表面修饰的荧光磁性高分子复合微球的制备方法

摘要

一种表面修饰的荧光磁性高分子复合微球的制备方法，由制备葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液、制备混合表面活性剂、配制油相、制备乳化液、制备水相、制备磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶、制备Si02包覆的纳米级Fe3O4共聚磁性高分子复合微球、制备表面修饰的荧光磁性高分子复合微球步骤组成。所制备的表面修饰的荧光磁性高分子复合微球用荧光显微镜、扫描电子显微、荧光光谱仪、振动样品磁强计进行了测试，测试结果表明，该微球，荧光发光率高，磁响应好，性能稳定，具有无机材料的刚性和稳定性以及有机材料的柔韧性，可在免疫分析、药物载体、固定化酶、单个核苷酸多态性基因型、细胞因子鉴定以及单细胞分析等方面应用。

权利要求

1.一种表面修饰的荧光磁性高分子复合微球的制备方法，由下述步骤组成：

(1)制备葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液20℃，在三口烧瓶中加入二次蒸馏水，搅拌，在N2保护下，依次加入质量浓度为19.55％的FeCl3·6H2O水溶液、质量浓度为14.46％的FeCl2·4H2O水溶液、质量浓度为3.23％数均分子量为40000的葡聚糖水溶液，搅拌充分混合，加入质量浓度为3.92％的NaOH水溶液，葡聚糖与FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、NaOH、二次蒸馏水的质量比为1：2.93：1.45：2.2：254.45，用频率为20KHz的超声波处理8分钟，继续搅拌反应30分钟，升温至70℃、搅拌陈化30分钟，停止加热，自然冷却至室温，制备成葡聚糖修饰的Fe3O4，用稀土永久磁铁分离成葡聚糖修饰的Fe3O4和母液，弃去母液；在葡聚糖修饰的Fe3O4加入20～30倍质量的二次蒸馏水，超声分散、洗涤，重复洗涤至葡聚糖修饰的2

Fe3O4至中性，分散于二次蒸馏水中，用超声强度为0.27W/cm 的超声波处理至葡聚糖修饰的Fe3O4均匀分散于二次蒸馏水中，制备成质量浓度为0.6％的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液；

(2)制备混合表面活性剂

将吐温-80与司班-80按质量比为1:5混合，配制成混合表面活性剂；

(3)配制油相

将混合表面活性剂与正庚烷或环己烷按质量比为1：120～140混合，配制成油相；

(4)制备乳化液

将油相加入三口烧瓶内，搅拌，通入N2，18～30℃乳化30分钟，制备成乳化液；

(5)制备水相

将葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液用超声处理5分钟、静置8分钟，取质量浓度为

16.7％的N-异丙基丙烯酰胺水溶液、质量浓度为20％的丙烯酸钠水溶液、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸钾混合，搅拌混合均匀，再加入二次蒸馏水、质量浓度为0.6％的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺与N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸钠、过硫酸钾、二次蒸馏水、质量浓度为0.6％的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液的质量比为1：20：

4：1.6：176：30，制备成水相；

(6)制备磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶

28℃，将水相加入到乳化液中，搅拌，通入N2，再加入质量浓度为4.76％的四甲基乙二胺水溶液，四甲基乙二胺与乳化液、水相的质量比为1：1681：399，反应2～4小时，倾出反应液，将所得产物用丙酮和二次蒸馏水交替洗涤5～6次，制成磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶；

(7)制备Si02包覆的纳米级Fe3O4共聚磁性高分子复合微球

将磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶用质量浓度为13.5％的氨水溶液溶胀，用滤纸吸去多余的氨水，密封放置1小时，加入到乳化液中，搅拌，通入N2保护，缓慢滴加四乙氧基正硅烷，磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶与氨水、乳化液、四乙氧基正硅烷的质量之比为1：10.8：200：8.4，反应3小时，倾去有机溶剂，产物用二次蒸馏水和丙酮交替洗涤4～5次，自然晾干，制成Si02包覆的纳米级Fe3O4共聚磁性高分子复合微球；

(8)制备表面修饰的荧光磁性高分子复合微球

将Si02包覆的纳米级Fe3O4共聚磁性高分子复合微球用质量浓度为29％的

Al2(SO4)3·18H2O水溶液溶胀2～3小时，用滤纸吸去多余的溶液，加入到乳化液中，搅拌，通入N2，25℃滴加质量浓度为8％的八羟基喹啉乙醇溶液，Si02包覆的纳米级Fe3O4共聚磁性高分子复合微球与Al2(SO4)3·18H2O、乳化液、八羟基喹啉的质量比为1：0.87：340：2.08，反应2～3小时，反应完成后，倾去有机溶剂，用二次蒸馏水和丙酮交替洗涤4～5次，自然晾干，制成表面修饰的荧光磁性高分子复合微球。

