适用于黄瓜花叶病毒不同亚组株系基因组的通用引物及扩增方法

摘要

一种适用于黄瓜花叶病毒不同亚组株系基因组的通用引物及扩增方法，即提供一套能够用于烟草CMV检测，特别是用于烟草CMV所有亚组株系全基因组扩增的通用引物，本发明还还提供利用该套引物扩增侵染烟草黄瓜花叶病毒不同亚组株系基因组扩增和检测CMV的一步法RT-PCR方法。本发明的有益效果是，只需一套引物，就能扩增得到CMV不同亚组株系基因组全序列和进行CMV病毒病检测。结合一步法RT-PCR方法，能够大大缩短CMV基因组扩增和CMV病毒病检测时间。该套引物通用性强，扩增产物单一，一步法RT-PCR扩增方法简单、快速、高效，使用该套引物和方法能够有效促进CMV基因组的研究工作，加快研究进程。

权利要求

1.适用于黄瓜花叶病毒不同亚组株系基因组的一套引物，其特征在于：引物配对方式如下：P11和P12配对；P21和P22配对；P11和P31配对；P41和P42配对；P51和P52配对；

P61和P42配对；

该引物的名称和核苷酸序列如下：

P11：GTTTATTTACAAGAGCGTACGGTTCAA；

P12：CATGTGATGGGGGAACGTGT；

P21：GAGAAGAATGGGACGTGATATCATC；

P22：TGGTCTCCTTTTGGAGGCCCC；

P11：GTTTATTTACAAGAGCGTACGGTTCAA；

P31：CGTTCTCGAAGGCATCTCTGG；

P41：CGATTCCAGAGATGCCTTCG；

P42：GTTTTCCCAGTCACGACTGGTCTCCTT；

P51：GTAATCTTACCACTGTGTGTGTGCG；

P52：ACGGTAGAATCAAATTTCGGCAA；

P61：CGCTCGCCTGTTGAAGTCG；

P42：GTTTTCCCAGTCACGACTGGTCTCCTT。

2.一种利用权利要求1所述的一套引物扩增CMV不同亚组株系基因组序列的方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)提取样品RNA，以其为模板，以权利要求1中所提供的引物，使用一步法RT-PCR进行扩增；

(2)PCR产物琼脂糖胶电泳检测，根据产物条带有无和大小判断样品是否有CMV感染，目的条带回收，连接T载体，转化细菌感受态细胞；

(3)进行蓝白斑筛选和PCR鉴定，确定阳性菌株，阳性菌株放大培养后，提取质粒；

(4)阳性质粒测序，结果分析，确定是否为CMV，测序结果经过拼接，得到CMV基因组全序列。

说明书

适用于黄瓜花叶病毒不同亚组株系基因组的通用引物及扩

增方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于烟草病毒基因组扩增和烟草病毒病检测的通用引物及扩增方法，尤其是适用于烟草黄瓜花叶病毒不同亚组株系基因组扩增和烟草黄瓜花叶病毒病检测的通用引物及扩增方法，属于烟草病害研究领域。

背景技术

[0002] 黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)能侵染包括茄科、十字花科、豆科等经济作物在内的1000多种单子叶和双子叶植物，造成严重的经济损失，是世界范围内最重要的植物病毒之一[1]。烟草是茄科植物，作为一种重要的经济作物，在世界各地种植广泛。黄瓜花叶病毒是危害烟草的主要病毒病害[2]。

[0003] 黄瓜花叶病毒是雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的典型成员，具有典型的三分体正义单链RNA (Positive sense single．Stranded RNA，+ssRNA)基因组，三条基因组分别为RNAl、RNA2和RNA3。根据血清学和核酸序列同源性，CMV株系被划分为3个亚组：IA、IB和Ⅱ[3,4]。作为一种典型的RNA病毒，CMV基因组序列极易发生变异[5]，对于亚组I和亚组II，组内各株系间的核酸序列同源性在88%以上，而亚组间株系核酸序列同源性只有69%-77%[1]。如此低的序列同源性，给CMV全基因组PCR扩增带来很大困难。目前，测定CMV基因组全序列，首先要确定CMV株系，主要根据CMV基因组部分区域如CP基因和3′UTR区域的基因序列确定；再根据确定的株系设计特异性全基因组扩增引物进行扩增。这样设计的特异性引物，用于同组其它株系或其它亚组株系基因组全序列扩增时，由于不同亚组株系间序列同源性低，引物通用性差，匹配性不高，将直接造成扩增失败。目前还没有可以适用于CMV所有亚组不同株系基因组全序列扩增的通用引物及一步法RT-PCR扩增方法的报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的正是针对上述现有技术所存在的问题而专门提供的一种适用于黄瓜花叶病毒不同亚组株系基因组的通用引物及扩增方法，即提供一套能够用于烟草CMV检测，特别是用于烟草CMV所有亚组株系全基因组扩增的通用引物，本发明的目的还在于提供利用该套引物扩增侵染烟草黄瓜花叶病毒不同亚组株系基因组扩增和检测CMV的一步法RT-PCR方法。

