本发明提供了一种微拟球藻培养基配方及三级培养方法，配方如下：NaNO3 7.5×10-2g，KH2PO4 1×10-2g，NaHCO3 5×10-1g，柠檬酸铁(FeC6H5O7.5H2O)2×10-4g，VB12 5×10-7g，VB1 1×10-4g，VH 5×10-7g，九二0植物生长刺激素(即赤霉素)5国际单位，人尿2mL，消毒海水1000mL。实验结果表明，使用优化培养基并采用三级培养微拟球藻具有生长速度快、产量高、成本低、易于操作、不易污染的优点。
1.培养微拟球藻的三级培养方法，其特征在于包括如下步骤：-2
配置一种微拟球藻培养基，该微拟球藻培养基配方如下：NaNO37.5×10 g，-2 -1 -4 -7 -4 -7KH2PO41×10 g，NaHCO35×10 g，柠檬酸铁2×10 g，VB125×10 g，VB11×10 g，VH5×10 g，九二0植物生长刺激素5国际单位，人尿2mL，消毒海水1000mL；
还包括微量元素0.55～2.25ml/L，所述微量元素配方为：磷酸二氢钠32～40g/L、硫酸铜1.2～3.2g/L、硫酸锌4.2～6.2g/L、氯化钴4～6g/L、氯化锰30～45g/L加水定容至1L；
所述微量元素溶液中加入乙二胺四乙酸二钠3～10g/L；
1)一级培养容器为5000mL三角烧瓶，烧瓶用洗液洗涤、晾干、120℃恒温消毒；培养用的海水比重1.015～1.018，盐度30～32，经过经脱脂棉过滤、煮沸、冷却后加入营养盐；室内培养，室温20-26℃，室内自然光+辅助日光灯管光源照射，光强3000-10000Lx，光暗周期4
＝14L：10D，指数增长期藻种接种，接种密度300-350×10cell/mL，不充气；培养期间每天4
摇动6次，密度达3000×10cell/mL，即转入二级培养；
2)二级培养容器为50L白塑料桶，白塑料桶刷干净、漂白粉消毒后用消毒水冲干净备用；二级培养用的海水经漂白粉消毒、硫代硫酸钠处理后加入营养盐；将一级培养的藻液按1∶10的比例接种到白桶；室内培养，室温20-26℃，室内自然光+辅助日光灯管光源照射，光强3000-10000Lx，光暗周期＝14L：10D，充气培养，充气量以能将藻细胞冲起悬浮即可；
3)三级培养容器为水泥池；面积20-30m，池深50cm，水深20-30cm，内贴白色瓷砖，三级培养用水经漂白粉消毒、硫代硫酸钠处理；将二级培养的藻液作藻种转入水泥4
池培养，室外培养，自然光照射，充气，接种密度200-300×10cell/mL，培养至密度达4
在步骤2)中充气培养时同时施加臭氧，臭氧的浓度为0.5微克/升空气～0.8微克/升空气。
微拟球藻培养基配方及三级培养方法
技术领域
[0001] 本发明属于海洋微藻养殖领域，尤其涉及一种微拟球藻培养基配方及三级培养方法。
背景技术
[0002] 微拟球藻(Nannochloropsis oculata)又称微绿球藻，是一种广泛分布的海水藻类，直径为2-4微米，细胞球形，淡绿色，富含不饱和脂肪酸及其它营养元素，其中EPA含量占脂肪酸总量的30％。EPA能降低胆固醇和甘油三酯的含量，促进体内饱和脂肪酸代谢，从而降低血液粘稠度，增进血液循环，提高组织供氧而消除疲劳，并防止脂肪在血管壁的沉积，预防动脉粥样硬化的形成和发展、预防脑血栓、脑溢血、高血压等心脑血管疾病。EPA在减轻炎症方面也起着重要的作用。另外，微拟球藻油脂含量占干重的68％以上，是提炼生物柴油的理想微藻。
[0003] 目前，微拟球藻规模化培养存在的主要问题是生长缓慢，生物量低，易污染，特别是梅雨季节，不利于大规模培养。以前使用的微拟球藻培养基没有加入碳酸氢钠，但我的实验表明，微拟球藻除了能利用空气中游离的CO2，还能有效地利用培养液中的HCO3-作为碳源。大量实验表明：添加0.5g/L的碳酸氢钠能能很好地促进微拟球藻的生长。另外，我还在培养基中补充了柠檬酸铁、维生素H、赤霉素和人尿，能将产量提高54％。
[0004] 总之，使用优化培养基并采用三级培养微拟球藻方法具有生长速度快、产量高、成本低、不易污染的优势。
发明内容
[0005] 为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种微拟球藻配方及三级培养方法，具体技术方案如下：
[0006] 一种微拟球藻培养基，配方如下：NaNO3 7.5×10-2g，KH2PO4 1×10-2g，NaHCO3 -1 -4 -7 -4 -75×10 g，柠檬酸铁(FeC6H5O7.5H2O)2×10 g，VB12 5×10 g，VB1 1×10 g，VH 5×10 g，九二