说明书

表面修饰的荧光磁性高分子复合微球的制备方法

技术领域

[0001] 本发明跨越化学物理生物三大技术领域，具体涉及到胶体化学、荧光物质、磁性粒子等。例如：其他类不包括的微胶囊、胶体物料及其溶液的制备、微凝胶或荧光磁性多功能复合微球的制备。

背景技术

[0002] 功能性微球以其本身固有的比表面大、吸附积性强、凝集作用大和表面反应能力强等特性,以及人们根据不同的用途而赋予的各种性状如生物特异结合性、中空多孔性、磁性分离等而得到广泛的应用。

[0003] 荧光微球一般指微球的表面结合有荧光物质(包括表面包覆)或微球体内结构含有荧光物质(如包埋或聚合)的微球,受到外界能量刺激能激发出荧光。荧光微球以其稳定的形态结构及稳定而高效的发光效率,在许多领域尤其是生物医学领域有很重要的应用，它能对所标记的生物分子作定性或定量分析，不具备对欲作定性或定量分析的生物分子进行采集或分离的功能。

[0004] 磁性纳米粒子因其具有良好的超顺磁性和表面易功能化等特点而十分引人注意。当它与高分子复合成均匀的微球时，既保留了良好的超顺磁性，微球整体的磁性得到加强，易于分离，它可以耦联抗体、抗原或免疫球蛋白，在混合体系内与欲分离的目标物特异性结合，在外磁场的作用下达到富集和分离作用。

[0005] 荧光磁性多功能复合微球的制备将上述两者之优点完美的结合了起来，利用外磁场的作用和荧光物质的监测，使微观态的特异物质从混合体系内部直观的分离出来，使得标记和分离工作能一步完成，这将在生物医学工程领域工作中具有重要的意义，也必将极大地推动生物科学技术和纳微米级材料科学的发展。

[0006] 目前，据研究进展来看，磁性和发光材料复合制备纳米微米粒子主要有下面四种形式：一是通过不同的纳米晶体生长或组装来制备磁性荧光纳米粒子。Z.Rosenzweig等人通过巯基和金属离子的相互作用在磁性纳米粒子表面组装成单层量子点。这种方法简单实用，可以在其表面键合抗体，实现细胞靶向后磁场分离，但是缺点是复合纳米晶体的荧光强度下降，荧光量子点和磁性粒子的结合不够牢固，稳定性较差。二是磁性荧光复合材料的特点是两种材料都包覆在微球内部，可以使用物理方法组装和化学方法键合来实现。S.M.Nie等人通过疏水相互作用将两种亲油纳米粒子同时或是先后扩散到介孔二氧化硅内，并且表面用聚丙烯酸修饰。参杂过程效率高并且可以定量实现多颜色编码，但是高含量的氧化铁会影响纳米晶的发光效率。三是磁性荧光复合材料具有核壳结构。该类型的复合微球通过反相微乳液或是 方法首先制备磁性或是荧光二氧化硅微球，然后在微球表面静电组装或是化学键合制备荧光或是磁性壳层。S.M.Veronica等人制备核壳结构的二氧化硅磁性微球，再通过静电作用力将量子点吸附在二氧化硅的壳层上。为了防止量子点被腐蚀，同时提高微球的稳定性和修饰特殊官能团，在荧光壳层外包裹二氧化硅，使得微球的光学稳定性进一步提高，但微球的结构往往比较松散。四是磁性荧光复合微球主要基于微球表面的组装或是化学键合的方法得到两种纳米晶体复合的壳层。T.Hycon等人在二氧化硅表面修饰氨基，然后化学键合上表面带溴的Fe3O4纳米粒子，再加入亲油纳米晶体，通过配体交换使其吸附到二氧化硅表面，从而制备了壳层含两种纳米粒子的磁性荧光复合微球，但两种纳米粒子会相互干扰组装及特性的显示。

[0007] 目前国内的荧光微球制备技术刚刚起步，有关高性能的荧光磁性复合微球的制备技术报道较少，本发明成功的制备出了表面修饰的荧光磁性高分子复合微球。

[0008] 八羟基喹啉铝（Alq3）是一种较理想的有机电致发光材料，它具有良好的成膜性和热稳定性、较好的发光特性和电子传输特性，应用广泛，如有机发光二极管、有机固体激光器、大屏幕显示器等。

