管产物；26：第26管产物；27:第27管产物；其中家蚕天然膜蛋白PRMC2在第
26管中；

[0017] 图6是家蚕天然膜蛋白PRMC2的RESCOURCE Q，1 mL进一步分离色谱图；

[0018] 图7是RESCOURCE Q，1 mL进一步分离家蚕天然膜蛋白PRMC2的电泳分析图；M:低分子质量蛋白质标准；第5峰浓缩液；第5峰滤出液；第6峰浓缩液；第6峰滤出液（家蚕天然膜蛋白PRMC2所在峰）；第7峰浓缩液；第7峰滤出液；第8峰浓缩液；第8峰滤出液；

[0019] 图8是家蚕天然膜蛋白的PRMC2质谱鉴定图。

具体实施方式

[0020] 应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。

[0021] 在本说明书中，除非特别指明，否则所用技术术语为本领域中的普通技术人员常用术语；本说明书中未注明具体条件的实验方法是按常规实验方法；本说明书中所用的试验材料如无特别说明均为市售购买产品，各种试剂和培养基的成分和配制方法可参见常规实验手册中的操作。

[0022] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

[0023] 实施例1：制备家蚕生物膜组分

[0024] (1)500g蚕蛹粉(购于浙江中奇生物药业股份有限公司，保存于4℃)与1500ml(4℃预冷)的灭菌ddH2O混合匀浆2 min，停2 min，置于冰上冷却，重复9次；

[0025] (2)8000 rpm、4℃离心60min，重复3次；

[0026] (3)上清于15000 rpm 、4℃离心60 min，重复3次，最后一次4层纱布过滤；

[0027] (4)过滤上清液进行0.1μm膜包超滤(料液体积比：1:1)，重复10次，恢复到过滤前体积；

[0028] (5)上清液于50000rpm、 10℃离心40分钟；

[0029] (6)上清密度梯度离心：铺制蔗糖密度：PB(150ml)，样品(350ml)，30%(400ml)，40%(400ml)，55%充满，30000rpm密度梯度离心3 h(PB是一种配制蔗糖溶液的缓冲液不含蔗糖，也可以说是0%的蔗糖)；

[0030] (7)用质量浓度56%的蔗糖溶液下样，按30ml/管收集(取样3ml)，做比活测定，如图1所示，将区带离心后收集的样品进行测活；

[0031] (8)将活性高的膜组分混合，分别用超滤液100kD膜包超滤10次脱糖(超滤液分两种：一种高盐(含1MNaCl)，一种低盐(不含NaCl)，高盐的超滤液用来将膜蛋白偶联的非膜蛋白洗脱掉)。

[0032] 实施例2：利用去垢剂提取家蚕天然膜蛋白

[0033] (1)将脱好糖的细胞膜组分与膜蛋白提取液(含1%的去垢剂CHAPS)按体积比1:2的比例混合，4℃轻微搅拌过夜 (如果脱糖超滤液含高盐，还需100K膜包脱盐)；

[0034] (2)将提取好的膜蛋白混合液于8000 rpm离心20分钟后取上清，准备装柱过阴离子交换。

[0035] 实施例3：分级纯化家蚕天然膜蛋白PRMC2

[0036] (1)家蚕天然膜蛋白PRMC2的DEAE)离子交换初步分离：将准备好的蛋白样品600ml在4℃与280mlDEAE填料缓慢均匀搅拌混合，每隔10分钟搅拌一次，共混合2小时，每次装柱前都应将填料搅拌均匀，同时将柱子下方出样口打开，并收集流出液，直到柱子全部装好(特别要注意整个装柱过程禁止填料干掉)，将装好的DEAE柱连接到AKTA液相色谱仪上后，用20mMTris盐酸缓冲液平衡600ml,平衡好后，用梯度提高NaCl浓度的方法进行分布洗脱；共出现4个大峰，如图2所示，并对每个峰走电泳检测如图3所示；

[0037] (2)家蚕天然膜蛋白PRMC2的SuperdexTM 200 进一步分离：将含有目的蛋白的峰TM收集浓缩，用Superdex 200进一步分离，共分得6个峰，如图4所示，并对每个峰走电泳检测如图5所示；

[0038] (3)家蚕天然膜蛋白PRMC2的RESCOURCE Q，1 mL进一步分离：将含有目的蛋白的峰收集浓缩，用RESCOURCE Q，1 mL进一步梯度洗脱分离，共分得7个峰，如图6所示，并对每个峰走电泳检测如图7所示，其中家蚕天然膜蛋白PRMC2在第6峰中。

[0039] 实施例4:家蚕天然膜蛋白PRMC2的质谱鉴定

[0040] 1.样品制备主要步骤：

[0041] a.将实施例3得到的目的蛋白割胶后，切成1mm3左右的小块，装入离心管中，水洗3次；

[0042] b.用50％(v/v)ACN/25mM碳酸氢铵(100μl，pH 8.0)脱色15分钟，反复3次，直至将颜色脱尽；

[0043] c.蒸馏水洗涤1次；

[0044] d.将胶块浸入30μl、100％ACN(乙腈)中5分钟，脱水，胶块变白，然后室温抽干；

[0045] e.加8μl Trypsin酶液(0.1mg/ml)，37ºC过夜16h左右。

[0046] 2.质谱仪操作流程：

[0047] a.清洗样品板；

[0048] b.校正仪器标准品的配制、点样、检测；

[0049] c.点样、检测：

[0050] ①将0.3 μL已酶解的样品加0.3 μL的基质点到样品板上，室温晾干；

[0051] ②打开 4000 Series software，将样品板放入质谱仪；

[0052] ③新建一个spotset，打开校正仪器的采集方法和处理模式，校正仪器；

[0053] ④打开测试未知样品的采集方法和处理模式，进行样品分析；一级激光强度3900，二级激光强度4300，检测分子量范围700-4000Da，选用正离子反射模式进行质谱分析。

[0054] 3.质谱结果为家蚕天然膜蛋白PRMC2，如图8所示。该蛋白的肽指纹图谱与西南农大蛋白库中的编号gi114052687的蛋白覆盖率达27.52%，肽段匹配数5段，并获得其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，证明该蛋白即为家蚕天然膜蛋白PRMC2。

[0055] 以上所述，仅为本发明的实施例，应当指出，对于本技术中的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术特征的前提下，还可以做若干的改进和润饰，这些润饰和改进也应属于本发明的专利保护范围。