一种鲤疱疹病毒2型的巢式PCR检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种鲤疱疹病毒2型的巢式PCR检测试剂盒，其特征在于：盒体(1)内衬垫(2)上放置6个盛有试剂的1.5mL离心管，包括10×反应缓冲液：含Tris-HCl100mM，KCl500mM，MgCl215mM，dNTPs2mM(3)，Taq酶1U/μL(4)，引物P1：含CyHV-2P1F、CyHV-2P1R各10μM(5)，引物P2：含CyHV-2P2F、CyHV-2P2R各10μM(6)，纯水(7)，阳性DNA10μg/mL(8)。外引物P1的序列为：CyHV-2P1F：TGAAATGTCAAAAGTGGATGG，CyHV-2P1R：TATTCCCAGACAGCCTTCAAA；内引物P2的序列为：CyHV-2P2F：GAACACCGCTGCTCATCATC，CyHV-2P2R：ACTCTTCGCAAGTCCTCACC。经过内外引物的两轮扩增，最终可获得357bp的DNA产物。本发明操作简单，方便快捷，检测限低，灵敏度高，检测结果准确可靠。

权利要求

1.一种鲤疱疹病毒2型的巢式PCR检测试剂盒，其特征在于：盒体(1)内衬垫(2)上放置6个盛有试剂的1.5mL离心管，包括10×反应缓冲液：含Tris-HCl100mM，KCl500mM，MgCl215mM，dNTPs2mM(3)，Taq 酶 1U/μL(4)，引 物 P1：含 CyHV-2P1F、CyHV-2P1R 各

10μM(5)，引物P2：含CyHV-2P2F、CyHV-2P2R各10μM(6)，纯水(7)，阳性DNA10μg/mL(8)；

上述各种液体试剂分别装在1.5mL离心管中，置于盒内；

CyHV-2P1F为：TGAAATGTCAAAAGTGGATGGCyHV-2P1R为：TATTCCCAGACAGCCTTCAAACyHV-2P2F为：GAACACCGCTGCTCATCATCCyHV-2P2R为：ACTCTTCGCAAGTCCTCACC。

说明书

一种鲤疱疹病毒2型的巢式PCR检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及水产养殖动物病原检测领域，更具体涉及一种鲤疱疹病毒2型（Cyprinidherpesvirus 2，CyHV-2）的基因检测试剂盒，适用于水产养殖中鲤疱疹病毒病2型的诊断、进出口检验检疫中鲤疱疹病毒病2型的快速检测。

背景技术

[0002] 鲤疱疹病毒2型（CyHV-2）是造成金鱼大量死亡的疱疹病毒性造血器官坏死病（herpesviral haematopoietic necrosis，HVHN）的病原，故也称为金鱼造血器官坏死病毒(goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV)。按照国际病毒系统分类委员会的系统命名规则，正式命名为鲤疱疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）。该病毒于1992年秋季和1993年春季因造成日本西部养殖的金鱼大量死亡而被首次发现，其致死率高达100%。该病随后在美国，中国台湾，澳大利亚和英国相继爆发，给金鱼养殖造成了巨大的经济损失。近年来，我国鲫鱼（异育银鲫）主要养殖区的鲫鱼出现了大规模死亡，死亡率达
80%以上，经过电镜观察和分子检测，确定病原为CyHV-2。该病传播范围广、传染性强、发病快、致死率高，已给我国鲫鱼养殖业造成了巨大的经济损失，成为我国水产养殖中危害最为严重的病毒性疾病之一。

[0003] 细胞培养分离技术是病毒诊断的有效方法，通常是世界动物卫生组织（OIE）推荐的鱼类病毒检测的首选方法。但现有研究资料表明，CyHV-2很难在现有的鱼类细胞系中增殖。胖头鲤细胞（fathead minnow cells，FHM)、鲤鱼上皮瘤细胞（epithelioma papillosum cyprini，EPC)、鳗鱼肾细胞（eel kidney，EK-1）、鲑鱼胚胎细胞（chinook salmon embryo，CHSE-214）、虹鳟鱼性腺细胞（rainbow trout gonad，RTG-2）和罗非鱼卵巢细胞（tilapia ovary，TO-2）均对CyHV-2不敏感。仅锦鲤鳍细胞（koi fin 1，KF-1）能产生特征性的细胞病变效应（CPE），但可惜的是，病毒在KF-1细胞上传至第3代后，CPE消失。可见目前阶段，细胞培养不是CyHV-2诊断的有效方法，基于病毒基因检测的技术就成为了CyHV-2最有效的检测方法。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增技术作为最基本的基因扩增技术，现在广泛应用于分子生物学的各个领域，在病毒鉴定领域也得到了广泛的应用。然而其扩增结果受限于检测对象的模板含量，当模板量很少时，常常获得阴性结果。在鱼病学领域，患病鱼体内的病毒量通常很低，使用传统的常规PCR检测技术通常由于其灵敏度不够而出现假阴性结果，无法满足水产养殖病害诊断以及口岸检疫工作的需要。巢式PCR扩增技术是一种建立在常规PCR技术上的新技术，其设计两套PCR引物（巢式引物）对模板进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，以此扩增产物作为模板用内引物进行第二轮扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的模板很少）因而增加了检测的敏感性，同时又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。目前未见CyHV-2的巢式PCR试剂盒的报道。

