一种具有促血管新生作用的中药提取物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种具有促血管新生作用的中药提取物及其制备方法和应用，以黄芪和当归作为原料，通过水提醇沉、树脂分离纯化、有机溶媒萃取、层析分离得到的具有药用活性的有效部位。该有效部位能够作为药用成分制成适宜的中成药制剂，方便使用，提高药用的安全性。本发明提供的具有促血管新生作用的中药提取物，可应用于一系列血管新生不足或低下所引起的疾病，也可用于通过调整机体或组织的血管新生及其功能状态达到预防或治疗疾病的目的。

权利要求

1.一种具有促血管新生作用的中药提取物，其特征在于，该中药提取物的提取原料药为黄芪和当归，其提取是将黄芪和当归按质量比为5:1混合，该中药提取物是按照以下步骤制得的：

1)取1000g黄芪和200g当归，分别经过冲洗、干燥后粉碎成粗粉混合，按生药8倍量、

6倍量和6倍量加水浸泡，分别按2小时、2小时和1.5小时煎煮提取，合并药液浓缩，得到

1500mL浓缩液；

浓缩液加乙醇至含醇量达80％，搅拌均匀后4℃冷藏条件下静置24小时，待沉淀完全后过滤，得沉淀A和上清液B，上清液B减压回收乙醇，至浓缩液无醇味，得到1700mL浓缩液；

2)将浓缩液上至已处理好的D101树脂柱，先用水洗脱至流出液无色，然后再用80％乙醇进行洗脱，洗脱的流速为1.0mL/min，收集洗脱液；

洗脱液回收溶剂，浓缩至60℃测时相对密度1.06-1.10；分别得到水洗脱液提取物C和醇洗脱液提取物D；

3)将醇洗脱提取物D用水稀释溶解，加乙酸乙酯进行萃取，萃取三次，每次加入量为

300mL，合并乙酸乙酯萃取液，进行减压浓缩，浓缩温度为50℃，真空度为0.09Mpa，浓缩至

50℃测时溶液相对密度0.90～0.95，得到乙酸乙酯萃取物E和水溶物F；

4)采用高压液相制备液相对乙酸乙酯萃取物E进行固定相层析分离，所述固定相为C8或C18，分离液在真空度为0.09Mpa，温度为60℃下，真空干燥10～20小时，用体积比17:83的乙腈-水洗脱液进行洗脱，得到洗脱部分G，为中药提取物有效成分。

2.如权利要求1所述的具有促血管新生作用的中药提取物，其特征在于，所述中药提取物以黄芪甲苷、阿魏酸和毛蕊异黄酮苷的质量分数计，所含黄芪甲苷不少于5％、所含阿魏酸不少于2％、所含毛蕊异黄酮苷不少于2％。

3.一种具有促血管新生作用的中药提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取1000g黄芪和200g当归，分别经过冲洗、干燥后粉碎成粗粉混合，按生药8倍量、

6倍量和6倍量加水浸泡，分别按2小时、2小时和1.5小时煎煮提取，合并药液浓缩，得到

1500mL浓缩液；

浓缩液加乙醇至含醇量达80％，搅拌均匀后4℃冷藏条件下静置24小时，待沉淀完全后过滤，得沉淀A和上清液B，上清液B减压回收乙醇，至浓缩液无醇味，得到1700mL浓缩液；

2)将浓缩液上至已处理好的D101树脂柱，先用水洗脱至流出液无色，然后再用80％乙醇进行洗脱，洗脱的流速为1.0mL/min，收集洗脱液；

洗脱液回收溶剂，浓缩至60℃测时相对密度1.06-1.10；分别得到水洗脱液提取物C和醇洗脱液提取物D；

3)将醇洗脱提取物D用水稀释溶解，加乙酸乙酯进行萃取，萃取三次，每次加入量为

300mL，合并乙酸乙酯萃取液，进行减压浓缩，浓缩温度为50℃，真空度为0.09Mpa，浓缩至

50℃测时溶液相对密度0.90～0.95，得到乙酸乙酯萃取物E和水溶物F；

4)采用高压液相制备液相对乙酸乙酯萃取物E进行固定相层析分离，所述固定相为C8或C18，分离液在真空度为0.09Mpa，温度为60℃下，真空干燥10～20小时，用体积比17:83的乙腈-水洗脱液进行洗脱，得到洗脱部分G，为中药提取物有效成分。

