枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用

摘要

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用。本发明的菌株分类命名为枯草芽孢杆菌（BaciLLussubtiLis）723，保藏号为CCTCCNO：M2012285。枯草芽孢杆菌（BaciLLussubtiLis）723具有产量高、发酵周期短的优点。

权利要求

1.一株枯草芽孢杆菌, 其分类命名为枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723, 其保藏编号为：CCTCC NO：M 2012285。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723的培养方法，其特征在于，包括：将所述枯草芽孢杆菌接种于活化培养基中培养以得到种子培养液；和将所述种子培养液接种于发酵培养基中以得到生物表面活性剂。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，包括：

将经斜面培养12小时-24小时的所述枯草芽孢杆菌接种于活化培养基中，并在30摄氏度-37摄氏度的条件下培养12小时-24小时以得到所述种子培养液；和将所述种子培养液按照2%-4%的接种量接种于所述发酵培养基中，并在30摄氏度-37摄氏度的条件下培养24小时-48小时以得到脂肽类表面活性剂。

4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723在发酵生产脂肽类表面活性剂中的应用。

说明书

枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一株枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用。 背景技术

[0002] 生物表面活性剂是由微生物产生的天然表面活性化合物。生物表面活性剂与化学合成表面活性剂性能相似，具有降低表面张力、稳定乳化液和发泡等功能。但相比之下，生物表面活性剂还有其自身的许多优势：可生物降解，不会造成再污染；无毒或低毒；一般不致敏、可消化，因此可用于化妆品和食品的添加剂；可以从工业废物中生产，用于生物环境治理；具有更好的环境相容性，更高的起泡性，在极端温度、PH、盐浓度下的更好选择性和专一性；结构多样，有可能适用于特殊领域。

[0003] 生物表面活性剂主要分为糖脂类，脂肽类，脂肪酸，磷脂，多聚表面活性剂等。目前，脂肽类表面活性剂的产量比较低，国内外脂肽类表面活性剂通过批次发酵的产量均低于5g/L。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一株可以产生生物表面活性剂的枯草芽孢杆菌。 [0005] 为了实现本发明的技术目的，本发明提供了一株枯草芽孢杆菌, 其分类命名为枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723, 其保藏编号为：CCTCC NO：M 2012285。 [0006] 本发明还提供了枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723的培养方法，所述培养方法包括：将所述枯草芽孢杆菌接种于活化培养基中培养以得到种子培养液；和将所述种子培养液接种于发酵培养基中以得到脂肽类表面活性剂。

[0007] 进一步地，所述培养方法包括：将经斜面培养12小时-24小时的所述枯草芽孢杆菌接种于活化培养基中，并在30摄氏度-37摄氏度的条件下培养12小时-24小时以得到所述种子培养液；和将所述种子培养液按照2%-4%的接种量接种于所述发酵培养基中，并在30摄氏度-37摄氏度的条件下培养24小时-48小时以得到脂肽类表面活性剂。 [0008] 所述发酵培养基配方为：葡萄糖15-25g/L，油15-25g/L,尿素3-5g/L,硫酸铵3-5g/L，磷酸二氢钾3g/L，无机离子0.01g/L。

[0009] 所述油包括食用油、甘油、石蜡、煤油和正己烷中的一种或多种。 [0010] 所述食用油为豆油。

[0011] 本发明还提供了枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723在发酵生产脂肽类表面活性剂中的应用。

[0012] 本发明的有益效果在于：

[0013] 枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723的发酵液CMC值仅为25mg/L,远远低于一般化学表面活性剂的CMC值。枯草芽孢杆菌723发酵24h后脂肽类表面活性剂的产量即可以达到15g/L。因此，枯草芽孢杆菌723具有产量高、发酵周期短的优点。枯草芽孢杆菌723可以利用食用油、甘油、石蜡、煤油、正己烷、废弃油来生产生物表面活性剂，因此不但可以应用于石油开采工业，而且可以用来分解环境中的废弃油以避免污染，具有多种功效。

[0014] 本发明的生物材料枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723的保藏日期为2012年7月13日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO: M 2012285。

具体实施方式

[0015] 本发明的生物材料枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723的保藏日期为2012年7月13日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，其保藏编号为CCTCC NO: M 2012285。

[0016] 本发明的枯草芽孢杆菌723为高产脂肽类表面活性剂的菌株。本发明的枯草芽孢杆菌723具有如下生理学特征：

[0017] 1、菌株的形态特征：菌株是革兰氏染色阳性杆菌，形成芽孢，芽孢较大，圆柱形，居中。半固体穿刺运动，有鞭毛，无荚膜。平板生长茁落形状不规则，边缘不整齐，菌落表面皱褶、粗糙、较干燥等，是典型的芽孢杆菌菌落特征。

