一种柳杉组织培养快速繁殖方法

摘要

本发明公开了一种柳杉组织培养快速繁殖方法，包括：取柳杉外植体茎段，接种于诱导不定芽培养基DCR＋0.1~2.0mg/L6-BA＋0.1~2.0mg/LIBA＋0.5~5.0g/LAC＋0.001~0.01mg/LTDZ+30g/L蔗糖，诱导培养产生不定芽；生根培养采用两阶段发根，即先放入生根培养基1为：1/2DCR＋0.1~2.0mg/LNAA＋0.1~2.0mg/LIBA+0.1~1.0mg/L6-BA+1.0~10.0g/LAC＋10.0~30.0g/L蔗糖，先进行2~15d暗培养后，放入光照下培养5~30d后，转接于生根培养基2为：DCR+0.1~1.0mg/LNAA＋0.1~1.0mg/L6-BA+0.5~5.0g/LAC+30.0g/L蔗糖。通过本方法，嫩芽增殖系数达到5.7以上，生根率为80%以上。培养周期短，繁殖量大，有利于规模化生产。

权利要求

1.一种柳杉组织培养快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取柳杉外植体茎段，接种于诱导不定芽培养基，诱导培养产生不定芽；其中，诱导不定芽培养基为：DCR＋1.0mg/L 6-BA＋0.5mg/L IBA＋0.01mg/L TDZ＋3.0g/L AC+30.0g/L蔗糖；

（2）生根培养采用两阶段发根：先将已伸长且生长较健壮的嫩芽放入生根培养基1，进行2~15d暗培养后，放入光照下培养5~30d；然后转接于生根培养基2，继续培养至生根；

其中，生根培养基1为：1/2DCR＋0.1~2.0mg/L NAA＋0.1~2.0mg/L IBA＋0.1~1.0mg/L

6-BA+1.0~10.0g/L AC＋10.0~30.0g/L蔗糖，生根培养基2为：DCR+0.1~1.0mg/L NAA＋

0.1~1.0mg/L 6-BA+0.5~5.0g/L AC+30.0g/L蔗糖；

步骤（2）中，所述光照下的光照时间为14~16h，光照强度为1200~1300Lux，温度为

25~28℃；在所述的1/2DCR培养基配方中，大量元素比常规DCR减少1/2的量。

2.根据权利要求1所述的柳杉组织培养快速繁殖方法，其特征在于：步骤（2）中，所述生根培养基1为：1/2DCR＋1.0mg/L 6-BA＋0.1~2.0mg/L IBA＋2.0mg/L NAA＋5.0g/L AC＋10.0~30.0g/L蔗糖。

3.根据权利要求1所述的柳杉组织培养快速繁殖方法，其特征在于：步骤（2）中，所述生根培养基2为：DCR+0.1~1.0mg/L NAA＋0.1~1.0mg/L 6-BA＋3.0g/L AC＋30.0g/L蔗糖。

说明书

一种柳杉组织培养快速繁殖方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物组织培养繁殖技术领域，具体涉及一种柳杉组织培养快速繁殖方法，特别是一种以柳杉茎段为外植体材料，用自制培养基先诱导柳杉产生不定芽，进而诱导生根获得再生植株。

背景技术

[0002] 柳杉（Cryptomeria fortunei）为杉科柳杉属（Cryptomeria D. Don），别名孔雀杉，乔木，高达4m，胸径可达2m多；树皮红棕色，纤维状，裂成长条片脱落；大枝近轮生，平展或斜展；小枝细长，常下垂，绿色，枝条中部的叶较长，常向两端逐渐变短。叶钻形略向内弯曲，先端内曲，四边有气孔线，长1~1.5cm，果枝的叶通常较短，幼树及萌芽枝的叶长达2.4cm。

[0003] 柳杉是我国重要的用材树种之一。在我国柳杉主要分布于福建、浙江、江西等省。由于受经济利益的驱使，近年来柳杉资源遭受严重破坏，再加上酸雨、大气污染的危害和病虫侵害，目前大径柳杉已屈指可数。目前柳杉以种子繁育为主，扦插也可采用，但通常发芽率、合格苗率低。对其繁殖的研究也主要对实生苗繁育技术的研究。因此，利用生物技术方法进行人工快速繁殖，对柳杉的资源保护有重要意义。

[0004] 张翠萍（2008）初步研究了其组织培养快速繁殖技术，但该研究以柳杉种胚为外植体，不适合具优良基因型柳杉个体的繁殖培养，且在实验中只采用了MS为基本培养基，对外源激素的添加只采用了单因素设计，未对其他基本培养基和组合激素进行选择培养实验。本申请人选取优良基因型柳杉茎段作为外植体材料，通过实验选择DCR为最适基本培养基，对外源激素的添加进行了多因素设计，并添加活性炭等，为柳杉的组织培养快速繁殖提供了有效途径。

发明内容

[0005] 发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种组织培养快速繁殖柳杉的方法。

[0006] 技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

[0007] 一种柳杉组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：

[0008] （1）取柳杉外植体茎段，接种于诱导不定芽培养基，诱导培养产生不定芽；其中，诱导不定芽培养基为：DCR＋0.1~2.0mg/L 6-BA（6-苄基嘌呤）＋0.1~2.0mg/L IBA（吲哚丁酸）＋0.5~5.0g/L AC（活性炭）＋0.001~0.01mg/L TDZ（噻苯隆）+30.0g/L蔗糖；