[0009] 聚丙烯酸(PAA)是一种典型的构象依赖于溶液pH的水溶性高分子。交联后的聚丙烯酸呈凝胶态，在水中可以溶胀。聚丙烯酸凝胶的溶胀行为与介质pH密切相关，在pH较低时（通常小于5.5），聚丙烯酸分子侧链上的羧基(-COOH)以质子化形式存在，分子链呈中性，侧链甲基的存在使得聚丙烯酸链处于收缩状态，随PH升高，羧基电离，聚丙烯酸分子链带负电，临近侧链羧酸根的相斥作用，使得聚丙烯酸分子链伸展，伴随聚丙烯酸凝胶的溶胀。

[0010] 聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)是一种典型的热敏性水溶性高分子聚合物，它的低临界温度(LCST)在32～35℃之间。一般来说在低于临界温度时，PNIPAM聚合物链为高度亲水和水溶胀状态；而当体系温度高于临界温度时则表现出较强的疏水性能，从而导致体积收缩，且这种相变行为对温度具有可逆性。由于这种特殊的热敏性能及良好的生物相容性,PNIPAM聚合物就在生物分子的分离、吸附/脱附、酶活性的控制和智能化的药物传输等方面得到研究和应用。

[0011] N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺与丙烯酸、甲基丙烯酸共聚形成球型共聚微凝胶，该共聚微凝胶微球保留了单体的温敏性、pH敏感性和溶胀性。

[0012] 在微球制备过程中，将葡聚糖修饰的磁性胶体粒子直接共聚进入微凝胶微球三维网络中，脱去共聚微凝胶微球中水份，得到带有磁响应特性的超顺磁性共聚均匀微凝胶，将荧光纳米粒子原位反应在微球的壳表层，用二氧化硅修饰固定表面，形成均表面修饰的荧光磁性高分子复合微球。

[0013] 二氧化硅具有良好的亲水性、生物兼容性、耐腐蚀性等，若将其包覆于磁性共聚微凝胶表面，可得到集多种功能于一身的磁性复合微球材料。磁性复合微球材料可在生物医学分离、药物在靶向区域控制释放、催化剂催化活性调控及回收再利用、生物技术下游产品温和快速富集和分离及污水处理等方面获得更加广泛的应用。

发明内容

[0014] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种设计合理、工艺可行、操作简便、反应时间短、在常温下反应的表面修饰的荧光磁性高分子复合微球的制备方法。

[0015] 解决上述技术问题所采用的技术方案是它包括下述步骤：

[0016] 1、制备葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液

[0017] 20℃，在三口烧瓶中加入二次蒸馏水，搅拌，在N2保护下，依次加入质量浓度为19.55%的FeCl3·6H2O水溶液、质量浓度为14.46%的FeCl2·4H2O水溶液、质量浓度为3.23%数均分子量为40000的葡聚糖水溶液，搅拌充分混合，加入质量浓度为3.92%的NaOH水溶液，葡聚糖与FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、NaOH、二次蒸馏水的质量比为1：2.93：1.45：2.2：
254.45，用频率为20KHz的超声波处理5～10分钟，继续搅拌反应30分钟，升温至60～
75℃，搅拌陈化20～40分钟，停止加热，自然冷却至室温，制备成葡聚糖修饰的Fe3O4，用稀土永久磁铁分离成葡聚糖修饰的Fe3O4和母液，弃去母液；在葡聚糖修饰的Fe3O4加入20～
30倍质量的二次蒸馏水，超声分散、洗涤，重复洗涤至葡聚糖修饰的Fe3O4至中性，分散于二
2
次蒸馏水中，用超声强度为0.27W/cm 的超声波处理至葡聚糖修饰的Fe3O4均匀分散于二次蒸馏水中，制备成质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液。

[0018] 2、制备混合表面活性剂

[0019] 将吐温-80与司班-80按质量比为1:5混合，配制成混合表面活性剂。

[0020] 3、配制油相

[0021] 将混合表面活性剂与正庚烷或环己烷按质量比为1:120～140混合，配制成油相。

[0022] 4、制备乳化液

[0023] 将油相加入三口烧瓶内，搅拌，通入N2，18～30℃乳化30分钟，制备成乳化液。

[0024] 5、制备水相

[0025] 将葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液用超声处理3～8分钟，静置5～10分钟，取质量浓度为16.7%的N-异丙基丙烯酰胺水溶液、质量浓度为20%的丙烯酸钠水溶液、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸钾混合，搅拌混合均匀，再加入二次蒸馏水、质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺与N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸钠、过硫酸钾、二次蒸馏水、质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液的质量比为1：20：4：1.6：176：10～60，制备成水相。