4.权利要求1所述的具有促血管新生作用的中药提取物在制备促血管形成和/或新生药物中的应用；

或者在制备改善血管新生不足或低下的药物中的应用；

或者在制备调整机体或组织的血管新生及状态的药物中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的药物包括：抗心肌缺血、抗脑组织缺血、抗外周组织缺血的药物；

抗溃疡、抗闭塞性脉管炎、抗糖尿病并发症的药物；

促进伤口愈合、改善骨折愈合延迟的药物。

6.基于权利要求1所述的具有促血管新生作用的中药提取物的制剂，其特征在于，以所述中药提取物为药用成分，将其制备成固体、半固体或液体形式的制剂。

7.如权利要求6所述的具有促血管新生作用的中药提取物的制剂，其特征在于，所述的固体形式为片剂、散剂、颗粒剂、粉针剂或胶囊剂；半固体形式为乳剂、霜剂、软膏剂、糊剂；液体形式为以水或有机溶媒制成的注射剂、混悬剂、糖浆剂或喷雾剂，有机溶媒为乙醇、丙二醇或植物油。

说明书

一种具有促血管新生作用的中药提取物及其制备方法和应

用

技术领域

[0001] 本发明属于植物药用活性成分技术领域，涉及一种具有促血管新生作用的中药提取物及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 血管新生是指在原有毛细血管基础上通过血管内皮细胞的增殖与迁移，从先前存在的血管处生成新的毛细血管的过程。血管新生在胚胎发育、创伤愈合、子宫内膜周期性增殖、肿瘤、增殖性视网膜病变等生理、病理状态中起着重要作用。调节机体血管新生的失衡过程，已成为某些疾病治疗的新策略。通过促进血管新生，可治疗许多存在血管新生不足性疾病，如冠心病、创伤和骨折延迟愈合、闭塞性脉管炎等。由于目前尚未有促进血管新生的有效治疗药物，因此从中药及经典复方中筛选提取是新药研究的重要途径。

发明内容

[0003] 本发明解决的问题在于提供一种具有促血管新生作用的中药提取物及其制备方法和应用，是从中药经典名方当归补血汤中跟踪提取筛选得到有效部位，可应用于促血管形成和/或新生。

[0004] 本发明是通过以下技术方案来实现：

[0005] 一种具有促血管新生作用的中药提取物，该中药提取物的提取原料药为黄芪和当归，其提取是将黄芪和当归按质量比为5:1混合，经水提醇沉后回收乙醇所得的浓缩液上样于大孔吸附树脂，用水洗脱至流出液无色后再用体积浓度30～90%的乙醇溶液洗脱，收集洗脱馏分后回收乙醇，然后用有机溶剂萃取，再将有机溶剂萃取液回收溶剂后进行固定相层析分离，收集流动相洗脱所得馏分后干燥，得到当归补血汤有效部位。

[0006] 所述中药提取物以黄芪甲苷、阿魏酸和毛蕊异黄酮苷的质量分数计，所含黄芪甲苷不少于5%、所含阿魏酸不少于2%、所含毛蕊异黄酮苷不少于2%。

[0007] 一种具有促血管新生作用的中药提取物的制备方法，包括以下步骤：将黄芪和当归按质量比为5:1混合，经水提醇沉后回收乙醇所得的浓缩液上样于大孔吸附树脂，用水洗脱至流出液无色后再体积浓度30～90%的乙醇溶液洗脱，收集洗脱馏分后回收乙醇，然后用有机溶剂萃取，再将有机溶剂萃取液回收溶剂后进行固定相层析分离，收集流动相洗脱所得馏分后干燥，得到当归补血汤有效部位。