[0005] 本发明的上述技术目的通过以下技术方案实现。

[0006] 本发明的通用引物的名称和核苷酸序列如下：

[0007] P11：GTTTATTTACAAGAGCGTACGGTTCAA；

[0008] P12：CATGTGATGGGGGAACGTGT；

[0009] P21：GAGAAGAATGGGACGTGATATCATC；

[0010] P22：TGGTCTCCTTTTGGAGGCCCC；

[0011] P11：GTTTATTTACAAGAGCGTACGGTTCAA；

[0012] P31：CGTTCTCGAAGGCATCTCTGG；

[0013] P41：CGATTCCAGAGATGCCTTCG；

[0014] P42：GTTTTCCCAGTCACGACTGGTCTCCTT；

[0015] P51：GTAATCTTACCACTGTGTGTGTGCG；

[0016] P52：ACGGTAGAATCAAATTTCGGCAA；

[0017] P61：CGCTCGCCTGTTGAAGTCG；

[0018] P42：GTTTTCCCAGTCACGACTGGTCTCCTT。

[0019] 引物配对方式如下：

[0020] P11和P12配对；P21和P22配对；P11和P31配对；P41和P42配对；P51和P52配对；P61和P42配对。

[0021] 利用上述的通用引物扩增CMV不同亚组株系基因组序列的方法，包括以下具体步骤：

[0022] (1)提取样品RNA，以其为模板，以本发明提供的引物，使用一步法RT-PCR进行扩增；

[0023] (2)PCR产物琼脂糖胶电泳检测，根据产物条带有无和大小判断样品是否有CMV感染，目的条带回收，连接T载体，转化细菌感受态细胞；

[0024] (3)进行蓝白斑筛选和PCR鉴定，确定阳性菌株，阳性菌株放大培养后，提取质粒；

[0025] (4)阳性质粒测序，结果分析，确定是否为CMV，测序结果经过拼接，得到CMV基因组全序列。

[0026] 其中：步骤（1）中的RT-PCR 25μl体系为：

[0027]反应组分 组分体积
反应酶 1μl
反应缓冲液 12.5μl
上游引物(20μM) 0.5μl
下游引物(20μM) 0.5μl
RNA 0.3-1μl
去RNA酶H2O 10μl
总体积 25μl

[0028] RT-PCR反应条件为：50℃ 30min，94℃ 3min，94℃ 30sec，53-58℃ 30sec，72℃2min，28-35个循环，72℃ 10min，4℃保存。

[0029] 本发明的有益效果是，只需一套引物，就能扩增得到CMV不同亚组株系基因组全序列和进行CMV病毒病检测。结合一步法RT-PCR方法，能够大大缩短CMV基因组扩增和CMV病毒病检测时间。该套引物通用性强，扩增产物单一，一步法RT-PCR扩增方法简单、快速、高效，使用该套引物和方法能够有效促进CMV基因组的研究工作，加快研究进程。

附图说明

[0030] 图1是整套CMV基因组扩增通用引物扩增效果图。

[0031] 图1中：1：核酸分子量标准；2-7：分别为P1-P6引物对PCR扩增产物条带。

[0032] 图2是使用CMV基因组扩增引物和方法对CMV不同亚组成员基因组扩增图。

[0033] 图2中：1和20：核酸分子量标准；2-7：CMV IA亚组P1-P6引物对扩增条带；8-13：CMV IB亚组P1-P6引物对扩增条带；14-19：CMV II亚组P1-P6引物对扩增条带。

[0034] 具体实施方式：

[0035] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但并不限制本发明的范围。

[0036] 以下实施方式均按照常规实验条件，如《分子克隆实验指南》第三版(Sambrook等著，黄培堂等译. 北京: 科学出版社, 2002)中所述的技术规程，或按照厂商建议的实验条件。

[0037] 实施例1：CMV基因组扩增保守引物设计

[0038] 下载NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)已经登陆的CMV基因组序列，根据分离的不同寄主和国家，分别选择IA、IB和II亚组代表性株系，使用Clustal软件(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)对RNAl、RNA2和RNA3进行Alignment分析，确定不同亚组株系核苷酸序列共有的保守区域，根据保守区域，使用Primer3 ( http://frodo.wi.mit.edu/ )进行引物设计，完成后进行Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索验证。设计的引物由专业公司进行合成。引物序列、配对使用方式和扩增的片段大小见表1.

