融合串联抗菌肽及其制备方法

摘要

融合串联抗菌肽及其制备方法，它涉及抗菌肽及其制备方法。本发明解决了现有抗菌肽合成方法中产量低，生产成本高；特别是采用基因工程重组表达抗菌肽过程中抗菌肽分子容易被酶解，导致表达量低或者很难表达的问题。融合串联抗菌肽由Fowlicidin-2、天蚕素B、Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)和死亡素四种抗菌肽串联而成。制备方法：一、设计cDNA片段；二、构建重组表达载体；三、获得转化子；四、诱导，收集上清液，蛋白纯化。本发明用于抗菌肽制备领域。

权利要求

1.融合串联抗菌肽，其特征在于融合串联抗菌肽由Fowlicidin-2、天蚕素B、Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)和死亡素四种抗菌肽串联而成，Fowlicidin-2、天蚕素B、Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)与死亡素之间用GlySerGly联接；联接第一个和第二个原始小分子抗菌肽的GlySerGly的碱基序列为GGTTCTGGC；联接第二个和第三个原始小分子抗菌肽的GlySerGly的碱基序列为GGCTCCGGT；联接第三个和第四个原始小分子抗菌肽的GlySerGly的碱基序列为GGTTCTGGT；根据毕赤酵母密码子偏爱性设计Fowlicidin-2、天蚕素B、CecropinA(1-8)-Melittin(1-18)和死亡素的基因序列；

其中，根据毕赤酵母密码子偏爱性设计的Fowlicidin-2的基因序列为CTAGTTCAAAGGGGACGTTTTGGAAGATTTCTGAGAAAGATCCGAAGATTCAGACCAAAGGTTACAATCACTATTCAAGGTAGTGCTCGATTC；根据毕赤酵母密码子偏爱性设计的天蚕素B的基因序列为AAATGGAAAGTTTTTAAGAAGATTGAGAAAATGGGCAGGAACATTCGTAACGGAATCGTGAAGGCTGGGCCCGCAATTGCTGTGCTGGGTGAAGCTAAAGCCATATTATCA；根据毕赤酵母密码子偏爱性设计的Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)的基因序列为AAATGGAAAGTTTTTAAGAAGATTGAGAAAATGGGCAGGAACATTCGTAACGGAATCGTGAAGGCTGGGCCCGCAATTGCTGTGCTGGGTGAAGCTAAAGCCATATTATCA；根据毕赤酵母密码子偏爱性设计的死亡素的基因序列为GGTTCTAAGAAACCAGTCCCCATCATATACTGCAATAGAAGAACGGGTAAGTGTCAGAGAATG。

2.根据权利要求1所述的融合串联抗菌肽的制备方法，其特征在于融合串联抗菌肽按以下步骤制备：

一、融合串联抗菌肽由四种原始小分子抗菌肽串联而成，四种原始小分子抗菌肽之间用GlySerGly联接，再根据毕赤酵母密码子偏爱性设计融合串联抗菌肽的cDNA片段；然后在融合串联抗菌肽cDNA片段5’端加入Kex2裂解位点的三个密码子，在融合串联抗菌肽cDNA片段3’端加入终止密码子TAA，再在5’和3’端分别引入Xho I和Xbal I粘性末端，连接pUC59，构建了克隆质粒pUC57-TM；

二、用Xho I和Xbal I双酶切pUC57-TM，获得融合串联抗菌肽的编码基因片段，与pPICZαC连接，转化大肠杆菌DH 5α，PCR和测序进一步鉴定，构建重组表达载体pPICZαC-TM；

三、将重组表达载体pPICZαC-TM经Sac I线性化后，电转入毕赤酵母SMD1168中，用

100μg/mL浓度的博莱霉素Zeocin和PCR法筛选获得高拷贝的重组酵母转化子；

四、将重组酵母转化子的单菌落接种于酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中，在30℃、280r/min的条件下培养16～17h，然后取培养液转接到BMGY培养基中，在30℃、300r/min条件下培养到OD值为2～6，收集菌体转接于BMMY培养基中，在30℃、300r/min、1％甲醇的条件下诱导72h，在诱导过程中每隔24h补加甲醇保持终浓度为0.5％～1％；诱导后离心收集上清液，蛋白纯化系统纯化获得融合串联抗菌肽；

步 骤 一 中 四 种 原 始 小 分 子 抗 菌 肽 为Fowlicidin-2、天 蚕 素B、CecropinA(1-8)-Melittin(1-18)和死亡素；

步骤一中联接第一个和第二个原始小分子抗菌肽的GlySerGly的碱基序列为GGTTCTGGC；联接第二个和第三个原始小分子抗菌肽的GlySerGly的碱基序列为GGCTCCGGT；联接第三个和第四个原始小分子抗菌肽的GlySerGly的碱基序列为GGTTCTGGT。

3.根据权利要求2所述的融合串联抗菌肽的制备方法，其特征在于步骤一中Kex2裂解位点的三个密码子所编码的氨基酸序列为GluLysArg，三个密码子的碱基序列为GAGAAGAGA。

4.根据权利要求3所述的融合串联抗菌肽的制备方法，其特征在于步骤一中根据毕赤酵母密码子偏爱性设计Fowlicidin-2的基因序列为CTAGTTCAAAGGGGACGTTTTGGAAGATTTCTGAGAAAGATCCGAAGATTCAGACCAAAGGTTACAATCACTATTCAAGGTAGTGCTCGATTC；根据毕赤酵母密码子偏爱性设计天蚕素B的基因序列为AAATGGAAAGTTTTTAAGAAGATTGAGAAAATGGGCAGGAACATTCGTAACGGAATCGTGAAGGCTGGGCCCGCAATTGCTGTGCTGGGTGAAGCTAAAGCCATATTATCA；根据毕赤酵母密码子偏爱性设计Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)的基因序列为AAATGGAAAGTTTTTAAGAAGATTGAGAAAATGGGCAGGAACATTCGTAACGGAATCGTGAAGGCTGGGCCCGCAATTGCTGTGCTGGGTGAAGCTAAAGCCATATTATCA；根据毕赤酵母密码子偏爱性设计死亡素的基因序列为GGTTCTAAGAAACCAGTCCCCATCATATACTGCAATAGAAGAACGGGTAAGTGTCAGAGAATG。