[0008] 所述的具有促血管新生作用的中药提取物的制备方法，包括以下步骤：

[0009] 1）将黄芪和当归按质量比为5:1分别粉碎后混合，用水浸泡后，煎煮提取或加热回流提取，提取完成后收集提取液，减压浓缩得到浓缩液；浓缩液加乙醇至含醇体积浓度达10～95%，搅拌均匀后常温或冷藏条件下静置，待沉淀完全后过滤得上清液，上清液回收乙醇至无味，得到醇沉液；

[0010] 2）将醇沉液回收乙醇所得的浓缩液上样于大孔吸附树脂，先用水洗脱至流出液无色，然后再用体积浓度30～90%的乙醇溶液洗脱，收集洗脱馏分，回收洗脱馏分中的乙醇，得到二次浓缩液；

[0011] 3）将二次浓缩液加水充分搅拌后加入有机溶剂萃取，分离有机相提取液并浓缩回收溶剂，得到三次浓缩液；

[0012] 4）三次浓缩液进行固定相层析分离，固定相为非极性固定相或三氧化二铝，流动相为水和与水互溶的有机溶剂的混合液，三次浓缩液上样于固定相后经流动相洗脱，收集洗脱馏分，真空或常温干燥后得到粉状的具有促血管新生作用的中药提取物。

[0013] 所述的将黄芪和当归粉碎混合后，用其质量5～10倍的水浸泡1～5h后，煎煮提取1.5～5h或加热回流提取1～5h，提取完成后收集提取液，减压浓缩得到浓缩液；

[0014] 所述的大孔吸附树脂为D-101、HPD722、AB-8、DA-201、DS401、DM-301、HPD-100、DM130或H-103，用水洗至无色后再用体积浓度为30～90%的乙醇溶液洗脱，洗脱的流速为1.0～2.0ml/min，收集醇洗脱液；

[0015] 所述的萃取的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿或正丁醇；

[0016] 所述的非极性固定相为C18、C8或大孔硅胶等，所述的与水互溶的有机溶剂为甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮或四氢呋喃，与水互溶的有机溶剂的加入以调节在固定相中的保留时间；固定相层析分离流动相的流速为1.0～100ml/min。

[0017] 所述的浓缩液或二次浓缩液的相对密度为1.06～1.10g/ml，第三次浓缩液的相对密度为0.90～0.95g/ml；

[0018] 所述的水与水互溶的有机溶剂的体积比为85:15～20:80。

[0019] 所述的具有促血管新生作用的中药提取物在制备促血管形成和/或新生药物中的应用；

[0020] 或者在制备改善血管新生不足或低下的药物的应用；

[0021] 或者在制备调整机体或组织的血管新生及状态的药物的应用。

[0022] 所述的药物包括：

[0023] 抗心肌缺血、抗脑组织缺血、抗外周组织缺血的药物；

[0024] 抗溃疡、抗闭塞性脉管炎、抗糖尿病并发症的药物；

[0025] 促进伤口愈合、改善骨折愈合延迟的药物。

[0026] 以所述中药提取物为药用成分，将其制备成固体、半固体或液体形式的制剂。

[0027] 所述的固体形式为片剂、散剂、颗粒剂、粉针剂或胶囊剂；半固体形式为乳剂、霜剂、软膏剂、糊剂；液体形式为以水或有机溶媒制成的注射剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂或喷雾剂，有机溶媒包括但不仅限于乙醇、丙二醇、植物油。

[0028] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

[0029] 本发明提供的具有促血管新生作用的中药提取物，是以黄芪和当归作为原料，通过水提醇沉、树脂分离纯化、有机溶媒萃取、层析分离得到的具有药用活性的有效部位。该有效部位能够作为药用成分制成适宜的中成药制剂，方便使用，提高药用的安全性。