[0018] 2、菌株的生理生化特征：对接触酶，可溶性淀粉水解，V-P，柠檬酸盐利用，丙二酸盐利用，葡萄糖，反硝化试验呈阳性反应。对氧化酶，吲哚，苯丙氨酸脱氨酶呈阴性反应。可以在55℃的高温下下生长。该菌在最佳条件下发酵表面张力可以由72mN/m降至26mN/m，临界胶束浓度（CMC）值为25mg/L，远远低于一般的化学表面活性剂的CMC值。在24小时发酵产物的产量最高，达到15g/L。

[0019] 本发明的枯草芽孢杆菌723可以利用下述的筛选方法进行筛选，所述筛选方法可以包括如下步骤:

[0020] 取1g胜利油田的土样放入50mL的生理盐水中，在30-37℃,100-200rpm条件下振荡3-5h。

[0021] 将上述步骤（1）中获得的土样静置10-20min，取上清液2-4mL放入50mL富集培养基中，30-37℃，100-200rpm下培养12-24h。

[0022] 取步骤（2）获得的富集培养液2-3mL，梯度稀释成10-5-10-9，涂布于血平板，30-37℃下培养12-24h。

[0023] 选择步骤（3）中溶血圈大的菌株进行排油圈试验。排油圈最大的菌株就是枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723。

[0024] 其中，步骤（2）中所用的富集培养基组成为：葡糖糖10-20g/L，酵母粉3-5g/L，蛋白胨3-5g/L，七水合硫酸镁2-4g/L。

[0025] 步骤（3）中所用的血平板的配方为：酵母粉5-10g/L，蛋白胨10-12g/L,氯化钠10-12g/L，脱纤维除菌绵羊血8%，琼脂2%。

[0026] 步骤（4）中所用的排油圈试验的具体步骤是：取直径为9cm的培养皿，加入20mL的蒸馏水，在水中央加入200μL的用苏丹红 染色的煤油形成一薄层油膜，在煤油中间慢慢加入一滴发酵上清液，测定排油圈的直径。煤油是经过苏丹红 染色的，煤油：苏丹红的比例是200:1。

[0027] 步骤（4）中所用的乳化值测定的具体步骤是：取一个刻度试管，加入5mL发酵上清液和5mL煤油，在高速下振荡2min，然后在室温下静置24h，测定乳化值。乳化值=乳化层的高度/总高度×100%。

[0028] 步骤（4）中所用的表面张力的测定的具体方法是：取20mL左右的发酵上清液于小烧杯中，用BZY-3B表面张力仪测定表面张力。

[0029] 本发明还提供了枯草芽孢杆菌723的培养方法：将枯草芽孢杆菌723接种于活化培养基中培养以得到种子培养液，然后将种子培养液接种于发酵培养基中以得到脂肽类表面活性剂。

[0030] 具体地，挑一环经斜面培养12-24h的枯草芽孢杆菌723接种于活化培养基中，30-37℃，100-200rpm下培养12-24h以得到种子培养液。然后按2%-4%的接种量将种子培养液接种于发酵培养基中，30-37℃，100-200rpm下培养24-48h以得到脂肽类表面活性剂。 [0031] 本发明的有益效果在于：

[0032] 枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723的CMC值仅为25mg/L,远远低于一般化学表面活性剂的CMC值。枯草芽孢杆菌723发酵24h后生物表面活性剂的产量即可以达到15g/L。因此，枯草芽孢杆菌723具有产量高、发酵周期短的优点。枯草芽孢杆菌723可以利用食用油、甘油、石蜡、煤油、正己烷、废弃油来生产生物表面活性剂，因此不但可以应用于石油开采工业，而且可以用来分解环境中的废弃油以避免污染，具有多种功效。

[0033] 实施例1：菌株筛选

[0034] 初筛：

[0035] 取1g胜利油田的土样放入50mL的生理盐水中，在30-37℃,100-200rpm条件下振荡3-5h。静置10-20min,取上清液2-4mL放入50mL富集培养基中，30-37℃,100-200rpm-5 -9下培养12-24h。将获得的富集培养液2-3mL，梯度稀释成10 -10 ，涂布于血平板，30-37℃下培养12-24h。选择溶血圈大的菌株进行复筛。