5.根据权利要求2、3或4所述的融合串联抗菌肽的制备方法，其特征在于步骤一中5’端引入Xho I粘性末端序列为CTCGAG，3’端引入Xbal I粘性末端序列为TCTAGA。

说明书

融合串联抗菌肽及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及抗菌肽及其制备方法。

背景技术

[0002] 抗菌肽是生物体在免疫病原体刺激下，免疫防御系统产生的一类具有生物学活性的小分子多肽，是动植物非特异免疫系统的重要成分，广泛分布于细菌、真菌、高等植物、昆虫、两栖类、哺乳动物以及人类体内。抗菌肽具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等作用。和抗生素相比，抗菌肽具有分子质量小、抗菌谱广、水溶性好、耐热性强、无免疫原性和作用机制独特等优点，不易引起微生物的耐药性，被认为是一种极具应用潜力的健康安全的抗菌物。

[0003] Fowlicidin-2是在鸡体内发现的一种新型阳离子抗菌肽，由31个氨基酸残基组成，具有广谱的抗菌活性，具有脂多糖(LPS)结合活性及免疫调节功能。与多数抗菌肽不同的是Fowlicidin-2具有很强的盐离子耐受性，抗菌活性不受生理盐浓度的影响，甚至在NaCl浓度为150mmol/L时，仍然保持着抗菌活性，对抗性菌株仍然有很强的抑制作用，这意味着Fowlicidin-2在抗感染治疗应用上有着很大的潜力。

[0004] 天蚕素B(CecropinR)是由Boman从天蚕体内分离得到的杀菌活性多肽，由37个氨基酸残基组成，其N端碱性很强，形成双亲α-螺旋结构，具有广谱的抗菌作用，具有较好的热稳定性，能选择性地杀伤肿瘤细胞，对正常的哺乳动物细胞和昆虫细胞无不良影响。

[0005] CecropinA(1-8)-Melittin(1-18)是由天蚕素A的1-8位氨基酸残基和蜂毒素的1-18位氨基酸残基组成的杂合分子，氨基端为天蚕素部分，羧基端为蜂毒素部分，此杂合分子具有较2个单独亲本更广的抗菌谱，同时去除了蜂毒素的溶血作用，拓宽了的抗菌谱。除抗菌能力外，还具有杀伤癌变细胞和包被的病毒、促进伤口愈合等功能。

[0006] 死亡素(Thanatin)，又称死亡肽，是在昆虫斑腹刺益蝽(Podisus maculiventris)中发现的，是近来发现的抗菌谱最广的抗菌肽之一。由21个氨基酸残基组成，结构简单，对+ -G、G 和某些真菌都有抑制作用，但是对酵母影响不大，对哺乳动物细胞也不表现出溶血性。

[0007] 抗菌肽的制备主要有生物材料提取法、化学合成法和基因工程表达法三种。由于抗菌肽在生物组织中含量低、分离困难，除少数几种昆虫抗菌肽外，提取法制得的样品难以满足应用需要，仅适用于氨基酸序列分析和初步的抗菌试验。化学合成法分为液相合成法、固相合成法、片段合成法等等，都需要用到大量的化学制剂，存在成本高、工艺繁琐的缺陷。采用基因工程的方法重组表达抗菌肽是目前比较理想的抗菌肽生产手段，但是由于抗菌肽分子量太小，在表达过程中的翻译和转录时容易酶解，出现表达量低或者很难表达的问题。
而且与传统抗生素相比，抗菌肽的抗菌活性尚待进一步提高。

发明内容

[0008] 本发明要解决现有抗菌肽合成方法中产量低，生产成本高；特别是采用基因工程重组表达抗菌肽过程中抗菌肽分子容易被酶解，导致表达量低或者很难表达的问题，而提出的融合串联抗菌肽及其制备方法。

[0009] 融合串联抗菌肽由Fowlicidin-2、天蚕素B、CecropinA(1-8)-Melittin(1-18)和死亡素四种抗菌肽串联而成，Fowlicidin-2、天蚕素B、Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)与死亡素之间用GlySerGly联接。

[0010] 本发明融合串联抗菌肽由124个氨基酸组成，根据Fowlicidin-2、天蚕素B、CecropinA(1-8)-Melittin(1-18)与死亡素联接顺序的不同共有24种组合。

[0011] 融合串联抗菌肽按以下步骤制备：

[0012] 一、融合串联抗菌肽由四种原始小分子抗菌肽串联而成，四种原始小分子抗菌肽之间用GlySerGly联接，再根据毕赤酵母密码子偏爱性设计融合串联抗菌肽的cDNA片段；然后在融合串联抗菌肽cDNA片段5’端加入Kex2裂解位点的三个密码子，在融合串联抗菌肽cDNA片段3’端加入终止密码子TAA，再在5’和3’端分别引入Xho I和Xbal I粘性末端，连接pUC59，构建了克隆质粒pUC57-TM；

[0013] 二、用Xho I和Xbal I双酶切pUC57-TM，获得融合串联抗菌肽的编码基因片段，与pPICZαC连接，转化大肠杆菌DH 5α，PCR和测序进一步鉴定，构建重组表达载体pPICZαC-TM；