[0030] 本发明提供的具有促血管新生作用的中药提取物，是经过对多种中草药和复方制剂进行筛选，并对筛选所得的当归补血汤结合多种分离方法逐步进行活性跟踪、最后确定-1的具有较强促血管新生活性的提取部位。在鸡胚尿囊膜模型上，相当于原生药1g·mL 当归补血汤有效部位表现出了明显的促进血管新生作用，其作用强于所含的阿魏酸和黄芪甲苷、毛蕊异黄酮苷等主要成分。

[0031] 本发明提供的具有促血管新生作用的中药提取物，可应用于一系列血管新生不足或低下所引起的疾病，也可用于通过调整机体或组织的血管新生及其功能状态达到预防或治疗疾病的目的。

[0032] 说明书附图

[0033] 图1-1～1-9为不同中药组CAM血管形态比较结果图；

[0034] 图2为黄芪甲苷的固定相检测图谱；

[0035] 图3为阿魏酸的固定相检测图谱。

具体实施方式

[0036] 本发明提供一种具有促血管新生作用的中药提取物及其制备和应用，从当归补血汤提取出具有药用效果的有效部位。下面结合具体的实施例和促血管新生的效果验证对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

[0037] 实施例1

[0038] 中药及中药复方促血管新生作用的筛选

[0039] 以中药材或中药复方的药理作用为依据，选择可能具有促血管新生作用的中药黄芪、丹参、当归、三七以及中药复方归补血汤、桃红四物汤和血府逐瘀汤为对象，采用鸡胚尿囊膜模型（CAM）为测试手段，筛选评估其中作用最强的中药或中药复方。

[0040] 1、仪器与材料

[0041] 裕丰全自动孵化机（山东德州科裕孵化设备有限公司）；超净工作台（北京昌平长城空气精华工程公司）；重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用溶液（bFGF，63000IU/15mL，珠海亿胜生物制药有限公司，批号20110908）；中药饮片（西安中药集团南郊公司，经西安交通大学医学院药学系生药教研室鉴定）；种蛋购自陕西省军区农副业生产基地，每枚重50-60g，种蛋产出一周内用于实验；明胶海绵（金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂，规格：6cm×2cm×0.5cm）。

[0042] 2、方法

[0043] 2.1样品制备按方分别称取当归补血汤（黄芪90g、当归18g）、桃红四物汤（桃仁9g，红花6g，熟地12g，川芎6g，白芍9g，当归9g）、血府逐瘀汤（当归9g，桃仁12g，红花9g，生地9g，枳壳6g，赤芍6g，柴胡3g，甘草6g，桔梗4.5g，川芎4.5g，牛膝9g）及黄芪、丹参、当归、三七各10g；上述单味或复方中药分别加水煎煮2次（第一次2h，第二次1h），合并煎煮液并浓缩至1g/mL，过滤，取上清液湿热灭菌，4℃保存备用。

[0044] 2.2明胶海绵载体制备

[0045] 明胶海绵无菌条件下用打孔器制作直径为0.5cm的载体，生理盐水浸润，挤干备用。

[0046] 2.3种蛋孵育选择蛋壳清洁、无破损、新鲜(产出时间1周内)的受精鸡蛋，温水清洗后，于1:1000新洁尔灭溶液中浸泡3-5min，揩干，气室端朝上，置于孵化机孵育7d。温度控制在37.8±0.5℃，相对湿度50%～60%RH，换气及翻蛋周期均为2h。

[0047] 2.4药物对CAM的作用

[0048] 种蛋孵育第8天，在照卵灯下检查胚胎孵育及存活情况，弃去死精蛋及胚胎发育不良的种蛋。采用完全随机实验设计方法，将种蛋随机分组，即生理盐水对照组、bFGF阳性对照组和样品组，每组约20只鸡蛋。75%酒精消毒蛋气室表面，用砂轮及眼科镊开启约直径1cm左右的窗口，暴露CAM，用微量加样器向载体上滴加对照品及不同待测样品20uL，将含药载体置于CAM中央血管稀少区，透明胶带封闭窗口，继续孵育3d。72h后，剪开透明胶带，由观察窗滴加福尔马林溶液5-10滴，固定CAM 15-20min，去掉CAM平面以上的卵壳及卵壳膜，剪下以载体为中心的测试区域CAM，展开平铺于滤纸上。