[0026] 6、制备磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶

[0027] 25～31℃，将水相加入到乳化液中，搅拌，通入N2，再加入质量浓度为4.76%的四甲基乙二胺水溶液，四甲基乙二胺与乳化液、水相的质量比为1：1050～2101：252～609，反应2～4小时，倾出反应液，将所得产物用丙酮和二次蒸馏水交替洗涤5～6次，制成磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶。

[0028] 7、制备Si02包覆的纳米级Fe3O4共聚磁性高分子复合微球

[0029] 将磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶用质量浓度为13.5%的氨水溶液溶胀，用滤纸吸去多余的氨水，密封放置1小时，加入到乳化液中，搅拌，通入N2保护，缓慢滴加四乙氧基正硅烷，磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶与氨水、乳化液、四乙氧基正硅烷的质量之比为1：5.4～16.2：200：3.75～13.1，反应3小时，倾去有机溶剂，产物用二次蒸馏水和丙酮交替洗涤4～5次，自然晾干，制成Si02包覆的纳米级Fe3O4共聚磁性高分子复合微球。

[0030] 8、制备表面修饰的荧光磁性高分子复合微球

[0031] 将Si02包覆的纳米级Fe3O4共聚磁性高分子复合微球用质量浓度为29%的Al2(SO4)3·18H2O水溶液溶胀2～3小时，用滤纸吸去多余的溶液，加入到乳化液中，搅拌，通入N2，25℃滴加质量浓度为8%的八羟基喹啉乙醇溶液，Si02包覆的纳米级Fe3O4共聚磁性高分子复合微球与Al2(SO4)3·18H2O、乳化液、八羟基喹啉的质量比为1：0.87：340：2.08，反应2～3小时，反应完成后，倾去有机溶剂，用二次蒸馏水和丙酮交替洗涤4～5次，自然晾干，制成表面修饰的荧光磁性高分子复合微球。

[0032] 在本发明的制备葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液步骤1中，20℃，在三口烧瓶中加入二次蒸馏水，搅拌在N2保护下，依次加入质量浓度为19.55%的FeCl3·6H2O水溶液、质量浓度为14.46%的FeCl2·4H2O水溶液、质量浓度为3.23%数均分子量为40000的葡聚糖水溶液，搅拌充分混合，加入质量浓度为3.92%的NaOH水溶液，葡聚糖与FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、NaOH、二次蒸馏水的质量比为1：2.93：1.45：2.2：254.45，用频率最佳为20KHz的超声波处理5分钟，继续搅拌反应30分钟，最佳升温至70℃、搅拌陈化30分钟，停止加热，自然冷却至室温，制备成葡聚糖修饰的Fe3O4，用稀土永久磁铁分离成葡聚糖修饰的Fe3O4和母液，弃去母液。在葡聚糖修饰的Fe3O4加入20～30倍质量的二次蒸馏水，超声分散、洗涤，重复洗涤至葡聚糖修饰的Fe3O4至中性，分散于二次蒸馏水中，用超声强度为2
0.27W/cm 的超声波处理至葡聚糖修饰的Fe3O4均匀分散于二次蒸馏水中，制备成质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液。

[0033] 在本发明的制备水相步骤5中，将葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液用超声最佳处理5分钟、静置8分钟，取质量浓度为16.7%的N-异丙基丙烯酰胺水溶液、质量浓度为20%的丙烯酸钠水溶液、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸钾混合，搅拌混合均匀，再加入二次蒸馏水、葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺与N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸钠、过硫酸钾、二次蒸馏水、质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液的最佳质量比为1：20：4：1.6：176：30，制备成水相。

[0034] 在本发明的制备磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶步骤6中，最佳28℃，将水相加入到乳化液中，搅拌，通入N2，再加入质量浓度为4.76%的四甲基乙二胺水溶液，四甲基乙二胺与乳化液、水相的最佳质量比为1：1681：399，反应2～4小时，倾出反应液，将所得产物用丙酮和二次蒸馏水交替洗涤5～6次，制成磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶。

[0035] 在本发明的制备Si02包覆的纳米级Fe3O4共聚磁性高分子复合微球步骤7中，将磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶用质量浓度为13.5%的氨水溶液溶胀，用滤纸吸去多余的氨水，密封放置1小时，加入到乳化液中，搅拌，通入N2保护，缓慢滴加四乙氧基正硅烷，磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶与氨水、乳化液、四乙氧基正硅烷的最佳质量之比为1：10.8：200：8.4，反应3小时，倾去有机溶剂，产物用二次蒸馏水和丙酮交替洗涤4～5次，自然晾干，制成Si02包覆的纳米级Fe3O4共聚磁性高分子复合微球。