[0014] 三、将重组表达载体pPICZαC-TM经Sac I线性化后，电转入毕赤酵母SMD1168中，用100μg/mL浓度的Zeocin(博莱霉素)和PCR法筛选获得高拷贝的重组酵母转化子；

[0015] 四、将重组酵母转化子的单菌落接种于酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)中，在30℃、280r/min的条件下培养16～17h，然后取培养液转接到BMGY培养基中，在30℃、
300r/min条件下培养到OD值为2～6，收集菌体转接于BMMY培养基中，在30℃、300r/min、
1％甲醇的条件下诱导72h，在诱导过程中每隔24h补加甲醇保持终浓度为0.5％～1％；诱导后离心收集上清液，蛋白纯化系统纯化获得融合串联抗菌肽；

[0016] 步骤一中四种原始小分子抗菌肽为Fowlicidin-2、天蚕素B、Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)和死亡素。

[0017] 本发明采用毕赤酵母作为表达外源蛋白的宿主菌，毕赤酵母具有营养要求低，易于培养的优点。毕赤酵母存在酵母氧化酶AOX1，为外源基因启动子，受甲醇诱导，严格调控外源蛋白的表达。在表达过程中毕赤酵母自身分泌到培养基中的蛋白较少，简化了后期蛋白的分离与纯化。本发明利用酵母表达系统成功实现了融合串联抗菌肽的重组制备。

[0018] 本发明步骤一中Kex2裂解位点的三个密码子所编码的氨基酸序列为GluLysArg，三个密码子的碱基序列为GAGAAGAGA。

[0019] 本发明步骤一中根据毕赤酵母密码子偏爱性设计Fowlicidin-2的基因序列为 CTAGTTCAAAGGGGACGTTTTGGAAGATTTCTGAGAAAGATCCGAAGATTCAGACCAAAGGTTACAATCACTATTCAAGGTAGTGCTCGATTC根据毕赤酵母密码子偏爱性设计天蚕素B的基因序列为AAATGGAAAGITITTAAGAAGATTGAGAAAATGGGCAGGAACATTCGTAACGGAATCGTGAAGGCTGGGCCCGCAATTGCTGTGCTGGGTGAAGCTAAAGCCAIATTATCA；根据毕赤酵母密码子偏爱性设计Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)的基因序列为AAATGGAAAGTTTTTAAGAAGATTGAGAAAATGGGCAGGAACATTCGTAACGGAATCGTGAAGGCTGGGCCCGCAATTGCTGTGCTGGGTGAAGCTAAAGCCATATTATCA；根据毕赤酵母密码子偏爱性设计死亡素的基因序列为GGTTCTAAGAAACCAGTCCCCATCATATACTGCAATAGAAGAACGGGTAAGTGTCAGAGAATG。

[0020] 本发明步骤一中联接第一个和第二个原始小分子抗菌肽的GlySerGly的碱基序列为GGTTCTGGC；联接第二个和第三个原始小分子抗菌肽的GlySerGly的碱基序列为GGCTCCGGT；联接第三个和第四个原始小分子抗菌肽的GlySerGly的碱基序列为GGTTCTGGT。

[0021] 本发明步骤一中5’端引入Xho I粘性末端序列为CTCGAG，3’端引入Xbal I粘性末端序列为TCTAGA。

[0022] 对本发明获得的融合串联抗菌肽进行抑菌活性测定，24种不同联接顺序的融合串联抗菌肽均对大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、鼠伤寒沙门氏菌C77-31和绿脓杆菌ATCC27853均有抑菌活性。

[0023] 本发明不是单一小分子抗菌肽重复性的串联；不是将两个不同的小分子抗菌肽基因导入同一质粒和宿主中，分别进行启动表达；而是串联形成大分子抗菌肽。本发明融合串联抗菌肽分子量为14kDa，不易被酶解，因此具有产量高(平均每升培养基获得融合串联抗菌肽约230mg)，表达量高的优点。经过串联所形成的本发明融合串联抗菌肽其抗菌抑菌的效果得到了显著地提升，与四种原始小分子抗菌肽相比抑菌活性均有提高，且无溶血活性与动物毒性。

[0024] 本发明采用基因工程和微生物发酵技术制备，具有成本低，生产投入低的特点。

[0025] 本发明利用基因工程手段进行偏爱性设计，可以有效地提高融合串联抗菌肽的表达量，而且联接氨基酸也采用具有柔性的氨基酸，可以有效地区分和激发各原始小分子抗菌肽的抗菌活性。