[0036] 复筛：

[0037] 1）排油圈筛选：取直径为9cm的培养皿，加入20mL的蒸馏水，在水中央加入200μL的用苏丹红 染色的煤油形成一薄层油膜，在煤油中间慢慢加入一滴发酵上清液，测定排油圈的直径。煤油是经过苏丹红 染色的，煤油：苏丹红 的比例是200:1。

[0038] 2）乳化值筛选：选择排油圈大于4cm的菌株进行乳化值筛选，取一个刻度试管，加入5mL发酵上清液和5mL煤油，在高速下振荡2min，然后在室温下静置24h，测定乳化值。乳化值=乳化层的高度/总高度×100%。

[0039] 3）表面张力的测定：挑乳化值最大的几株菌株进行表面张力的测定，取20mL左右的发酵上清液于小烧杯中，用BZY-3B表面张力仪测定表面张力。表面张力最小的菌株就是我们需要的菌株。

[0040] 实施例2：菌株的生理生化试验

[0041] 1）接触酶实验：将培养24h的斜面菌种以铂丝接种环取一小环涂抹在已滴有3-10%过氧化氢的玻片上，如有气泡产生则为阳性，无气泡为阴性。

[0042] 2）氧化酶实验：滤纸用1%盐酸二甲基对苯二胺溶液浸湿，在室内悬挂风干后，剪裁成适当大小并在有橡皮塞的试管中密封保存，使用前用白金丝接种环将菌苔抹在滤纸上，10s内出现红色的为氧化酶阳性。

[0043] 3）淀粉水解：在肉汤中加0.2%可溶性淀粉，分装三角瓶，121℃蒸汽灭菌20min，倒平板备用。取新鲜斜面培养物点种于平板，适温培养2-5d，形成明显菌落后，在平板上滴加碘液，平板呈蓝黑色，菌落周围如有不变色透明圈表示淀粉水解阳性，仍是蓝黑色为阴性。 [0044] 4）柠檬酸盐利用：柠檬酸盐培养基斜面上划线接种，适温培养3-7d。培养基为碱性(指示剂蓝色或桃红色)者为阳性，否则为阴性。

[0045] 5）丙二酸盐利用：丙二酸盐培养基分装试管，121℃灭菌20min，同时制作不加丙二酸的空白对照。用幼龄菌种接种，适温培养1-2d，培养基由绿色变为蓝色为阳性;培养基颜色不变者为阴性。

[0046] 6）明胶液化：取培养18-24h的斜面培养物穿刺接种明胶液化培养基，同时有两支未接种的空白对照。20℃温箱中培养2、7、10、14和30d。结果观察：在20℃以下的室温观察生长情况和明胶液化情况，如有菌生长，明胶表面无凹陷且为稳定的凝块，则为明胶水解阴性。如明胶凝块部分或者全部在20℃以下变为可流动的液体，则为明胶水解阳性。 [0047] 7）V-P测定：接种实验菌于V-P培养液中，每次两个重复，置适温培养2-6d(如为阴性可适当延长培养时间)。操作与结果观察：取培养液和40%氢氧化钠等量混合。加少许肌酸，10min后如培养基出现红色，即为实验阳性反应(有时要放置更长时间才出现红色反应)。

[0048] 8）丙氨基酸脱氨酶:适当的浓度接种，37℃培养4h或8-24h测定。结果与观察：将试剂4-5滴滴到生长菌的斜面上，当斜面上与冷凝水中产生绿色，则为阳性反应，即表明已形成了苯丙酮酸，不变则为阴性。

[0049] 生理生化试验的结果如表1所示：

[0050] 表 1生理生化特征 菌株723 生理生化特征 菌株723
接触酶 ＋ 丙二酸盐利用 ＋
氧化酶 － 明胶液化 ＋
淀粉水解 ＋ V-P测定 ＋
柠檬酸盐利用 ＋ 苯丙氨基酸脱氨酶 －
葡萄糖 ＋ 吲哚 －

[0051] 注:“+”表示结果是阳性;“一”表示阴性结果。

[0052] 实施例3：枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtiLis）723对碳源的利用 [0053] 枯草芽孢杆菌723可以利用各种油作为碳源来生产生物表面活性剂，主要有食用油、甘油、石蜡、煤油、正己烷、废弃油。选择培养基的其它组成为：酵母粉3g/L,蛋白胨3g/L,KH2PO4 2.7g/L,NaCL 5g/L。碳源的浓度为20g/L。250mL的锥形瓶的装样量为50mL,接种量为2%，培养条件为37℃,200rpm。结果见表2。