[0036] 采用本发明实施例1制备的表面修饰的荧光磁性高分子复合微球用荧光显微镜、扫描电子显微、荧光光谱仪、振动样品磁强计进行了测试，测试结果表明，采用本发明方法制备的表面修饰的荧光磁性高分子复合微球，荧光发光率高，磁响应好，性能稳定，具有无机材料的刚性和稳定性以及有机材料的柔韧性，可在免疫分析、高通量药物筛选、药物载体、固定化酶、细菌和病毒诊断、单个核苷酸多态性基因型、细胞因子鉴定以及单细胞分析等方面应用。

附图说明

[0037] 图1是载磁量不同的表面修饰的荧光磁性高分子复合微球的磁滞回线图。

[0038] 图2是制备水相步骤5中质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液0.5g所制备的表面修饰的荧光磁性高分子复合微球的扫描电子显微镜照片。

[0039] 图3是制备水相步骤5中质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液1.5g所制备的表面修饰的荧光磁性高分子复合微球的扫描电子显微镜照片。

[0040] 图4是制备水相步骤5中质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液3g所制备的表面修饰的荧光磁性高分子复合微球的扫描电子显微镜照片。

[0041] 图5是表面修饰的荧光磁性高分子复合微球在蓝色光源激发下的荧光显微镜照片。

[0042] 图6是图5的局部放大照片。

[0043] 图7表面修饰的荧光磁性高分子复合微球在紫色光源激发下的荧光显微镜照片。

[0044] 图8是是图7的局部放大照片。

具体实施方式

[0045] 下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。

[0046] 实施例1

[0047] 本实施例表面修饰的荧光磁性高分子复合微球的制备方法步骤如下：

[0048] 1、制备葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液

[0049] 20℃，在三口烧瓶中加入150mL二次蒸馏水，搅拌在N2保护下，依次加入2.93gFeCl3·6H2O配制成质量浓度为19.55%的FeCl3·6H2O水溶液、1.45g FeCl2·4H2O配制成质量浓度为14.46%的FeCl2·4H2O水溶液、1g数均分子量为40000的葡聚糖配制成质量浓度为3.23%数均分子量为40000的葡聚糖水溶液，搅拌充分混合，加入2.20g NaOH配制成质量浓度为3.92%的NaOH水溶液，葡聚糖与FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、NaOH、二次蒸馏水的质量比为1：2.93：1.45：2.2：254.45，用频率为20KHz的超声波处理8分钟，继续搅拌反应30分钟，升温至70℃，搅拌陈化30分钟，停止加热，自然冷却至室温，制备成葡聚糖修饰的Fe3O4，用稀土永久磁铁分离成葡聚糖修饰的Fe3O4和母液，弃去母液；在葡聚糖修饰的Fe3O4加入20～30倍质量的二次蒸馏水，超声分散、洗涤，重复洗涤至葡聚糖修饰的Fe3O4至
2
中性，分散于二次蒸馏水中，用超声强度为0.27W/cm 的超声波处理至葡聚糖修饰的Fe3O4均匀分散于二次蒸馏水中，制备成质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液。

[0050] 2、制备混合表面活性剂

[0051] 将0.05g吐温-80与0.25g司班-80混合，吐温--80与司班--80质量比为1：5，配制成混合表面活性剂。

[0052] 3、配制油相

[0053] 将0.3g混合表面活性剂与39g正庚烷混合，混合表面活性剂与正庚烷的质量比为1：130，配制成油相。

[0054] 4、制备乳化液

[0055] 将油相加入三口烧瓶内，搅拌，通入N2，18～30℃乳化30分钟，制备成乳化液。

[0056] 5、制备水相

[0057] 将葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液用超声处理5分钟，静置8分钟，取1g N-异丙基丙烯酰胺配制成质量浓度为16.7%的N-异丙基丙烯酰胺水溶液，0.2g丙烯酸钠配制成质量浓度为20%的丙烯酸钠水溶液，加入0.05g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、0.08g过硫酸钾混合，搅拌混合均匀，再加入3g二次蒸馏水，1.5g质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺与N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸钠、过硫酸钾、二次蒸馏水、质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液的质量比为1：20：4：1.6：176：30，制备成水相。