附图说明

[0026] 图1是具体实施方式四步骤二中引物F1与F2筛选重组质粒pPICZαC-TM的凝胶电泳图，图1中“1”泳道标样为DNA分子量标准，“2”泳道标样为以含有重组质粒pPICZαC-TM菌落为模板的PCR扩增产物，“3”泳道标样为含有重组质粒pPICZαC-TM菌落为模板的PCR扩增产物，“4”泳道标样为含有pPICZαC菌落为模板的PCR扩增产物。图2是具体实施方式四步骤三中PCR方法筛选酵母转化子pPICZαC-TM的凝胶电泳图，图2中“1”泳道标样为含有重组质粒pPICZαC-TM菌落为模板的PCR扩增产物，“2”泳道标样为含有重组质粒pPICZαC-TM菌落为模板的PCR扩增产物，“3”泳道标样为DNA分子量标准，“4”泳道标样为含有pPICZαC菌落为模板的PCR扩增产物，“5”泳道标样为含有pPICZαC菌落为模板的PCR扩增产物。图3是具体实施方式四步骤四中pPICZα-TM转化子表达产物的Trincine-SDS-PAGE分析图，图3中“1”泳道标样为蛋白质分子量标准，“2”泳道标样为阴性对照，“3”泳道标样为融合串联抗菌肽蛋白，“4”泳道标样为融合串联抗菌肽蛋白，“5”泳道标样为融合串联抗菌肽蛋白。图4是具体实施方式五步骤二中引物F1与F2筛选重组质粒pPICZαC-TM的凝胶电泳图，图4中“1”泳道标样为DNA分子量标准，“2”泳道标样为以含有重组质粒pPICZαC-TM菌落为模板的PCR扩增产物，“3”泳道标样为含有重组质粒pPICZαC-TM菌落为模板的PCR扩增产物，“4”，泳道标样为含有pPICZαC菌落为模板的PCR扩增产物。图5是具体实施方式五步骤三中PCR方法筛选酵母转化子pPICZαC-TM的凝胶电泳图，图5中“1”泳道标样为含有重组质粒pPICZαC-TM菌落为模板的PCR扩增产物，“2”泳道标样为含有重组质粒pPICZαC-TM菌落为模板的PCR扩增产物，“3”泳道标样为DNA分子量标准，“4”泳道标样为含有pPICZαC菌落为模板的PCR扩增产物，“5”泳道标样为含有pPICZαC菌落为模板的PCR扩增产物。图6是具体实施方式五步骤四中pPICZα-TM转化子表达产物的Trincine-SDS-PAGE分析图，图6中“1”泳道标样为蛋白质分子量标准，“2”泳道标样为阴性对照，“3”泳道标样为融合串联抗菌肽蛋白，“4”泳道标样为融合串联抗菌肽蛋白，“5”泳道标样为融合串联抗菌肽蛋白。

具体实施方式

[0027] 具体实施方式一：本实施方式融合串联抗菌肽由Fowlicidin-2、天蚕素B、CecropinA(1-8)-Melittin(1-18)和死亡素四种抗菌肽串联而成，Fowlicidin-2、天蚕素B、CecropinA(1-8)-Melittin(1-18)与死亡素之间用GlySerGly联接。

[0028] 具体实施方式二：本实施方式融合串联抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

[0029] 具体实施方式三：本实施方式融合串联抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

[0030] 具体实施方式四：本实施方式融合串联抗菌肽按以下步骤制备：

[0031] 一、融合串联抗菌肽由四种原始小分子抗菌肽串联而成，四种原始小分子抗菌肽之间用GlySerGly联接，再根据毕赤酵母密码子偏爱性设计融合串联抗菌肽的cDNA片段；然后在融合串联抗菌肽cDNA片段5’端加入Kex2裂解位点的三个密码子，在融合串联抗菌肽cDNA片段3’端加入终止密码子TAA，再在5’和3’端分别引入Xho I和Xbal I粘性末端，连接pUC59，构建了克隆质粒pUC57-TM；

[0032] 二、用Xho I和Xbal I双酶切pUC57-TM，获得融合串联抗菌肽的编码基因片段，与pPICZαC连接，转化大肠杆菌DH 5α，PCR和测序进一步鉴定，构建重组表达载体pPICZαC-TM；

[0033] 三、将重组表达载体pPICZαC-TM经Sac I线性化后，电转入毕赤酵母SMD1168中，用100μg/mL浓度的Zeocin(博莱霉素)和PCR法筛选获得高拷贝的重组酵母转化子；

[0034] 四、将重组酵母转化子的单菌落接种于5ml酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)中，在30℃、280r/min的条件下培养16～17h，然后取50μl培养液转接到25ml的BMGY培养基中，在30℃、300r/min条件下培养到OD值为2～6，收集菌体转接于50ml的BMMY培养基中，在30℃、300r/min、1％甲醇的条件下诱导72h，在诱导过程中每隔24h补加甲醇保持终浓度为0.5％～1％；诱导后离心收集上清液，蛋白纯化系统纯化获得融合串联抗菌肽；

[0035] 步骤一中四种原始小分子抗菌肽为Fowlicidin-2、天蚕素B、Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18) 和 死 亡 素， 联 接 顺 序 为 Fowlicidin-2、Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)、天蚕素B和死亡素。

[0036] 本实施方式步骤一中Kex2裂解位点的三个密码子所编码的氨基酸序列为GluLysArg，三个密码子的碱基序列为GAGAAGAGA。

[0037] 本实施方式步骤一中根据毕赤酵母密码子偏爱性设计Fowlicidin-2的基因序列 为 CTAGTTCAAAGGGGACGTTTGGAAGATTTCTGAGAAAGATCCGAAGATTCAGACCAAAGGTTACAATCACTATTCAAGGTAGTGCTCGATTC；根据毕赤酵母密码子偏爱性设计天蚕素B的基因序列为AAATGGAAAGTTTTTAAGAAGATTGAGAAAATGGGCAGGAACATTCGTAACGGAATCGTGAAGGCTGGGCCCGCAATTGCTGTGCTGGGTGAAGCTAAAGCCATATIATCA；根据毕赤酵母密码子偏爱性设计Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)的基因序列为AAATGGAAAGTTTTTAAGAAGATTGAGAAAATGGGCAGGAACATTCGTAACGGAATCGTGAAGGCTGGGCCCGCAATTGCTGTGCTGGGTGAAGCTAAAGCCATATTATCA；根据毕赤酵母密码子偏爱性设计死亡素的基因序列为GGTTCTAAGAAACCAGTCCCCATCATATACTGCAATAGAAGAACGGGTAAGTGTCAGAGAATG。

[0038] 本实施方式步骤一中联接第一个和第二个原始小分子抗菌肽的GlySerGly的碱基序列为GGTTCTGGC；联接第二个和第三个原始小分子抗菌肽的GlySerGly的碱基序列为GGCTCCGGT；联接第三个和第四个原始小分子抗菌肽的GlySerGly的碱基序列为GGTTCTGGT。