发明内容

[0004] 针对现有技术的不足，本发明的目的是在于提供了一种鲤疱疹病毒2型的巢式PCR检测试剂盒，本发明操作简单，方便快捷，检测限低，灵敏度高，检测结果准确可靠。

[0005] 本发明以抽提自患病鱼组织的病毒DNA作为PCR扩增模板，用两对嵌套式引物对模板DNA进行扩增，可以在较短时间内完成整个PCR检测，不但极大地提高了检测灵敏度，而且缩短了检测时间，且结果准确可靠，是一种有效的鲤疱疹病毒2型分子生物学检测方法。

[0006] 为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

[0007] 一种鲤疱疹病毒2型的巢式PCR检测试剂盒，包括盒体，盒内衬垫上放置6个盛有试剂的1.5mL离心管，包括10×反应缓冲液，Taq酶(1U/μL)，引物P1(含CyHV-2P1F、CyHV-2P1R各10μM)，引物P2(含CyHV-2P2F、CyHV-2P2R各10μM)，纯水(分子生物学级)，阳性DNA(10μg/mL)。

[0008] 所述的10×反应缓冲液的配方为：Tris-HCl 100mM，KCl 500mM，MgCl215mM，dNTPs2mM。

[0009] 所述的Tris-HCl为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐；KCl为氯化钾；MgCl2为氯化镁；dNTPs为合成DNA所需的四种脱氧核苷酸的等体积混合液。

[0010] 上述各种液体试剂分别装在1.5mL离心管中，置于盒内。

[0011] 所述的引物核苷酸序列为：

[0012] CyHV-2P1F为：TGAAATGTCAAAAGTGGATGG

[0013] CyHV-2P1R为：TATTCCCAGACAGCCTTCAAA

[0014] CyHV-2P2F为：GAACACCGCTGCTCATCATC

[0015] CyHV-2P2R为：ACTCTTCGCAAGTCCTCACC

[0016] 一种鲤疱疹病毒2型的巢式PCR检测试剂盒，其检测步骤是：

[0017] 1)检测前检测样本DNA的提取：取适量濒死的患病鱼鰓丝、脾脏、肾脏组织，用玻璃匀浆器匀浆，5000rpm于4℃离心10分钟，取适量匀浆上清液用DNA提取试剂提取DNA。

[0018] 2)外引物P1的PCR扩增：制备PCR反应体系20μL：10×PCR反应缓冲液2μL，Taq酶(1U/μL)1μL，外引物P10.5μL，DNA模板4μL，纯水补足至20μL。同时取阳性对照DNA模板做阳性对照，取纯水做阴性对照。PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，30个循环后72℃5分钟。

[0019] 3)内引物P2的PCR扩增：取1μL外引物P1的扩增产物作为模板，以内引物P2为引物进行PCR扩增，其他反应成分和反应条件同第一次扩增。

[0020] 4)扩增产物检测与分析：1~2%(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测目的条带并成像分析。

[0021] 5)结果判定：

[0022] A.当检测样本和阳性对照的扩增条带大小一致，为357bp时，结果为阳性；

[0023] B.当检测样本无条带或条带大小与阳性对照的扩增条带大小不一致，不为357bp时，结果为阴性；

[0024] C.当阳性对照无条带时，表明试剂盒中相关试剂降解，试剂盒失效；

[0025] D.当阴性对照出现条带时，操作过程中有试剂污染，检测结果无效。

[0026] 本发明的有益效果是：

[0027] 本发明检测鲤疱疹病毒2型的巢式PCR试剂盒，提供一种检测高致病性的鱼类病毒的分子检测技术，尤其是能快速、简便、准确的检测病原的试剂盒，能在8小时内完成检测。

[0028] 本发明提供了一种依赖PCR的分子检测试剂盒，克服细胞分离培养、电镜超薄切片观察、ELISA检测等病毒诊断方法繁琐、效率低、可靠性差、成本高的不足。该试剂盒能快速、灵敏、准确地检测到病原，并可直接从患病鱼组织中检测到病毒病原。大大简化了检测程序，提高了检测水平，同时为病害防治策略的制定提供了技术依据。

[0029] 通过对鲤疱疹病毒2型的特异性检测，经过外引物CyHV-2P1F和CyHV-2P1R，以及内引物CyHV-2P2F和CyHV-2P2R对目标病毒进行两轮PCR扩增，获得357bp的单一PCR产物，可以特异的检测目标病毒。但是对于锦鲤疱疹病毒(KHV)、大鲵虹彩病毒(GSIV)、斑点叉尾鮰病毒(CCV)、鳗鱼疱疹病毒(HVA)等4种DNA病毒，均无扩增产物。