[0058] 6、制备磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶

[0059] 28℃，将9.5g水相加入到40g乳化液中，搅拌，通入N2，再加入0.0238g四甲基乙二胺配制成质量浓度为4.76%的四甲基乙二胺水溶液，四甲基乙二胺与乳化液、水相的质量比为1：1681：399，反应2～4小时，倾出反应液，将所得产物用丙酮和二次蒸馏水交替洗涤5～6次，制成磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶。

[0060] 7、制备Si02包覆的纳米级Fe3O4共聚磁性高分子复合微球

[0061] 将0.2g磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶用2.16g氨水配制成质量浓度为13.5%的氨水溶液溶胀，用滤纸吸去多余的氨水，密封放置1小时，加入到40g乳化液中，搅拌，通入N2保护，缓慢滴加1.68g四乙氧基正硅烷，磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶与氨水、乳化液、四乙氧基正硅烷的质量之比为1：10.8：200：8.4，反应3小时，倾去有机溶剂，产物用二次蒸馏水和丙酮交替洗涤4～5次，自然晾干，制成Si02包覆的纳米级Fe3O4共聚磁性高分子复合微球。

[0062] 8、制备表面修饰的荧光磁性高分子复合微球

[0063] 将0.1g Si02 包 覆 的 纳 米 级Fe3O4 共 聚 磁 性 高 分 子 复 合 微 球 用0.087gAl2(SO4)3·18H2O配制成质量浓度为29%的水溶液溶胀2～3小时，用滤纸吸去多余的溶液，加入到乳化液中，搅拌，通入N2，25℃滴加0.208g八羟基喹啉配制成质量浓度为8%的乙醇溶液，Si02包覆的纳米级Fe3O4共聚磁性高分子复合微球与Al2(SO4)3·18H2O、乳化液、八羟基喹啉的质量比为1：0.87：340：2.08，反应2～3小时，反应完成后，倾去有机溶剂，用二次蒸馏水和丙酮交替洗涤4～5次，自然晾干，制成表面修饰的荧光磁性高分子复合微球。

[0064] 实施例2

[0065] 本实施例表面修饰的荧光磁性高分子复合微球的制备方法步骤如下：

[0066] 在制备葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液步骤1中，20℃，在三口烧瓶中加入150mL二次蒸馏水，搅拌在N2保护下，依次加入2.93g FeCl3·6H2O配制成质量浓度为19.55%的FeCl3·6H2O水溶液、1.45g FeCl2·4H2O配制成质量浓度为14.46%的FeCl2·4H2O水溶液、1g数均分子量为40000的葡聚糖配制成质量浓度为3.23%数均分子量为40000的葡聚糖水溶液，搅拌充分混合，加入2.20g NaOH配制成质量浓度为3.92%的NaOH水溶液，葡聚糖与FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、NaOH、二次蒸馏水的质量比为1：2.93：1.45：2.2：254.45，用频率为20KHz的超声波处理5分钟，继续搅拌反应30分钟，升温至60℃，搅拌陈化40分钟，停止加热，自然冷却至室温，制备成葡聚糖修饰的Fe3O4，用稀土永久磁铁分离成葡聚糖修饰的Fe3O4和母液，弃去母液；该步骤中的其他步骤与实施例1相同。

[0067] 在配置油相步骤3中，将0.3g混合表面活性剂与36g正庚烷混合，混合表面活性剂与正庚烷的质量比为1：120，配制成油相。

[0068] 在制备水相步骤5中，将葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液用超声处理3分钟，静置5分钟，取1g N-异丙基丙烯酰胺配制成质量浓度为16.7%的N-异丙基丙烯酰胺水溶液、0.2g丙烯酸钠配制成质量浓度为20%的丙烯酸钠水溶液、0.05g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、
0.08g过硫酸钾混合，搅拌混合均匀，再加入3g二次蒸馏水、0.5g质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液，N,N’亚甲基双丙烯酰胺与N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸钠、过硫酸钾、二次蒸馏水、质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液的质量比为1：
20：4：1.6：176：10，制备成水相。

[0069] 在制备磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶步骤6中，25℃，将6g水相加入到25g乳化液中，搅拌，通入N2，再加入0.0238g四甲基乙二胺配制成质量浓度为4.76%的四甲基乙二胺水溶液，四甲基乙二胺与乳化液、水相的质量比为1：1050：252，反应2～4小时，倾出反应液，将所得产物用丙酮和二次蒸馏水交替洗涤5～6次，制成磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶。