[0039] 本实施方式步骤一中5’端引入Xho I粘性末端序列为CTCGAG，3’端引入Xbal I粘性末端序列为TCTAGA。

[0040] 本 实 施 方 式 步 骤 二 中 PCR 筛 选 阳 性 克 隆，所 用 引 物 F1：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’；F2：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’，PCR反应条件为：
94C、5min；95℃、30s，58℃、30s，72℃1min，32个循环后72℃延伸5min，引物F1与F2分别与pPICZαC的第855～875和1423～1443间的碱基互补，以引物F1与F2筛选重组质粒，经2％琼脂糖凝胶电泳，如图1所示。含有质粒pPICZαC的菌落为模板的PCR产物DNA条带为588bp，而阳性重组质粒的PCR扩增产物DNA条带为882bp。经Xhol I、Xba I双酶切鉴定、测序验证后，阳性重组质粒碱基序列与设计完全一致，说明成功构建了重组质粒pPICZαC-TM。

[0041] 本实施方式步骤三限制性内切酶Sac I酶切线性化pPICZαC-TM(5～10μg)，电转化毕赤酵母SMD1168，转化条件：3000V、25μF、200Ω电击5ms，30℃温育复性1～1.5h后涂MD平板，30℃培养至出现单菌落。PCR方法鉴定重转化子，用冻-煮-冻法制备PCR模板，所用引物为F1与F2，反应条件：94℃、5min；94℃、1min，59℃、1min，72℃、1min，30个循环；72℃5min。

[0042] PCR筛选结果如图2所示，阳性对照，即以含有质粒pPICZαC的酵母菌落为模板的PCR产物为588bp的DNA条带，而阳性重组质粒，即以含有重组质粒pPICZαC-TM的酵母菌落为模板扩增产物为882bp的DNA条带，说明目的基因已成功转入毕赤酵母SMD1168中。

[0043] 本实施方式步骤四诱导后离心收集上清，取样Tricine-SDS-PAGE分析，如图3所示，重组表达质粒pPICZαC-TM转化子产生了一条约为14kDa的特异的蛋白带，与预期融合串联抗菌肽蛋白的大小一致。获得的上清液利用AKTA explorer蛋白纯化仪凝胶过滤层析纯化蛋白，流动相为磷酸盐缓冲液(0.5mol/L Na2HPO4，0.15mol/L NaCl，pH7.0)，收集目的峰。然后进行脱盐，以去离子水为流动相，分离除去盐峰，利用Bradford方法测定蛋白质含量，计算融合串联抗菌肽的产率，平均每升培养基能获得融合串联抗菌肽232.7mg，真空冷冻干燥后获得重组抗菌肽干粉。

[0044] 本实施方式步骤一中用于制备融合串联抗菌肽的人工合成碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

[0045] 本实施方式融合串联抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

[0046] 本实施方式融合串联抗菌肽抑菌试验：

[0047] 融合串联抗菌肽最小抑菌浓度(MIC)测定

[0048] 以对数生长中期的大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、鼠伤寒沙门氏菌C77-31和绿脓杆菌ATCC27853为指示菌，测定本实施方式融合串联抗菌肽的抑菌活性。称取纯化冻干后的本实施方式融合串联抗菌肽，以及化学合成的四种原始小分子抗菌肽Fowlicidin-2、天蚕素B、Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)与死亡素，用PBS溶解后，稀释得到以下不同浓度的肽溶液：2560μg/ml、1280μg/ml、640μg/ml、320μg/ml、160μg/ml、80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml和5μg/ml。利用微量肉汤稀释法测定MIC，5 5
将测试菌过夜培养物释至2×10 ～7×10CFU/ml，分别取100μl加到96孔细胞培养板每行的1至10号孔，11号孔加入100μl的新鲜MHB培养基作为对照，再将按梯度稀释的抗菌肽11μl对应加到1至10号孔。37℃培养18至24h后，用酶标仪测490nm吸光值。吸光度比10号孔低50％以上的孔内的浓度即定义为对该测试菌的最小抑菌浓度MIC。由表
1可见，本实施方式融合串联抗菌肽对四种测试菌均具有明显的抑制作用，与四种原始小分子抗菌肽相比，除本实施方式融合串联抗菌肽与Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)对四种细菌的抗菌活性没有差异外，较其他三种原始小分子抗菌肽抗菌活性都有一定程度的提高，与Fowlicidin-2相比，对金黄色葡萄球菌的活性有所提高，与天蚕素B相比，对金黄色葡萄球菌的活性显著提高，对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌也有提高。与死亡素相比，对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的活性显著提高。

[0049] 表1本实施方式融合串联抗菌肽对四种测试菌的MIC

[0050]

[0051] 本实施方式融合串联抗菌肽的体外溶血活性检测，检测用血液样品取自正常人血液，检测步骤如下：

[0052] 新鲜血液1mL，3000r/min离心5min收集红细胞，PBS洗涤3遍，再用10mL PBS重悬制成8％(V/V)血细胞悬浮液，取100μL红细胞悬浮液与100μL用PBS溶解的不同浓度的本实施方式融合串联抗菌肽溶液混合，37℃孵育1h。3000r/min离心5min，取上清液，加入到96孔板中，酶标仪测定540nm吸光值，重复三次，取平均值，PBS作为阴性对照，0.1％的Triton-100做阳性对照。检测结果为，在256μg/ml浓度下未表现出溶血活性。

[0053] 本实施方式融合串联抗菌肽的动物体内急性毒性试验：

[0054] 采用昆明白小鼠60只，雌雄各半，体重26±0.40g，按照1mg/kg剂量肌肉注射本实施方式融合串联抗菌肽，每日一次，连续7天，观察小鼠毒性反应，结果表明，肌注本实施方式融合串联抗菌肽7天后，小鼠无异常反应，活动正常，60只小鼠全部存活，证明本实施方式融合串联抗菌肽无毒副作用。