[0039] 表1 CMV全基因组扩增引物信息

[0040]

[0041] 实施例2：CMV全基因组扩增保守引物使用效果检测

[0042] 1. 感染CMV样品总RNA提取

[0043] 以感染CMV的叶片如鲜烟叶，采用商业RNA提取试剂盒进行总RNA提取。

[0044] 2. CMV基因组全序列PCR扩增

[0045] 使用实施例1设计的引物及配对方式，以步骤1提取的总RNA为模板，使用商业RT-PCR一步法试剂盒进行PCR反应，反应体系如下：

[0046]反应组分 组分体积
反应酶 1μl
反应缓冲液 12.5μl
上游引物(20μM) 0.5μl
下游引物(20μM) 0.5μl
RNA 0.5μl
去RNA酶H2O 10μl
总体积 25μl

[0047] RT-PCR反应条件：50℃ 30min，94℃ 3min，94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，32个循环，72℃ 10min，4℃保存。

[0048] 3. 电泳检测及产物回收

[0049] 步骤2获得PCR产物取5μl经1%琼脂糖胶检测，图1显示了本发明提供的CMV基因组扩增6对引物实际扩增产物检测结果，产物条带单一、清晰、大小合适。根据每一条带有无和大小均可以判断样品是否有CMV感染。目的条带进行切胶回收，使用商业公司胶回收试剂盒进行目的片段回收。

[0050] 4. 连接、转化及筛选

[0051] 步骤3纯化的PCR产物，连接T载体，转化细菌感受态细胞，涂布含有AMP、X-gal和IPTG的固体LB平板，进行蓝白斑和抗性筛选，经PCR鉴定确定为阳性的白色菌斑，使用含有AMP的液体LB培养基放大培养，提取质粒。方法中的T载体、感受态细胞和质粒提取试剂盒使用商业产品。

[0052] 测序及序列分析

[0053] 步骤4提取的质粒，送去商业公司如生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果使用Blast程序进行同源性搜索，以确定是否为CMV基因组片段。经Blast检索，本发明提供的CMV基因组扩增保守引物扩增产物均为CMV基因组片段，证明了该套引物和使用方法的有效性和特异性。同时也证明了使用其中任何的一对或多对引物对烟草CMV病毒病进行检测，均能确定是否有CMV侵染。

[0054] 实施例3：CMV不同亚组株系全基因组扩增

[0055] 1. 感染CMV样品总RNA提取

[0056] 本研究室保存有CMV 三个亚组IA、IB和II的株系，分别以感染三个株系的叶片如鲜烟叶为材料，采用商业RNA提取试剂盒进行总RNA提取。

[0057] 2. CMV基因组全序列PCR扩增

[0058] 使用实施例1设计的引物及配对方式，以步骤1提取的总RNA为模板，使用商业RT-PCR一步法试剂盒进行PCR反应，反应体系如下：

[0059] 表3 PCR体系

[0060]反应组分 组分体积
反应酶 1μl
反应缓冲液 12.5μl
上游引物(20μM) 0.5μl
下游引物(20μM) 0.5μl
RNA 0.5μl
去RNA酶H2O 10μl
总体积 25μl

[0061] RT-PCR反应条件：50℃ 30min，94℃ 3min，94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，32个循环，72℃ 10min，4℃保存。

[0062] 3. 电泳检测及产物回收

[0063] 步骤2获得PCR产物取5μl经1%琼脂糖胶检测，图2显示了CMV三个亚组IA、IB和II成员基因组序列6对引物扩增效果检测结果，可见IA、IB和II使用本发明提供的的6对引物均能扩增出目的条带，且条带单一、清晰。使用商业公司胶回收试剂盒进行目的片段回收。

[0064] 4. 连接、转化及筛选

[0065] 步骤3纯化的PCR产物，连接T载体，转化细菌感受态细胞，涂布含有AMP、X-gal和IPTG的固体LB平板，进行蓝白斑和抗性筛选，经PCR鉴定确定为阳性的白色菌斑，使用含有AMP的液体LB培养基放大培养，提取质粒。方法中的T载体、感受态细胞和质粒提取试剂盒使用商业产品。

[0066] 测序，拼接获得CMV基因组全序列

[0067] 步骤4提取的质粒，送去商业公司如生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果使用CLC Genomics Workbench软件进行拼接后，得到全基因序列。使用Clastal软件进行同源比较，显示所测结果均为CMV三个亚组成员的基因组全序列。证明本发明提供的黄瓜花叶病毒全基因组扩增保守引物适用性强，扩增产物单一，扩增方法简单、快速、高效，说明该发明提供的引物和方法完全能够用于烟草CMV不同亚组株系基因组序列的扩增。同时也证明了使用其中任何的一对或多对引物对烟草CMV病毒病进行检测，根据条带有无和大小均能确定是否有CMV侵染。

[0068] 参考文献：

[0069] [1]Palukaitis P, Roossinck MJ, Dietzgen RG,et a1. Cucumber mosaic virus.Adv Virus Res,1992,41:281-348]

[0070] [2]陈瑞泰,朱贤朝,王智发,等.全国16个主产烟省(区)烟草侵染性病害调研报告[J].中国烟草科学,1997 (4) :1-7.

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[0072] [4]Roossinck MA，Zhang L, Hellwald K H.Rearrangements in the5’nontranslated region and phylogenetic analyses of cucumber mosaic virus RNA
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