[0049] 2.5血管计数以滤纸为背景，以微距模式拍摄新鲜取下CAM样本，观察载体边缘1mm内血管数目。以载体为中心发出，与载体半径的夹角小于45°者即可纳入计数。

[0050] 2.6统计分析数据以均数±标准差 表示，应用SPSS 13.0统计学软件对实验数据进行处理，不同药物及对照组进行组间两两比较。P<0.05为有统计学意义。

[0051] 3、结果

[0052] 3.1不同中药组CAM血管形态比较自然状态下鸡胚CAM血管生长呈叶脉状，脉络分布均匀。生理盐水、当归、三七组载体周围无特异性密集血管生成（见图1-1～图1-3）；bFGF组及其余给药组在载体周围可见到新生毛细血管从载体边缘垂直发出，呈不同程度辐射状密集生长，或具有明确趋向性血管生长区，结果见图1-1～图1-9。其中，图1-1为生理盐水组，图1-2为当归提取物，图1-3为三七归提取物，图1-4为黄芪归提取物，图1-5为bFGF对照组，图1-6为当归补血汤，图1-7为血府逐瘀汤，图1-8为丹参提取物，图1-9为桃红四物汤。

[0053] 3.2不同中药组CAM血管计数结果比较

[0054] 当归、三七组与阴性对照组比较CAM血管生成数目增加不明显（P＞0.05），而黄芪、丹参、血府逐瘀汤、当归补血汤、桃红四物汤与阴性对照比较，CAM血管生成数目增加较多（P＜0.05），尤其是当归补血汤增多明显，显示其促血管新生作用明显。结果见表1。

[0055] 表1不同药物对CAM血管新生的影响

[0056]组别 n 血管生成数
生理盐水组 18 11.9±3.9
bFGF组 17 26.7±17.4*
黄芪 19 16.0±9.7△
△
丹参 17 19.0±4.9
当归 17 14.2±5.3
三七 16 15.3±4.8
*
当归补血汤 18 23.3±7.9
血府逐瘀汤 18 18.2±2.2△
桃红四物汤 19 17.0±12.5

[0057] 注：与生理盐水比较，△P<0.05，*P<0.01，由于当归补血汤增多明显所以选择当归补血汤进行有效部位的提取。

[0058] 实施例2

[0059] 利用当归活血汤提取该有效部位的制备方法如下：

[0060] 黄芪和当归（5:1）经水提醇沉后上清液浓缩乙醇，浓缩至测定无醇味后，浓缩液上样于大孔吸附树脂，用水洗脱至流出液无色后再用体积浓度30～90%的乙醇溶液洗脱，收集洗脱馏分后回收乙醇，然后用有机溶剂萃取，将有机溶剂萃取液回收溶剂后经固定相层析分离，收集流动相洗脱所得馏分后干燥，得到具有促血管新生作用的中药提取物（当归补血汤提取物有效部位）。

[0061] 具体的，当归补血汤有效部位的制备方法，包括以下步骤：

[0062] 1）取选好的黄芪1000克和当归200克，分别经过冲洗、干燥后粉碎成粗粉混合，按生药8倍量、6倍量和6倍量加水浸泡，分别按2小时、2小时和1.5小时煎煮提取，合并药液浓缩，得到1500毫升的浓缩液；

[0063] 浓缩液加乙醇至含醇量达80%，搅拌均匀后4℃冷藏条件下静置24小时，待沉淀完全后过滤，得沉淀（A）和上清液（B），上清液减压回收乙醇，至浓缩液无醇味，得到浓缩液1700ml；

