烟曲霉及其在微生物制备(R,R)-肉桂醇环氧化物中的应用

摘要

本发明提供了一株产环氧化物水解酶的新菌株——烟曲霉（Aspergillus fumigatus）ZJUTZQ160及其在微生物制备（R,R）-肉桂醇环氧化物中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期2012年5月31日，保藏编号CCTCC NO：M 2012199。本发明提供了一种具有立体选择性、可制备高光学纯（R,R）-肉桂醇环氧化物的新菌株，还提供了一种利用该菌株制备（R,R）-肉桂醇环氧化物的新方法反，应条件温和、立体选择性高、环境友好。

权利要求

1.烟曲霉（Aspergillus fumigatus）ZJUTZQ160，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期2012年5月31日，保藏编号CCTCC NO：M2012199。

2.如权利要求1所述的烟曲霉ZJUTZQ160在微生物法制备（R,R）-肉桂醇环氧化物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：以外消旋肉桂醇环氧化物为底物，以烟曲霉ZJUTZQ160的湿菌体细胞为催化剂，在25～40℃下，于pH6.0～8.4的缓冲液中反应1～12小时，制得所述（R,R）-肉桂醇环氧化物。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述缓冲液中，烟曲霉ZJUTZQ160湿菌体细胞的添加浓度为100～500g/L，底物外消旋肉桂醇环氧化物的初始浓度为1～100g/L。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述缓冲液中还添加有体积为缓冲液体积

1～10%的助溶剂，所述助溶剂为下列之一：二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、异丙醇、乙醇、二氯甲烷、甲醇。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述烟曲霉ZJUTZQ160湿菌体细胞由如下方法获得：产酶培养基终浓度组成：葡萄糖15～40g/L，黄豆粉5～20g/L，K2HPO4·3H2O

0.5～2.0g/L，NH4NO3 0.5～2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.2～2g/L，KCl 0.2～2.0g/L，溶剂为水，pH4～10；上述产酶培养基接种烟曲霉ZJUTZQ160，于25～40℃、100～200rpm下振荡培养48～96小时，培养液离心取沉淀经生理盐水洗涤，收集得到所述烟曲霉ZJUTZQ160湿菌体细胞。

说明书

烟曲霉及其在微生物制备(R,R)-肉桂醇环氧化物中的应

用

（一）技术领域

[0001] 本发明涉及一株产环氧化物水解酶的新菌株——烟曲霉（Aspergillus fumigatus）ZJUTZQ160及其在微生物制备（R,R）-肉桂醇环氧化物中的应用。(二）背景技术

[0002] 肉桂醇环氧化物的化学结构为：

[0003]

[0004] 外消旋的环氧肉桂醇由（R，R）-环氧肉桂醇和（S，S）-环氧肉桂醇两个对映体组成。

[0005] 肉桂醇环氧化物（3-phenylglcidol，PG）是许多药物合成的原料和关键中间体，如(R,R)-PG是合成白三烯受体拮抗剂S0961和NK1受体(+)-L-733,060的重要原料，而(S,S)-PG是合成抗癌药物(+)-Goniotriol和(+)-Goniofufurone的原料。

[0006] 利用传统的化学法制备手性的环氧化物，需要反应中添加大量溶剂和昂贵的金属催化剂，对环境造成极大的危害。生物法制备手性的环氧化物具有反应条件温和、立体选择性高、环境友好等优点。目前手性环氧肉桂醇都是用化学法合成的，生物法合成特别是环氧化物水解酶作为催化剂来合成肉桂醇环氧还未见报道。（三）发明内容

[0007] 本发明目的是为了提供一株用于制备光学纯（R,R）-肉桂醇环氧化物的新菌株——烟曲霉（Aspergillus fumigatus）ZJUTZQ160，及其在微生物法制备（R,R）-肉桂醇环氧化物中的应用。

[0008] 本发明采用的技术方案是：

[0009] 烟曲霉（Aspergillus fumigatus）ZJUTZQ160，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期2012年5月31日，保藏编号CCTCC NO：M2012199。