[0070] 在制备Si02包覆的纳米级Fe3O4共聚磁性高分子复合微球步骤7中，将0.2g磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶用1.08g的氨水配制成质量浓度为13.5%氨水溶液溶胀，用滤纸吸去多余的氨水，密封放置1小时，加入到40g乳化液中，搅拌，通入N2保护，缓慢滴加0.75g四乙氧基正硅烷，磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶与氨水、乳化液、四乙氧基正硅烷的质量之比为1：5.4：200：3.75，反应3小时，倾去有机溶剂，产物用二次蒸馏水和丙酮交替洗涤4～5次，自然晾干，制成Si02包覆的纳米级Fe3O4共聚磁性高分子复合微球。

[0071] 其他步骤与实施例1相同，制备成表面修饰的荧光磁性高分子复合微球。

[0072] 实施例3

[0073] 本实施例表面修饰的荧光磁性高分子复合微球的制备方法步骤如下：

[0074] 在制备葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液步骤1中，20℃，在三口烧瓶中加入150mL二次蒸馏水，搅拌在N2保护下，依次加入2.93g FeCl3·6H2O配制成质量浓度为19.55%的FeCl3·6H2O水溶液、1.45g FeCl2·4H2O配制成质量浓度为14.46%的FeCl2·4H2O水溶液、1g数均分子量为40000的葡聚糖配制成质量浓度为3.23%数均分子量为40000的葡聚糖水溶液，搅拌充分混合，加入2.20g NaOH配制成质量质量浓度为3.92%的NaOH水溶液，葡聚糖与FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、NaOH、二次蒸馏水的质量比为1：2.93：1.45：2.2：254.45，用频率为20KHz的超声波处理10分钟，继续搅拌反应30分钟，升温至75℃，搅拌陈化20分钟，停止加热，自然冷却至室温，制备成葡聚糖修饰的Fe3O4，用稀土永久磁铁分离成葡聚糖修饰的Fe3O4和母液，弃去母液；该步骤中的其他步骤与实施例1相同。

[0075] 在配置油相步骤3中，将0.3g混合表面活性剂与42g正庚烷混合，混合表面活性剂与正庚烷的质量比为1：140，配制成油相。

[0076] 在制备水相步骤5中，将葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液用超声处理8分钟，静置10分钟，取1g N--异丙基丙烯酰胺配制成质量浓度为16.7%的N-异丙基丙烯酰胺水溶液、0.2g丙烯酸钠配制成质量浓度为20%的丙烯酸钠水溶液、0.05g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、0.08g过硫酸钾混合，搅拌混合均匀，再加入3g二次蒸馏水、3g质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液，N,N’亚甲基双丙烯酰胺与N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸钠、过硫酸钾、二次蒸馏水、质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液的质量比为1：20：4：1.6：176：60，制备成水相。

[0077] 在制备磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶步骤6中，31℃，将14.5g水相加入到50g乳化液中，搅拌，通入N2，再加入0.0238g四甲基乙二胺配制成质量浓度为4.76%的四甲基乙二胺水溶液，四甲基乙二胺与乳化液、水相的质量比为1：2101：609，反应2～4小时，倾出反应液，将所得产物用丙酮和二次蒸馏水交替洗涤5～6次，制成磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶。

[0078] 在制备Si02包覆的纳米级Fe3O4共聚磁性高分子复合微球步骤7中，将0.2g磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶用3.24g氨水配制成质量浓度为13.5%的氨水溶液溶胀，用滤纸吸去多余的氨水，密封放置1小时，加入到40g乳化液中，搅拌，通入N2保护，缓慢滴加2.62g四乙氧基正硅烷，磁性纳米级Fe3O4共聚高分子复合微凝胶与氨水、乳化液、四乙氧基正硅烷的质量之比为1：16.2：200：13.1，反应3小时，倾去有机溶剂，产物用二次蒸馏水和丙酮交替洗涤4～5次，自然晾干，制成Si02包覆的纳米级Fe3O4共聚磁性高分子复合微球。

[0079] 其他步骤与实施例1相同，制备成表面修饰的荧光磁性高分子复合微球。

[0080] 实施例4

[0081] 本实施例表面修饰的荧光磁性高分子复合微球的制备方法步骤如下：

[0082] 在以上的实施例1～3的配制油相步骤3中，所用的正庚烷用等质量的环己烷替换，配制成油相。其他步骤与相应的实施例相同，制备成表面修饰的荧光磁性高分子复合微球。

[0083] 为了确定本发明的制备水相步骤5中所用原料的最佳配比，发明人进行了实验，各种试验情况如下：

[0084] 1、葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液的用量对表面修饰的荧光磁性高分子复合微球磁性的影响