[0064] 2）将浓缩液上至已处理好的D101树脂柱，先用水洗脱至流出液无色，然后再用80%乙醇进行洗脱，洗脱的流速为1.0ml/min，收集洗脱液；

[0065] 洗脱液回收溶剂，浓缩至相对密度1.06-1.10（60℃测）；分别得到水洗脱液提取物（C）和醇洗脱液提取物（D）；醇洗脱液提取物为有效成分，水洗脱提取物理论为杂质。为了便于活性部位的筛选，因此水洗脱和醇洗脱提取物都留着，以进行后续的步骤。

[0066] 3）将醇洗脱提取物以适量的水稀释溶解，加乙酸乙酯一半量300ml萃取，萃取三次（每次加入量为300ml），合并乙酸乙酯萃取液，进行减压浓缩，浓缩温度为50℃，真空度为0.09Mpa，浓缩至溶液相对密度0.90-0.95（50℃测），得乙酸乙酯萃取物（E）和水溶物（F）；

[0067] 4）乙酸乙酯萃取物固定相层析分离，具体的使用高压液相制备液相进行制备分离，分离液进行真空干燥真空度为0.09Mpa，温度为60℃干燥10-20小时，分别用乙腈-水（体积比17:83）和乙腈-水（体积比32:68）进行洗脱，得到乙腈-水（17:83）体系洗脱部分（G）和乙腈-水（32:68）体系洗脱部分（H），当归补血汤有效部位G为0.5g，H为0.7g。

[0068] 当归活血汤提取物促进血管新生作用方面有效成分含黄芪甲苷和阿魏酸、毛蕊异黄酮苷及酯类等成分，用高效液相色谱法以黄芪甲苷（蒸发光散射检测器）和阿魏酸（紫外检测器）为对照进行检测（高效液相图谱见图1、图2），阿魏酸检测波长为316nm；当归活血汤提取物中有效部位以黄芪甲苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮苷计，黄芪甲苷不少于5%、阿魏酸不少于2%、毛蕊异黄酮苷不少于2%

[0069] 实施例3当归补血汤中促血管新生作用成分的筛选

[0070] 1、仪器、材料及方法均同实例1

[0071] 2、试验材料：尝试用不同方法对当归补血汤的成分进行提取分离，以CAM模型作为测试方法，逐步跟踪活性部位或成分。最终提取流程如实施例2所示，得到水提醇沉的沉淀A（主要为多糖）和醇溶部分B；由醇溶部分回收乙醇后，所得浓缩液进行大孔树脂分离的水洗脱液提取物C和醇洗脱液提取物D；由醇洗脱液提取物部分乙酸乙酯萃取得到的E和水溶物F；乙酸乙酯萃取物采用层析方法分离，得到乙腈-水（17:82）体系洗脱部分G和乙腈-水（32:68）体系洗脱部分H。上述测试材料在试验时均以生理盐水稀释至1g（生药）/ml浓度。

[0072] 3、结果

[0073] 如表2，阳性对照bFGF组和醇溶组（A）的血管生成数均明显性多于生理盐水对照组，而醇沉组（B）则无明显性差异，表明当归补血汤的促血管新生成分主要在醇溶部分。

[0074] 表2在CAM模型上当归补血汤水提醇沉成分的促血管新生作用观察

[0075]组别 n 一级血管生成数
生理盐水组 16 10.9±2.8
bFGF组 18 16.1±3.2#
醇沉组（A） 15 11.9±2.9
醇溶组（B） 17 15.1±4.7#

[0076] 注：与生理盐水组比较，#P<0.05

[0077] 对当归补血汤醇溶成分的进一步提取测试表明，大孔树脂分离的醇洗脱液提取物D和阳性对照bFGF一样均对鸡胚尿囊膜血管新生具有明显的促进作用，而水洗脱物则无明显的作用（结果见表3）。

[0078] 表3在CAM模型上当归补血汤及分离成分的促血管新生作用观察

[0079]组别 n 一级血管生成数
生理盐水组 18 11.5±2.9
bFGF组 16 17.5±4.0#
水洗脱物（C） 15 13.0±3.6
乙醇洗脱物(D) 16 16.3±4.8#