0植物生长刺激素(即赤霉素)5国际单位，人尿2mL，消毒海水1000mL。
[0007] 优选地，还包括微量元素0.55～2.25ml/L，所述微量元素配方为：磷酸二氢钠32～40g/L、硫酸铜1.2～3.2g/L、硫酸锌4.2～6.2g/L、氯化钴4～6g/L、氯化锰30～
45g/L加水定容至1L。
[0008] 优选地，所述微量元素溶液中加入120～140g/L的磷酸二氢钠溶液。
[0009] 优选地，所述微量元素溶液中加入乙二胺四乙酸二钠3～10g/L。
[0010] 应用本发明所提供的培养基对微拟球藻进行三级培养，包括如下步骤：1)一级培养容器为5000mL三角烧瓶，烧瓶用洗液洗涤、晾干、120℃恒温消毒；培养用的海水比重1.015～1.018，盐度30～32，经过经脱脂棉过滤、煮沸、冷却后加入营养盐；室内培养，室温20-26℃，室内自然光+辅助日光灯管光源照射，光强3000-10000Lx，光暗周期＝4
14L:10D，指数增长期藻种接种，接种密度300-350×10cell/mL，不充气。培养期间每天摇
4
瓶6次。密度达3000×10cell/mL，即可转入二级培养。2)二级培养容器为50L白塑料桶，白塑料桶刷干净、漂白粉消毒后用消毒水冲干净备用。二级培养用的海水经漂白粉消毒、硫代硫酸钠处理后加入营养盐；将一级培养的藻液按1∶10的比例接种到白桶。室内培养，室温20-26℃，室内自然光+辅助日光灯管光源照射，光强3000-10000Lx，光暗周期＝
14L:10D，充气培养，充气量以能将藻细胞冲起悬浮即可。3)三级培养容器为水泥池。面积
2
20-30m，池深50cm，水深20-30cm，内贴白色瓷砖，三级培养用海水经漂白粉消毒、硫代硫酸钠处理。将二级培养的藻液作藻种转入水泥池培养，室外培养，自然光照射，充气，接种密度
4 4
200-300×10cell/mL，培养至密度达2000-3000×10cell/mL即可收获。
[0011] 优选地，包括在步骤2)中充气培养时同时施加臭氧。
[0012] 优选地，臭氧的浓度为0.5微克/升空气～0.8微克/升空气。
[0013] 有益效果：
[0014] 实验结果表明，使用优化培养基并采用三级培养微拟球藻具有生长速度快、产量高、成本低、易于操作、不易污染的优点。
具体实施方式
[0015] 培养基配制方法
[0016] 1柠檬酸铁较难溶解，可加少量自来水在火炉上微热至80-90℃，并不断搅拌至全部融化；
[0017] 2赤霉素为白色结晶粉末，不易溶解于水，可先用酒精充分溶解(一般每g用50mL酒精或60度白酒溶解1小时以上)，再按所需浓度兑水稀释。
[0018] 3加营养盐的过程中需不断搅水，而且各种营养盐按配方中提供的顺序加入，以免发生化学反应；
[0019] 4各种营养盐可先配成浓度较高的母液，再依次添加；
[0020] 5三级培养各阶段营养盐配方和浓度相同。
[0021] 一种微拟球藻培养基，其特征在于该微拟球藻培养基配方如下：NaNO3 -2 -2 -1 -47.5×10 g，KH2PO4 1×10 g，NaHCO3 5×10 g，柠檬酸 铁(FeC6H5O7.5H2O)2×10 g，VB12 -4 -7
5×10-7g，VB1 1×10 g，VH 5×10 g，九二0植物生长刺激素(即赤霉素)5国际单位，人尿
2mL，消毒海水1000mL。
[0022] 优选地，还包括微量元素0.55～2.25ml/L，所述微量元素配方为：磷酸二氢钠32～40g/L、硫酸铜1.2～3.2g/L、硫酸锌4.2～6.2g/L、氯化钴4～6g/L、氯化锰30～
45g/L加水定容至1L。
[0023] 优选地，所述微量元素溶液中加入120～140g/L的磷酸二氢钠溶液。
[0024] 优选地，所述微量元素溶液中加入乙二胺四乙酸二钠3～10g/L。
[0025] 微拟球藻三级培养方法
[0026] 1一级培养
[0027] 一级培养容器为5000mL三角烧瓶，烧瓶用洗液洗涤、晾干、120℃恒温消毒；培养用的海水比重1.015，盐度30，经过经脱脂棉过滤、煮沸、冷却后加入营养盐；室内培养，室温20-26℃，室内自然光+辅助日光灯管光源照射，光强3000-10000Lx，光暗周期＝4
14L:10D，指数增长期藻种接种，接种密度300-350×10cell/mL，不充气。培养期间每天摇