[0010] 该菌株的菌株形态如下（参见图1）：30℃培养72h，在察氏平板培养基上的菌落呈圆形，直径2cm。初始菌落呈白色，渐变成绿色，随着培养时间更长菌落成深褐绿色。由菌落表面为同心环，菌落与培养基贴合紧密，表面平滑、致密，边缘整齐，菌落扁平，绒毛状；初生菌丝为白色，菌丝较长；基内菌丝透明，有横隔；分身孢子梗末端形成扇形的绿色分身孢子。

[0011] ZJUTZQ160的18S rDNA的序列与NCBI中的18S rDNA的序列的进行比对，发现与烟曲霉有98%的序列的同源性，ZJUTZQ160的18SrDNA部分核苷酸序列如下：

[0012] TACTTATCCGACGGATGGCGCGGGTGGGGTCCTACTGATCCGAGGTCACCTTAAAAAATAAGTTGTTTGTCGGCTGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCAGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGAGAGGGGGACGGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACCCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTGATTACGATAATCAACTCAGACTGCATACTTTCAGAACAGCGTTCATGTTGGGGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGCAAGGCCTCCCCGGCGGCCGTCGAAACGGCGGGCCCGCCGAATCAACAAGGTACGATAGACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC

[0013] 综合上述结果，该菌株被鉴定为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。

[0014] 本发明所涉及的微生物是通过以下的程序筛选得到的：

[0015] （1）将全国各地采回的土样接种到初筛培养基中，在30℃，200rpm的摇床上培养3天，吸取少量培养液划线至霉菌平板培养基上，30℃恒温箱培养。然后挑取单菌落转接入试管斜面，30℃恒温箱培养2~3d后取出，保存于4℃冰箱。初筛培养基的配方：NaNO32.0g/L，K2HPO4·3H2O1.0g/L，KCl0.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，蔗糖30g/L，黄豆粉10g/L，0.1%（v/v）底物，pH4.0。

[0016] （2）从试管斜面转接适量菌体到发酵培养基，组分如下：NaNO32.0g/L，K2HPO4·3H2O1.0g/L，KCl0.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，葡萄糖30g/L，黄豆粉10g/L，pH4.0，30℃、200rpm振荡培养72小时。

[0017] （3）离心收集菌体，称取1g湿菌体（0.2g干菌）悬浮于1980μL磷酸钾缓冲液（0.1M，pH7.6）中，2μL肉桂醇环氧化物溶于20μL二甲基亚砜（DMSO）后加入到上述悬浮液中，30℃、200rpm转化17h后，10000rpm离心，取出加入乙酸乙酯（3×2mL）萃取残余的底物。蒸发浓缩后用加入1mL分析级正己烷/异丙醇（80/20，v/v），微孔滤膜过滤。滤液用正相高效液相色谱检测活性菌株的转化率和立体选择性。

[0018] 正相高效液相色谱分析：手性柱AS-H（46cm×25cm,4μm，Daicel CHIRALPAK），流动相为正己烷/异丙醇（80/20，V/V，0.8mL/min），检测波长为265nm。肉桂醇环氧化物(R,R)、(S,S)构型的出峰时间分别为7.548min及8.757min。

[0019] 底物e.e.s的计算公式：e.e.s（%）=(R-S)/(R+S)×100%，其中，R为（R,R）型环氧肉桂醇的含量，（S，S）为S型环氧肉桂醇的含量。

[0020] 本发明还涉及所述的烟曲霉ZJUTZQ160在微生物法制备（R,R）-肉桂醇环氧化物中的应用。

[0021] 具体的，所述应用为：以外消旋肉桂醇环氧化物为底物，以烟曲霉ZJUTZQ160的湿菌体细胞为催化剂，25~40℃（优选为30℃）下，于pH6.0~8.4（优选pH7.2）的缓冲液（优选磷酸盐缓冲液）中反应1~12小时（优选反应10小时），制得所述（R）-环氧叠氮丙烷。