[0055] 具体实施方式五：本实施方式融合串联抗菌肽按以下步骤制备：

[0056] 一、融合串联抗菌肽由四种原始小分子抗菌肽串联而成，四种原始小分子抗菌肽之间用GlySerGly联接，再根据毕赤酵母密码子偏爱性设计融合串联抗菌肽的cDNA片段；然后在融合串联抗菌肽cDNA片段5’端加入Kex2裂解位点的三个密码子，在融合串联抗菌肽cDNA片段3’端加入终止密码子TAA，再在5’和3’端分别引入Xho I和Xbal I粘性末端，连接pUC59，构建了克隆质粒pUC57-TM；

[0057] 二、用Xho I和Xbal I双酶切pUC57-TM，获得融合串联抗菌肽的编码基因片段，与pPICZαC连接，转化大肠杆菌DH 5α，PCR和测序进一步鉴定，构建重组表达载体pPICZαC-TM；

[0058] 三、将重组表达载体pPICZαC-TM经Sac I线性化后，电转入毕赤酵母SMD1168中，用100μg/mL浓度的Zeocin(博莱霉素)和PCR法筛选获得高拷贝的重组酵母转化子；

[0059] 四、将重组酵母转化子的单菌落接种于5ml酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)中，在30℃、280r/min的条件下培养16～17h，然后取50μl培养液转接到25ml的BMGY培养基中，在30℃、300r/min条件下培养到OD值为2～6，收集菌体转接于50ml的BMMY培养基中，在30℃、300r/min、1％甲醇的条件下诱导72h，在诱导过程中每隔24h补加甲醇保持终浓度为0.5％～1％；诱导后离心收集上清液，蛋白纯化系统纯化获得融合串联抗菌肽；

[0060] 步骤一中四种原始小分子抗菌肽为Fowlicidin-2、天蚕素B、Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)和死亡素，联接顺序为Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)、Fowlicidin-2、死亡素和天蚕素B。

[0061] 本实施方式步骤一中Kex2裂解位点的三个密码子所编码的氨基酸序列为GluLysArg，三个密码子的碱基序列为GAGAAGAGA。

[0062] 本实施方式步骤一中根据毕赤酵母密码子偏爱性设计Fowlicidin-2的基因序 列 为 CTAGTTCAAAGGGGACGTTTTGGAAGATTTCTGAGAAAGATCCGAAGATTCAGACCAAAGGTTACAATCACTATTCAAGGTAGTGCTCGATTC；根据毕赤酵母密码子偏爱性设计天蚕素B的基因序列为 AAATGGAAAGTTTTTAAGAAGATTGAGAAAATGGGCAGGAACATTCGTAACGGAATCGTGAAGGCTGGGCCCGCAATTGCTGTGCTGGGTGAAGCTAAAGCCATATATCA；根据毕赤酵母密码子偏爱性设计Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)的基因序列为AAATGGAAAGTTTTTAAGAAGATTGAGAAAATGGGCAGGAACATTCGTAACGGAATCGTGAAGGCTGGGCCCGCAATTGCTGTGCTGGGTGAAGC TAAAGCCATATTATCA；根据毕赤酵母密码子偏爱性设计死亡素的基因序列为GGTTCTAAGAAACCAGTCCCCATCATATACTGCAATAGAAGAACGGGTAAGTGTCAGAGAATG。

[0063] 本实施方式步骤一中联接第一个和第二个原始小分子抗菌肽的GlySerGly的碱基序列为GGTTCTGGC；联接第二个和第三个原始小分子抗菌肽的GlySerGly的碱基序列为GGCTCCGGT；联接第三个和第四个原始小分子抗菌肽的GlySerGly的碱基序列为GGTTCTGGT。

[0064] 本实施方式步骤一中5’端引入Xho I粘性末端序列为CTCGAG，3’端引入XbalI粘性末端序列为TCTAGA。

[0065] 本 实 施 方 式 步 骤 二 中 PCR 筛 选 阳 性 克 隆，所 用 引 物 F1：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’；F2：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’，PCR反应条件为：
94℃、5min；95℃、30s，58℃、30s，72℃1min，32个循环后72℃延伸5min，引物F1与F2分别与pPICZαC的第855～875和1423～1443间的碱基互补，以引物F1与F2筛选重组质粒，经2％琼脂糖凝胶电泳，如图4所示。含有质粒pPICZαC的菌落为模板的PCR产物DNA条带为588bp，而阳性重组质粒的PCR扩增产物DNA条带为882bp。经Xhol I、Xba I双酶切鉴定、测序验证后，阳性重组质粒碱基序列与设计完全一致，说明成功构建了重组质粒pPICZαC-TM。

[0066] 本实施方式步骤三限制性内切酶Sac I酶切线性化pPICZαC-TM(5～10μg)，电转化毕赤酵母SMD1168，转化条件：3000V、25μF、200Ω电击5ms，30℃温育复性1～1.5h后涂MD平板，30℃培养至出现单菌落。PCR方法鉴定重转化子，用冻-煮-冻法制备PCR模板，所用引物为F1与F2，反应条件：94℃、5min；94℃、1min，59℃、1min，72℃、1min，30个循环；72℃5min。

[0067] PCR筛选结果如图5所示，阳性对照，即以含有质粒pPICZαC的酵母菌落为模板的PCR产物为588bp的DNA条带，而阳性重组质粒，即以含有重组质粒pPICZαC-TM的酵母菌落为模板扩增产物为882bp的DNA条带，说明目的基因已成功转入毕赤酵母SMD1168中。