[0080] 注：与生理盐水组比较，#P<0.05

[0081] 对上述大孔吸附树脂乙醇洗脱物继续进行活性提取和跟踪。如表4所示，该乙醇洗脱物用乙酸乙酯提取后，乙酸乙酯提取部分的促血管新生作用明显，而水溶部分则与阴性对照组无明显性差异。

[0082] 表4在CAM模型上当归补血汤及分离成分的促血管新生作用观察

[0083]组别 n 一级血管生成数
生理盐水组 15 13.9±3.9
bFGF组 17 26.7±17.4#
乙酸乙酯萃取物组(E) 14 23.0±9.7#
水溶液组（F） 15 16.3±7.9

[0084] 注：与生理盐水组比较，#P<0.05

[0085] 将上述乙酸乙酯萃取物采用固定相层析方法继续进行分离纯化，得到有分离成分G和H。经测试，G部分的促血管新生效果明显性好于H。因此G部分为当归补血汤有效成分。

[0086] 表5在CAM模型上当归补血汤及分离成分的促血管新生作用观察

[0087]组别 n 一级血管生成数
生理盐水组 16 14.8±4.9
bFGF组 15 27.1±16.1#
乙腈-水（17:82）洗脱组（G） 18 24.2±9.2#
乙腈-水（32:68）洗脱组（H） 16 17.5±8.2

[0088] 注：与生理盐水组比较，#P<0.05

[0089] 经检测，上述提取的当归补血汤有效成分中含有阿魏酸3.3%、黄芪甲苷8.5%、毛蕊异黄酮苷7.8%。因此在CAM模型上进一步比较了当归补血汤有效成分与阿魏酸、黄芪甲苷对新生血管生成数量的影响。将当归补血汤有效成分制备成相当于1g/mL和10g/mL药材浓度的溶液（分别为0.4mg/mL和4mg/mL），另取阿魏酸、黄芪甲苷分别配制成0.4mg/mL浓度进行测试。结果如表6所示，与阴性对照相比，0.4mg/mL的阿魏酸、黄芪甲苷对促进CAM新生血管数量的增加无统计学意义；以此同时，两种浓度的当归补血汤有效成分对CAM血管生成均具有明显的促进作用，并且呈一定的剂量有相关性。显示当归补血汤有效成分的促血管新生作用强于阿魏酸或黄芪甲苷。

[0090] 表6当归补血汤中阿魏酸-黄芪甲苷混合物（G）组分的促血管新生作用[0091]组别 n 一级血管生成数
生理盐水组 15 16.6±3.3
bFGF组 17 22.4±5.6#
阿魏酸组 14 19.4±3.9
黄芪甲苷组 15 18.2±3.0
当归补血汤有效成分（1g/mL） 16 22.6±3.2#
当归补血汤有效成分（10g/mL） 19 27.6±5.0#

[0092] 注：与生理盐水组比较，#P<0.05

[0093] 实施例4

[0094] 具有促血管新生作用的中药提取物的制备方法，包括以下步骤：

[0095] 1）将黄芪和当归按质量比为5:1分别粉碎后混合，用水浸泡后，煎煮提取或加热回流提取，提取完成后收集提取液，减压浓缩得到浓缩液；浓缩液加乙醇至含醇体积浓度达50%，搅拌均匀后常温或冷藏条件下静置，待沉淀完全后过滤得上清液，上清液回收乙醇至无味，得到醇沉液；

[0096] 2）将醇沉液回收乙醇后所得的浓缩液上样于大孔吸附树脂，先用水洗脱至流出液无色，然后再用体积浓度50%的乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，回收洗脱馏分中的乙醇，得到二次浓缩液；