[0085] 制备葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液步骤1、制备混合表面活性剂步骤2、配制油相步骤3、制备乳化液步骤4所用的原料及其质量配比和制备方法与实施例1相同。

[0086] 在制备水相步骤5中，将葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液用超声处理5分钟，静置8分钟，取1g N-异丙基丙烯酰胺配制成质量浓度为16.7%的N-异丙基丙烯酰胺水溶液、0.2g丙烯酸钠配制成质量浓度为20%的丙烯酸钠水溶液、0.05g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、
0.08g过硫酸钾混合，搅拌混合均匀，再加入3g二次蒸馏水。分别取质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液0.5g、1.0g、1.5g、3g，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺与N--异丙基丙烯酰胺、丙烯酸钠、过硫酸钾、二次蒸馏水、质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液的质量比分别为1：20：4：1.6：176：10，1：20：4：1.6：176：20，1：20：4：1.6：
176：30，1：20：4：1.6：176：60，制备成4种水相。其他步骤与实施例1相同。制备成四种表面修饰的荧光磁性高分子复合微球，用振动样品磁强计进行了测量，磁滞回线见图1，在图1中，曲线a、b、c、d线分别是质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液分别为3g、1.5g、1.0g、0.5g所制备的表面修饰的荧光磁性高分子复合微球的磁滞回线图。从中可以看出，质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液含量越多，随着磁场强度H（Gs）增加，磁感应强度M（emu/g）增加。

[0087] 2、质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4的用量对表面修饰的荧光磁性高分子复合微球形貌的影响

[0088] 制备葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液步骤1、制备混合表面活性剂步骤2、配制油相步骤3、制备乳化液步骤4所用的原料及其质量配比和制备方法与实施例1相同。在制备水相步骤5中，将葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液用超声处理5分钟，静置8分钟。取1g N-异丙基丙烯酰胺配制成质量浓度为16.7%的N-异丙基丙烯酰胺水溶液、0.2g丙烯酸钠配制成质量浓度为20%的丙烯酸钠水溶液、0.05g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、0.08g过硫酸钾混合，搅拌混合均匀，再加入3g二次蒸馏水。分别取质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液0.5g、1.5g、3g，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺与N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸钠、过硫酸钾、二次蒸馏水、质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液的质量比分别为1：20：4：1.6：176：10，1：20：4：1.6：176：30，1：20：4：1.6：176：60，制备成3种水相。其他步骤与实施例1相同。制备成三种表面修饰的荧光磁性高分子复合微球，用扫描电子显微镜进行了观察，扫描电子显微镜照片见图2～图4。由图2可见，N,N’亚甲基双丙烯酰胺与N--异丙基丙烯酰胺、丙烯酸钠、过硫酸钾、二次蒸馏水、质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液的质量比为1：20：4：1.6：176：10，制备成水相制备的表面修饰的荧光磁性高分子复合微球的表面形貌呈球形，形貌完整光滑，分散性好；由图3可见，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺与N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸钠、过硫酸钾、二次蒸馏水、质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液的质量比为1：20：4：1.6：176：30，制备成水相制备的表面修饰的荧光磁性高分子复合微球的表面形貌呈球形，球型完整，形貌稍显粗糙，比表面较大，分散性好；由图4可见，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺与N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸钠、过硫酸钾、二次蒸馏水、质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液的质量比为1：20：4：1.6：176：60，制备成水相制备的表面修饰的荧光磁性高分子复合微球的表面形貌呈球形，表面光洁圆滑、齐整，表明高含量磁性材料与荧光产物和高分子复合良好。

[0089] 本发明的制备水相步骤5中，选择N,N’-亚甲基双丙烯酰胺与N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸钠、过硫酸钾、二次蒸馏水、质量浓度为0.6%的葡聚糖修饰的纳米级Fe3O4分散液的质量比为1：20：4：1.6：176：10～60，制备成水相。

[0090] 为了验证本发明的有益效果，发明人采用本发明实施例1制备的表面修饰的荧光磁性高分子复合微球进行了检测实验，各种实验情况如下：

[0091] 用显微镜对表面修饰的荧光磁性高分子复合微球在蓝色光源激发下进行了观测，荧光显微镜照片见图5，图6是图5的局部放大照片，由图5、图6可以见，浅绿色荧光发光均匀，发光效率高。

[0092] 用显微镜对表面修饰的荧光磁性高分子复合微球在紫色光源激发下进行了观测，荧光显微镜照片见图7，图8是图7的局部放大照片，由图7、图8可见，浅蓝色荧光发光均匀，发光效率高。