[0009] （2）生根培养采用两阶段发根：先将已伸长且生长较健壮的嫩芽放入生根培养基1，进行2~15d暗培养后，放入光照下培养5~30d；然后转接于生根培养基2，继续培养至生根；其中，生根培养基1为：1/2DCR＋0.1~2.0mg/L NAA＋0.1~2.0mg/L IBA＋0.1~1.0mg/L 6-BA+1.0~10.0g/L AC＋10.0~30.0g/L蔗糖，生根培养基2为：DCR+0.1~1.0mg/L NAA＋
0.1~1.0mg/L 6-BA+0.5~5.0g/L AC+30.0g/L蔗糖。

[0010] 步骤（1）中，所述诱导不定芽培养基为：DCR＋1.0mg/L 6-BA＋0.5mg/L IBA＋0.01mg/L TDZ＋3.0g/L AC+30g/L蔗糖。

[0011] 步骤（2）中，所述生根培养基1为：1/2DCR＋2.0mg/L NAA＋1.0mg/L IBA＋0.5mg/L 6-BA＋0.5mg/L IBA＋5.0g/L AC＋25g/L蔗糖。

[0012] 步骤（2）中，所述生根培养基2为：DCR+0.5mg/L NAA＋0.5mg/L 6-BA＋3.0g/L AC＋30.0g/L蔗糖。

[0013] 步骤（2）中，在所述的1/2DCR培养基配方中，大量元素比常规DCR减少1/2的量。

[0014] 步骤（2）中，所述光照下的光照时间为14~16h，光照强度为1200~1300Lux，温度为25~28℃。

[0015] 该方法，选取优良基因型柳杉茎段作为外植体材料，通过以DCR为最适基本培养基，对外源激素的添加进行了多因素设计，并添加活性炭等，为柳杉的组织培养快速繁殖提供了有效途径。

[0016] 有益效果：与现有技术相比，本发明的显著优点是：以具优良基因型柳杉个体茎段为外植体，以DCR为基本培养基，附加不同种类、不同浓度的植物生长调节剂和活性炭诱导芽增殖和诱导生根，通过本方法，嫩芽增殖系数达到5.7以上，生根率为80%以上。培养周期短，繁殖量大，有利于规模化生产。

附图说明

[0017] 图1诱导获得的柳杉不定芽；

[0018] 图2诱导生根后形成柳杉完整植株。

具体实施方式

[0019] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

[0020] 以下实施例可以使本领域技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

[0021] 实施例1

[0022] 选取生长健壮的柳杉茎段，剪去茎段上的针叶，将茎段剪成4cm左右，流水冲洗1~2h，置于75%乙醇中灭菌30s，再用50%的84消毒液（内含少量吐温-20，每50mL加一滴）消毒10min，无菌水冲洗8次，再将茎段剪成2cm左右，接种于诱导不定芽培养基，光照诱导培养8d后开始产生不定芽；不定芽产生后，选取生长教健壮的嫩芽转接于生根培养基1，先暗培养2~15d后，放入光照下培养2~30d后，再转接于生根培养基2中，约10d开始生根。其中，诱导不定芽培养基为：DCR＋0.1~2.0mg/L 6-BA＋0.1~2.0mg/L IBA＋0.001~0.01mg/L TDZ＋0.5~5.0g/L AC；生根培养基1为：1/2DCR＋0.1~2.0mg/L NAA＋0.1~2.0mg/L IBA＋0.1~0.5mg/L 6-BA＋1.0~10.0g/L AC＋10.0~30.0g/L蔗糖，生根培养基2为：
DCR+0.1~1.0mg/L NAA＋0.1~1.0mg/L 6-BA+0.5~5.0g/LAC+30.0g/L蔗糖。

[0023] 实施例2

[0024] 按实施例1所述相同步骤重复进行实验，在各个诱导培养阶段，分别添加不同剂量的活性炭（0.5~10.0g/L），其中，诱导不定芽培养基中添加活性炭0.5~5.0g/L，生根培养基1中添加活性炭1.0~10.0g/L，生根培养基2中添加0.5~5.0g/L，可明显促进柳杉生长健壮，叶绿，有效防止幼苗黄化褐化的发生，并在诱导生根阶段促进生根。

[0025] 实施例3

[0026] 按实施例1所述相同步骤重复进行实验，在诱导生根阶段，所采用的1/2DCR培养基中的大量元素比常规DCR减少1/2的量。结果见表1，能明显促进诱导生根，使生根率提高到85%。

[0027] 表1 培养基中大量元素对柳杉生根的影响

[0028]

[0029] 实施例4

[0030] 按实施例1所述相同步骤重复进行实验，在诱导生根阶段，将培养基中蔗糖浓度从3%降低到2%，以降低培养基的渗透压，结果见表2，有效促进植株生根。

[0031] 表2 培养基中蔗糖浓度对柳杉生根的影响

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