[0022] 所述缓冲液中，烟曲霉ZJUTZQ160湿菌体细胞的初始浓度以湿重计为100~500g/L，底物外消旋（R,R）-肉桂醇环氧化物的初始浓度为1~100g/L。

[0023] 所述缓冲液为下列之一：磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、巴比妥缓冲液。

[0024] 为提高转化效率，所述缓冲液中还可添加体积为缓冲液体积1~10%的助溶剂，所述助溶剂为下列之一：二甲基亚砜（DMSO）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、乙酸乙酯（EtoAC）、异丙醇（IPN）、乙醇（EtOH）、二氯甲烷（DMC）、甲醇（MeOH）。

[0025] 所述烟曲霉ZJUTZQ160湿菌体细胞可由常规适用于烟曲霉的培养基经培养获得，具体的，本发明所述烟曲霉ZJUTZQ160湿菌体细胞由如下方法获得：培养基的终浓度组成：葡萄糖15~40g/L，黄豆粉5~20g/L，K2HPO4·3H2O0.5~2.0g/L，NH4NO30.5~2.0g/L，MgSO4·7H2O0.2~2g/L，KCl0.2~2.0g/L，溶剂为水，pH4~10；上述培养基接种烟曲霉ZJUTZQ160，25~40℃、100~200rpm振荡培养48~96小时，培养液离心取沉淀经生理盐水洗涤，收集得到所述烟曲霉ZJUTZQ160湿菌体细胞。

[0026] 菌株的斜面培养基（终浓度）：蔗糖30g/L，琼脂15～20g/L，NaNO32g/L，K2HPO4·3H2O1g/L，KCl0.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，溶剂为水，pH自然，121℃灭菌20min。

[0027] 具体的，所述应用可如下：

[0028] （1）产酶培养基的终浓度组成：葡萄糖25g/L、黄豆粉14g/L、NH4NO31g/L、K2HPO4·3H2O1.0g/L、KCl0.5g/L、MgSO4·7H2O1.23g/L，pH4.0，溶剂为水；摇瓶装液量30％，接种烟曲霉ZJUTZQ160，于30℃、200rpm振荡培养60h，将于菌体离心经生理盐水洗涤，收集湿菌体细胞；

[0029] （2）取100mM pH7.2的磷酸盐缓冲液2mL，加入步骤（1）所得的湿菌体细胞1g，加入外消旋环氧肉桂醇10g/L，30℃恒温水浴摇床振荡反应10小时，反应结束后用乙酸乙酯萃取，得到（R,R）-肉桂醇环氧化物。

[0030] 本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种具有立体选择性、可制备高光学纯（R,R）-肉桂醇环氧化物的新菌株烟曲霉（Aspergillus fumigatus）ZJUTZQ160，还提供了一种利用该菌株制备（R,R）-肉桂醇环氧化物的新方法，反应条件温和、立体选择性高、环境友好。（四）附图说明

[0031] 图1为本发明菌株菌体形态；A：平板正面；B：平板背面；C：菌丝体；D：孢子。（五）具体实施方式

[0032] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0033] 实施例1：菌株的分离

[0034] 产环氧化物水解酶菌的分离：称取1g土壤到100mL无菌水中，再加入一些玻璃珠，充分振荡后制成土壤悬浮液，取1mL上清液到50ml初筛培养基中，30℃、200rpm摇床上振荡培养3天。吸取少量发酵液分别划线至细菌及霉菌平板培养基上，得到单菌落。

[0035] 初 筛 培 养 基 的 配 方：NaNO32.0g/L，K2HPO4·3H2O1.0g/L，KCl0.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，蔗糖30g/L，黄豆粉10g/L，0.1%（v/v）环氧肉桂醇，pH4.0，250mL三角瓶装500mL，溶剂为水，121℃灭菌20min。