[0097] 所述的大孔吸附树脂为D-101、DA-201、DS401、DM-301、DM130或H-103，[0098] 3）将二次浓缩液加水充分搅拌使其溶解后，后加入有机溶剂萃取，分离有机相提取液并浓缩回收溶剂，得到三次浓缩液；

[0099] 所述的萃取的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿或正丁醇；

[0100] 4）三次浓缩液进行固定相层析分离，固定相为三氧化二铝，流动相为水和甲醇的混合液，三次浓缩液上样于固定相后经流动相洗脱，水与甲醇的体积比为85:15，收集洗脱馏分（可参照相应标准物的峰值时间进行收集），常温干燥后得到粉状的具有促血管新生作用的中药提取物。

[0101] 实施例5

[0102] 具有促血管新生作用的中药提取物的制备方法，包括以下步骤：

[0103] 1）将黄芪和当归按质量比为5:1分别粉碎后混合，用水浸泡后，煎煮提取或加热回流提取，提取完成后收集提取液，减压浓缩得到浓缩液；浓缩液加乙醇至含醇体积浓度达60%，搅拌均匀后常温或冷藏条件下静置，待沉淀完全后过滤得上清液，上清液回收乙醇至无味，得到醇沉液；

[0104] 2）将醇沉液回收乙醇后所得的浓缩液上样于大孔吸附树脂，先用水洗脱至流出液无色，然后再用体积浓度80%的乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，回收洗脱馏分中的乙醇，得到二次浓缩液；

[0105] 所述的大孔吸附树脂为HPD722、AB-8、HPD-100或H-103；

[0106] 3）将二次浓缩液加水充分搅拌使其溶解后，后加入有机溶剂萃取，分离有机相提取液并浓缩回收溶剂，得到三次浓缩液；

[0107] 所述的萃取的有机溶剂为氯仿或正丁醇；

[0108] 4）三次浓缩液进行固定相层析分离，固定相为C8或大孔硅胶，流动相为水和异丙醇、丙酮或四氢呋喃中的一种混合液（其中，水与异丙醇的体积比为80:20，水和丙酮的体积比为40:60，水和丙酮的体积比为70:30），三次浓缩液上样于固定相后经流动相洗脱，收集洗脱馏分（可参照相应标准物的峰值时间进行收集），常温干燥后得到粉状的具有促血管新生作用的中药提取物。

[0109] 机体新生血管功能低下或不足的现象可存在于心肌缺血、脑组织缺血、外周组织缺血、溃疡、闭塞性脉管炎、糖尿病并发症、伤口愈合缓慢、骨折愈合延迟等许多疾病发生发展的病理生理过程中，甚至有可能是导致或促使此类疾病发生的直接或间接原因。

[0110] 通过跟踪筛选研究发现，当归补血汤有效成分具有明显的促进血管新生作用。因此，通过局部或全身给药，所得提取物则有可被应用于一系列存在血管新生不足或低下状态的疾病治疗过程，也可通过调整机体或组织的血管新生及其功能状态，将其用于预防疾病或促进疾病康复的目的。

[0111] 具有促血管新生作用的中药提取物在制备促血管形成和/或新生药物中的应用；

[0112] 或者在制备改善血管新生不足或低下的药物的应用；

[0113] 或者在制备调整机体或组织的血管新生及状态的药物的应用。

[0114] 具体的，所述的促血管新生作用的药物为应用于包括但不仅限于心肌缺血、脑组织缺血、外周组织缺血、溃疡、闭塞性脉管炎、糖尿病并发症等疾病的预防和治疗，以及促进伤口愈合、改善骨折愈合延迟等治疗过程。

[0115] 而对于中药提取物的制剂，以所述中药提取物为药用成分，将其制备成固体、半固体或液体形式的制剂。

[0116] 具体的，所述的固体形式为片剂、散剂、颗粒剂、粉针剂或胶囊剂；半固体形式为乳剂、霜剂、软膏剂、糊剂；液体形式为以水或有机溶媒制成的注射剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂或喷雾剂，有机溶媒包括但不仅限于乙醇、丙二醇、植物油。