[0030] 通过灵敏度的检测，对克隆有目的基因的T载体进行常规PCR和巢式PCR检测比3
较，发现常规PCR扩增的最低检测限为10 个拷贝，而巢式PCR最低检测限为10个拷贝。

附图说明

[0031] 图1为一种鲤疱疹病毒2型的巢式PCR检测试剂盒的示意图。

[0032] 其中1为盒体，2为衬垫，3为10×反应缓冲液，4为Taq酶，5为引物P1，6为引物P2，7为纯水，8为阳性DNA。

[0033] 图2是发明实施例患病鱼的CyHV-2检测结果示意图。

[0034] 其中M为Takara DL1000DNA Marker，1~5为检测样本，6为阳性对照，7为阴性对照。

具体实施方式

[0035] 以下结合实施例对本发明的原理与特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

[0036] 实施例1：

[0037] 一种鲤疱疹病毒2型的巢式PCR检测试剂盒，包括盒体（1），盒内衬垫（2）上放置6个盛有试剂的1.5mL离心管，包括10×反应缓冲液（3），Taq酶(1U/μL)（4），引物P1(包含CyHV-2P1F、CyHV-2P1R各10μM)（5），引物P2(包含CyHV-2P2F、CyHV-2P2R各10μM)（6），纯水(分子生物学级)（7），阳性DNA(10μg/mL)（8）。

[0038] 所述的10×反应缓冲液的配方为：Tris-HCl 100mM，KCl 500mM，MgCl215mM，dNTPs2mM。

[0039] 所述的Tris-HCl为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐；KCl为氯化钾；MgCl2为氯化镁；dNTPs为合成DNA所需的四种脱氧核苷酸的等体积混合液。

[0040] 上述各种液体试剂分别装在1.5mL离心管中，置于盒内。

[0041] 所述的引物核苷酸序列为：

[0042] CyHV-2P1F为：TGAAATGTCAAAAGTGGATGG

[0043] CyHV-2P1R为：TATTCCCAGACAGCCTTCAAA

[0044] CyHV-2P2F为：GAACACCGCTGCTCATCATC

[0045] CyHV-2P2R为：ACTCTTCGCAAGTCCTCACC

[0046] 实施例2：

[0047] 一种鲤疱疹病毒2型的巢式PCR检测试剂盒，包括盒体1，盒内衬垫2上放置6个盛有试剂的1.5mL离心管，包括10×反应缓冲液3，Taq酶(1U/μL)4，引物P1(包含CyHV-2P1F、CyHV-2P1R各10μM)5，引物P2(包含CyHV-2P2F、CyHV-2P2R各10μM)6，纯水(分子生物学级)7，阳性DNA(10μg/mL)8。

[0048] 所述的10×反应缓冲液的配方为：Tris-HCl 100mM，KCl 500mM，MgCl215mM，dNTPs2mM。

[0049] 所述的Tris-HCl为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐；KCl为氯化钾；MgCl2为氯化镁；dNTPs为合成DNA所需的四种脱氧核苷酸的等体积混合液。

[0050] 所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

[0051] 1)检测前检测样本DNA的提取：取适量濒死的患病鱼鰓丝、脾脏、肾脏组织，用玻璃匀浆器匀浆，5000rpm于4℃离心10分钟，取适量匀浆上清液用DNA提取试剂提取DNA。

[0052] 2)外引物P1的PCR扩增：制备PCR反应体系20μL：10×PCR反应缓冲液2μL，Taq酶(1U/μL)1μL，外引物P10.5μL，DNA模板4μL，纯水补足至20μL。同时取阳性对照DNA模板做阳性对照，取纯水做阴性对照。PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，30个循环后72℃5分钟。

[0053] 3)内引物P2的PCR扩增：取1μL外引物P1的扩增产物作为模板，以内引物P2为引物进行PCR扩增，其他反应成分和反应条件同第一次扩增。

[0054] 4)扩增产物检测与分析：1~2%(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测目的条带并成像分析。

[0055] 5)结果判定：

[0056] E.当检测样本和阳性对照的扩增条带大小一致，为357bp时，结果为阳性；

[0057] F.当检测样本无条带或条带大小与阳性对照的扩增条带大小不一致，不为357bp时，结果为阴性；

[0058] G.当阳性对照无条带时，表明试剂盒中相关试剂降解，试剂盒失效；

[0059] H.当阴性对照出现条带时，操作过程中有试剂污染，检测结果无效。

[0060] 实施例3：

[0061] 对5个自然感染的患病鱼组织样本的检测：

[0062] 随机抽取患典型病症的鲫鱼，取适量鰓组织于玻璃匀浆器匀浆，取匀浆上清液0.25mL用DNAzol提取病毒DNA模板，用试剂盒中的试剂进行巢式PCR检测。检测结果用
1%(W/V)琼脂糖凝胶电泳及成像系统分析。结果表明（附图2），所检测的5个鲫鱼样本均为CyHV-2阳性，此结果和电镜超薄切片观察结果完全一致。

[0063] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本实施，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。