[0036] 筛选后，用手性高效液相色谱法检测手性环氧肉桂醇的对映体过量值（e.e.值），所述的烟曲霉ZJUTZQ160的e.e.值为84%。

[0037] 实施例2：菌株的培养

[0038] 霉菌平板及斜面培养基组成（终浓度）：蔗糖30g/L，琼脂15g/L，NaNO32g/L,K2HPO4·3H2O1g/L,KCl0.5g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，pH自然，121℃灭菌20min。

[0039] 于平板上挑取烟曲霉ZJUTZQ160，接种至斜面，30℃恒温箱培养3d，挑取单菌落划线至相应细菌及霉菌斜面，30℃恒温箱培养3d后取出放4℃冰箱中保存。

[0040] 实施例3：湿菌体细胞的获得

[0041] 培养基配制：蔗糖30g/L，黄豆粉20g/L，NaNO32g/L，K2HPO4·3H2O1g/L，KCl0.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，溶剂为水，pH4.0，250mL三角瓶装50mL，121℃灭菌20min；

[0042] 接种一环烟曲霉ZJUTZQ160于30℃、200rpm摇床振荡培养72h；培养结束后发酵液用纱布过滤并用生理盐水洗涤两次，收集湿菌体细胞，备用。

[0043] 实施例4：湿菌体细胞的获得

[0044] 培养基配制：葡萄糖25g/L、黄豆粉14g/L、NH4NO31g/L、K2HPO4·3H2O1.0g/L、KCl0.5g/L、MgSO4·7H2O1.23g/L，溶剂为水，pH4.0，250mL三角瓶装50mL，121℃灭菌20min；

[0045] 接种一环烟曲霉ZJUTZQ160于35℃、200rpm摇床振荡培养72h；培养结束后发酵液离心并用生理盐水洗涤两次，收集湿菌体细胞，备用。

[0046] 实施例5：

[0047] 在2mL、100mM的磷酸盐缓冲液中（pH7.6），加入1g实施例3所得湿菌体细胞；加入10g/L外消旋的环氧肉桂醇和2%（v/v）二甲基亚砜，于30℃恒温水浴摇床振荡反应17小时，反应液萃取，有机层旋蒸浓缩后加入1mL流动相（正己烷/异丙醇：80/20，V/V），剩余底物（R,R）-环氧肉桂醇的e.e.值为84.7%，对映体选择性E为6.6（其中E=ln[(1-c)(1-e.e.s)]/ln[(1-c)(1+e.e.s)]，e.e.s为底物的对映体过量值）。

[0048] 实施例6：

[0049] 在2mL、100mM的磷酸盐缓冲液中（pH6.8），加入1g实施例4所得湿菌体细胞；加入10g/L外消旋的环氧肉桂醇和2%二甲基亚砜，于30℃恒温水浴摇床振荡反应10小时，反应液萃取，有机层旋蒸浓缩后加入1mL流动相（正己烷/异丙醇：80/20，V/V），剩余底物（R,R）-环氧肉桂醇的e.e.值为96.2%，E为9.0。

[0050] 实施例7：

[0051] 在2mL、100mM的磷酸盐缓冲液中（pH7.2），加入1g实施例4所得湿菌体细胞；加入10g/L外消旋的环氧肉桂醇和2%二甲基亚砜，于30℃恒温水浴摇床振荡反应10小时，反应液萃取，有机层旋蒸浓缩后加入1mL流动相（正己烷/异丙醇：80/20，V/V），剩余底物（R,R）-环氧肉桂醇的e.e.值为96.9%，E为12.3。

[0052] 实施例8：

[0053] 在2mL、100mM的磷酸盐缓冲液中（pH7.6），加入1g实施例4所得湿菌体细胞；加入10g/L外消旋的环氧肉桂醇和2%二甲基亚砜，于30℃恒温水浴摇床振荡反应10小时，反应液萃取，有机层旋蒸浓缩后加入1mL流动相（正己烷/异丙醇：80/20，V/V），剩余底物（R,R）-环氧肉桂醇的e.e.值为94.0%，E为7.2。