[0068] 本实施方式步骤四诱导后离心收集上清，取样Tricine-SDS-PAGE分析，如图6所示，重组表达质粒pPICZαC-TM转化子产生了一条约为14kDa的特异的蛋白带，与预期融合串联抗菌肽蛋白的大小一致。获得的上清液利用AKTA explorer蛋白纯化仪凝胶过滤层析纯化蛋白，流动相为磷酸盐缓冲液(0.5mol/L Na2HPO4，0.15mol/L NaCl，pH7.0)，收集目的峰。然后进行脱盐，以去离子水为流动相，分离除去盐峰，利用Bradford方法测定蛋白质含量，计算融合串联抗菌肽的产率，平均每升培养基能获得融合串联抗菌肽233.8mg，真空冷冻干燥后获得重组抗菌肽干粉。

[0069] 本实施方式步骤一中用于制备融合串联抗菌肽的人工合成碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

[0070] 本实施方式融合串联抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

[0071] 本实施方式融合串联抗菌肽抑菌试验：

[0072] 融合串联抗菌肽最小抑菌浓度(MIC)测定

[0073] 以对数生长中期的大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、鼠伤寒沙门氏菌C77-31和绿脓杆菌ATCC27853为指示菌，测定本实施方式融合串联抗菌肽的抑菌活性。称取纯化冻干后的本实施方式融合串联抗菌肽，以及化学合成的四种原始小分子抗菌肽Fowlicidin-2、天蚕素B、Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)与死亡素，用PBS溶解后，稀释得到以下不同浓度的肽溶液：2560μg/ml、1280μg/ml、640μg/ml、320μg/ml、160μg/ml、80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml和5μg/ml。利用微量肉汤稀释法测定MIC，5 5
将测试菌过夜培养物释至2×10 ～7×10CFU/ml，分别取100μl加到96孔细胞培养板每行的1至10号孔，11号孔加入100μl的新鲜MHB培养基作为对照，再将按梯度稀释的抗菌肽11μl对应加到1至10号孔。37℃培养18至24h后，用酶标仪测490nm吸光值。吸光度比10号孔低50％以上的孔内的浓度即定义为对该测试菌的最小抑菌浓度MIC。由表
2可见，本实施方式融合串联抗菌肽对四种测试菌均具有明显的抑制作用，与四种原始小分子抗菌肽相比，除本实施方式融合串联抗菌肽与Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)对四种细菌的抗菌活性没有差异外，较其他三种原始小分子抗菌肽抗菌活性都有一定程度的提高，与Fowlicidin-2相比，对金黄色葡萄球菌的活性有所提高，与天蚕素B相比，对金黄色葡萄球菌的活性显著提高，对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌也有提高。与死亡素相比，对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的活性显著提高。

[0074] 表2本实施方式融合串联抗菌肽对四种测试菌的MIC

[0075]

[0076] 本实施方式融合串联抗菌肽的体外溶血活性检测，检测用血液样品取自正常人血液，检测步骤如下：

[0077] 新鲜血液1mL，3000r/min离心5min收集红细胞，PBS洗涤3遍，再用10mL PBS重悬制成8％(V/V)血细胞悬浮液，取100μL红细胞悬浮液与100μL用PBS溶解的不同浓度的本实施方式融合串联抗菌肽溶液混合，37℃孵育1h。3000r/min离心5min，取上清液，加入到96孔板中，酶标仪测定540nm吸光值，重复三次，取平均值，PBS作为阴性对照，0.1％的Triton-100做阳性对照。检测结果为，在256μg/ml浓度下未表现出溶血活性。

[0078] 本实施方式融合串联抗菌肽的动物体内急性毒性试验：

[0079] 采用昆明白小鼠60只，雌雄各半，体重26±0.40g，按照1mg/kg剂量肌肉注射本实施方式融合串联抗菌肽，每日一次，连续7天，观察小鼠毒性反应，结果表明，肌注本实施方式融合串联抗菌肽7天后，小鼠无异常反应，活动正常，60只小鼠全部存活，证明本实施方式融合串联抗菌肽无毒副作用。

[0080] 具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式四的不同点在于：

[0081] 步 骤 一 中 四 种 原 始 小 分 子 抗 菌 肽 为 Fowlicidin-2、天 蚕素 B、CecropinA(1-8)-Melittin(1-18) 和 死 亡 素，联 接 顺 序 为 死 亡 素、CecropinA(1-8)-Melittin(1-18)、Fowlicidin-2和天蚕素B。

[0082] 本实施方式步骤一中用于制备融合串联抗菌肽的人工合成碱基序列如SEQ ID NO：5所示。

[0083] 本实施方式融合串联抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

[0084] 本实施方式平均每升培养基能获得融合串联抗菌肽233.6mg

[0085] 本实施方式融合串联抗菌肽抑菌试验：

[0086] 融合串联抗菌肽最小抑菌浓度(MIC)测定

[0087] 以对数生长中期的大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、鼠伤寒沙门氏菌C77-31和绿脓杆菌ATCC27853为指示菌，测定本实施方式融合串联抗菌肽的抑菌活性。称取纯化冻干后的本实施方式融合串联抗菌肽，以及化学合成的四种原始小分子抗菌肽Fowlicidin-2、天蚕素B、Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)与死亡素，用PBS溶解后，稀释得到以下不同浓度的肽溶液：2560μg/ml、1280μg/ml、640μg/ml、320μg/ml、160μg/ml、80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml和5μg/ml。利用微量肉汤稀释法测定MIC，5 5
将测试菌过夜培养物释至2×10 ～7×10CFU/ml，分别取100μl加到96孔细胞培养板每行的1至10号孔，11号孔加入100μl的新鲜MHB培养基作为对照，再将按梯度稀释的抗菌肽11μl对应加到1至10号孔。37℃培养18至24h后，用酶标仪测490nm吸光值。吸光度比10号孔低50％以上的孔内的浓度即定义为对该测试菌的最小抑菌浓度MIC。由表
3可见，本实施方式融合串联抗菌肽对四种测试菌均具有明显的抑制作用，与四种原始小分子抗菌肽相比，除本实施方式融合串联抗菌肽与Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)对四种细菌的抗菌活性没有差异外，较其他三种原始小分子抗菌肽抗菌活性都有一定程度的提高，与Fowlicidin-2相比，对金黄色葡萄球菌的活性有所提高，与天蚕素B相比，对金黄色葡萄球菌的活性显著提高，对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌也有提高。与死亡素相比，对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的活性显著提高。