[0054] 实施例9：

[0055] 在2mL、100mM的巴比妥缓冲液中（pH8.0），加入1g实施例4所得湿菌体细胞；加入10g/L外消旋的环氧肉桂醇和2%二甲基亚砜，于30℃恒温水浴摇床振荡反应10小时，反应液萃取，有机层旋蒸浓缩后加入1mL流动相（正己烷/异丙醇：80/20，V/V），剩余底物（R,R）-环氧肉桂醇的e.e.>99%，E为19.1。

[0056] 实施例10：

[0057] 在2mL、100mM的Tris-HCl缓冲液中（pH7.2），加入1g实施例4所得湿菌体细胞；加入10g/L外消旋的环氧肉桂醇和2%二甲基亚砜，于30℃恒温水浴摇床振荡反应10小时，反应液萃取，有机层旋蒸浓缩后加入1mL流动相（正己烷/异丙醇：80/20，V/V），剩余底物（R,R）-环氧肉桂醇的e.e.值为84.8%，E为5.8。

[0058] 实施例11：

[0059] 在2mL、100mM的磷酸盐缓冲液中（pH7.2），加入1g实施例4所得湿菌体细胞；加入2g/L外消旋的环氧肉桂醇和5%二甲基亚砜于30℃恒温水浴摇床振荡反应10小时，反应液萃取，有机层旋蒸浓缩后加入1mL流动相（正己烷/异丙醇：80/20，V/V），剩余底物（R,R）-环氧肉桂醇的e.e.值为91.5%，E为11.6。

[0060] 实施例12：

[0061] 在2mL、100mM的磷酸盐缓冲液中（pH7.2），加入1g实施例4所得湿菌体细胞；加入5g/L外消旋的环氧肉桂醇和5%二甲基甲酰胺，于30℃恒温水浴摇床振荡反应10小时，反应液萃取，有机层旋蒸浓缩后加入1mL流动相（正己烷/异丙醇：80/20，V/V），剩余底物（R,R）-环氧肉桂醇的e.e.值为50.5%，E为3.5。

[0062] 实施例13：

[0063] 在2mL、100mM的磷酸盐缓冲液中（pH7.2），加入0.5g实施例4所得湿菌体细胞；加入1g/L外消旋的环氧肉桂醇、5%二甲基亚砜和0.2mmol/L吐温80，于30℃恒温水浴摇床振荡反应10小时，反应液萃取，有机层旋蒸浓缩后加入1mL流动相（正己烷/异丙醇：80/20，V/V），剩余底物（R,R）-环氧肉桂醇的e.e.值为87.8%，E为4.3。

[0064] 实施例14：

[0065] 在2mL、100mM的磷酸盐缓冲液中（pH7.2），加入1g实施例4所得湿菌体细胞；加入50g/L外消旋的环氧肉桂醇和4%二甲基亚砜于30℃恒温水浴摇床振荡反应10小时，反应液萃取，有机层旋蒸浓缩后加入1mL流动相（正己烷/异丙醇：80/20，V/V），剩余底物（R,R）-环氧肉桂醇的e.e.>99%，E为19.1。

[0066] 实施例15：

[0067] 在2mL、100mM的磷酸盐缓冲液中（pH7.2），加入0.5g实施例4所得湿菌体细胞；加入5g/L外消旋的环氧肉桂醇和4%的二甲基亚砜于30℃恒温水浴摇床振荡反应6小时，反应液萃取，有机层旋蒸浓缩后加入1mL流动相（正己烷/异丙醇：80/20，V/V），剩余底物（R,R）-环氧肉桂醇的e.e.值为80.0%，E为6.8。

[0068] 实施例16：

[0069] 在2mL、100mM的磷酸盐缓冲液中（pH7.2），加入0.2g实施例4所得湿菌体细胞；加入1g/L外消旋的环氧肉桂醇和4%的二甲基亚砜于30℃恒温水浴摇床振荡反应10小时，反应液萃取，有机层旋蒸浓缩后加入1mL流动相（正己烷/异丙醇：80/20，V/V），剩余底物（R,R）-环氧肉桂醇的e.e.值为84.0%，E为4.2。