[0088] 表3本实施方式融合串联抗菌肽对四种测试菌的MIC

[0089]

[0090] 本实施方式融合串联抗菌肽的体外溶血活性检测，检测用血液样品取自正常人血液，检测步骤如下：

[0091] 新鲜血液1mL，3000r/min离心5min收集红细胞，PBS洗涤3遍，再用10mL PBS重悬制成8％(V/V)血细胞悬浮液，取100μL红细胞悬浮液与100μL用PBS溶解的不同浓度的本实施方式融合串联抗菌肽溶液混合，37℃孵育1h。3000r/min离心5min，取上清液，加入到96孔板中，酶标仪测定540nm吸光值，重复三次，取平均值，PBS作为阴性对照，0.1％的Triton-100做阳性对照。检测结果为，在256μg/ml浓度下未表现出溶血活性。

[0092] 本实施方式融合串联抗菌肽的动物体内急性毒性试验：

[0093] 采用昆明白小鼠60只，雌雄各半，体重26±0.40g，按照1mg/kg剂量肌肉注射本实施方式融合串联抗菌肽，每日一次，连续7天，观察小鼠毒性反应，结果表明，肌注本实施方式融合串联抗菌肽7天后，小鼠无异常反应，活动正常，60只小鼠全部存活，证明本实施方式融合串联抗菌肽无毒副作用。

[0094] 具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式四的不同点在于：

[0095] 步骤一中四种原始小分子抗菌肽为Fowlicidin-2、天蚕素B、Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)和 死 亡 素，联 接 顺 序 为 天 蚕 素 B、死 亡 素、Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)和Fowlicidin-2。

[0096] 本实施方式步骤一中用于制备融合串联抗菌肽的人工合成碱基序列如SEQ ID NO：7所示。

[0097] 本实施方式融合串联抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

[0098] 本实施方式平均每升培养基能获得融合串联抗菌肽233.9mg

[0099] 本实施方式融合串联抗菌肽抑菌试验：

[0100] 融合串联抗菌肽最小抑菌浓度(MIC)测定

[0101] 以对数生长中期的大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、鼠伤寒沙门氏菌C77-31和绿脓杆菌ATCC27853为指示菌，测定本实施方式融合串联抗菌肽的抑菌活性。称取纯化冻干后的本实施方式融合串联抗菌肽，以及化学合成的四种原始小分子抗菌肽Fowlicidin-2、天蚕素B、CecropinA(1-8)-Melittin(1-18)与死亡素，用PBS溶解后，稀释得到以下不同浓度的肽溶液：2560μg/ml、1280μg/ml、640μg/ml、320μg/ml、160μg/ml、80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml和5μg/ml。利用微量肉汤稀释法测定MIC，5 5
将测试菌过夜培养物释至2×10 ～7×10CFU/ml，分别取100μl加到96孔细胞培养板每行的1至10号孔，11号孔加入100μl的新鲜MHB培养基作为对照，再将按梯度稀释的抗菌肽11μl对应加到1至10号孔。37℃培养18至24h后，用酶标仪测490nn吸光值。吸光度比10号孔低50％以上的孔内的浓度即定义为对该测试菌的最小抑菌浓度MIC。由表
4可见，本实施方式融合串联抗菌肽对四种测试菌均具有明显的抑制作用，与四种原始小分子抗菌肽相比，除本实施方式融合串联抗菌肽与Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)对四种细菌的抗菌活性没有差异外，较其他三种原始小分子抗菌肽抗菌活性都有一定程度的提高，与Fowlicidin-2相比，对金黄色葡萄球菌的活性有所提高，与天蚕素B相比，对金黄色葡萄球菌的活性显著提高，对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌也有提高。与死亡素相比，对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的活性显著提高。

[0102] 表4本实施方式融合串联抗菌肽对四种测试菌的MIC

[0103]

[0104] 本实施方式融合串联抗菌肽的体外溶血活性检测，检测用血液样品取自正常人血液，检测步骤如下：

[0105] 新鲜血液1mL，3000r/min离心5min收集红细胞，PBS洗涤3遍，再用10mL PBS重悬制成8％(V/V)血细胞悬浮液，取100μL红细胞悬浮液与100μL用PBS溶解的不同浓度的本实施方式融合串联抗菌肽溶液混合，37℃孵育1h。3000r/min离心5min，取上清液，加入到96孔板中，酶标仪测定540nm吸光值，重复三次，取平均值，PBS作为阴性对照，0.1％的Triton-100做阳性对照。检测结果为，在256μg/ml浓度下未表现出溶血活性。

[0106] 本实施方式融合串联抗菌肽的动物体内急性毒性试验：

[0107] 采用昆明白小鼠60只，雌雄各半，体重26±0.40g，按照1mg/kg剂量肌肉注射本实施方式融合串联抗菌肽，每日一次，连续7天，观察小鼠毒性反应，结果表明，肌注本实施方式融合串联抗菌肽7天后，小鼠无异常反应，活动正常，60只小鼠全部存活，证明本实施方式融合串联抗菌肽无毒副作用。