运动机能相关基因ACE荧光检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了一种运动机能相关基因ACE荧光检测试剂盒及检测方法，属于生物检测技术领域。该试剂盒包括扩增前试剂和扩增后试剂；所述扩增前试剂包括：PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增ACE基因的引物混合物；所述扩增后试剂包括：基因分型标准物和内标。本发明以上述基因为检测对象，通过PCR扩增，毛细管电泳检测，与基因分型标准物的对比，即可进行基因分型，筛选出具有特定基因型的个体，为体育选材提供参考。在体育选材方面首次采用了荧光标记技术、毛细管电泳技术实现对运动机能相关基因的高灵敏度特异性检测，大大节约了人力物力和时间。

权利要求

1.一种荧光检测试剂盒应用于运动机能相关基因ACE检测的非诊断性方法，其特征在于通过荧光引物PCR及毛细管电泳特异性检测运动机能相关基因ACE；所述的荧光检测试剂盒包括DNA聚合酶及其缓冲溶液、扩增基因的引物、内标及基因分型标准物；所述基因的扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测；

用于ACE基因检测的引物为：

SEQ NO.1：5’-CTGGAGAGCCACTCCCATCCTTTCT-3’SEQ NO.2：5’-TAAGGGGAGCTCAGAGAATTTCAG-3’SEQ NO.3：5’-GCA CTC CAG CCT GGG C-3’。

2.根据权利要求1所述的荧光检测试剂盒应用于运动机能相关基因ACE检测的非诊断性方法，其特征在于：所述的用于ACE基因扩增的引物，其中，引物SEQ NO.1的5’端进行荧光染料标记，内标选用不同于上述的荧光染料标记。

说明书

运动机能相关基因ACE荧光检测试剂盒及检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种运动机能相关基因ACE荧光检测试剂盒及检测方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

[0002] 随着人类基因组计划的完成，后基因组计划的全面展开，以基因工程为主导的生物技术在体育运动问题领域的应用得到广泛的关注。基因遗传工程应用于运动员选材是历史必然、大势所趋，它必将从根本上引起运动选材理论和方法的革命。运用遗传学的理论和方法进行运动选材已经有了初步进展。

[0003] 目前人们普遍认为ACE（血管紧张素转化酶）水平和心血管的形态、功能密切相关。ACE基因的多态性是人耐力素质优劣的决定性因素之一，其作为一个有价值的遗传标志，有望成为科学选材的理想指标。

[0004] 肾素―血管紧张素系统（RAS）在心血管系统中作用显著，如调节血压、血容量、血管张力，引起血管壁增厚或心肌细胞肥大和非心肌细胞的增殖，是血压和体液、电解质平衡的主要调节因素之一。ACE是RAS酶/底物链反应体系中的关键酶，ACE的作用是催化十肽血管紧张素I（Ang I）转变为八肽的血管紧张素II（Ang II）。ACE的水平决定着RAS中Ang II的生成量。临床上认为ACE为高血压的致病因素之一。

[0005] 分子遗传学研究发现ACE基因位于第16内含子的一段287bp的Alu序列的插入（I）/缺失（D）有多态性，使ACE基因有三种基因型：II(插入纯合型)、ID（插入/缺失型）和DD（缺失纯合型）。I使人体血液中的ACE水平较低，形式D起相反作用。II型的人，其耐力比拥有两个D基因的人要强。I基因能增强肌肉吸收氧和营养成份的能力，助于增强人的有氧耐力。有实验证明在不同基因型的个体中，机体局部耐力机能的改善有明显的个体差异：在对训练的敏感度上，II纯合子比DD纯合子大l1倍。

[0006] 目前常用的基因检测方法有：直接测序（direct sequencing,DS）、连接酶检测反应（ligase detection reaction，LDR）、限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、变性高效液相色谱分析（denaturing high performance liquid chromotography，DHPLC）、定量PCR。这些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁琐、结果不易判读、重复性差、假阴性假阳性多等问题。

[0007] 采用荧光标记技术、毛细管电泳技术，通过带不同荧光标记物的引物对运动机能相关基因ACE特异性的扩增，而后经毛细管电泳后分析PCR产物出峰情况，即可实现对该运动机能相关基因位点的检测，灵敏度高、判读清晰准确、采样方便。

发明内容

[0008] 本发明目的是提供一种运动机能相关基因ACE荧光检测试剂盒及检测方法。

[0009] 本发明所述的运动机能相关基因ACE荧光检测试剂盒，包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂；

[0010] 所述扩增前试剂包括：PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs的混合物，Taq酶，引物混合物以及超纯水；

[0011] 所述扩增后试剂包括：内标和用于基因分型的基因分型标准物；

[0012] 使用所述的试剂盒进行PCR扩增反应的条件：PCR扩增体系的pH值为8.0-9.0，镁离子浓度为1.5-3.5mM，4种dNTP的终浓度各为200-300μM，Taq酶的用量为0.1-0.4U/μL，引物终浓度为0.2-0.4μM。

[0013] 用于ACE基因检测的引物为：

[0014] SEQ NO.1：5’-CTGGAGAGCCACTCCCATCCTTTCT-3’

[0015] SEQ NO.2：5’-TAAGGGGAGCTCAGAGAATTTCAG-3’

[0016] SEQ NO.3：5’-GCA CTC CAG CCT GGG C-3’

[0017] 所述的引物中SEQ NO.1的5’端进行荧光染料标记，内标所用的荧光染料为不同的荧光素。

[0018] 所述扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。

[0019] 采用所述试剂盒应用于运动机能相关基因检测的方法，是通过荧光引物PCR及毛细管电泳特异性检测运动机能相关基因ACE；用于ACE检测的引物为：SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3，所述基因的扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。

[0020] 其中所检测的人基因组DNA为：使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法对来源样本进行处理得到的DNA；所述的来源样本为：来源于人类的：滤纸片血斑/口腔拭子样本、FTA卡血斑/口腔拭子样本、口腔拭子样本、血液。

[0021] 使用所述的试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在任何型号的PCR仪上进行，扩增程序：94-98℃1-5min；26-32个循环的94-98℃15-60s，55-65℃15-60s，72℃15-60s；60℃30-60min。

[0022] 本发明的有益效果如下：

[0023] 本发明以ACE基因为检测对象，通过PCR扩增，毛细管电泳检测，与基因分型标准物的对比，即可进行基因分型，筛选出具有特定基因型的个体，为体育选材提供参考。在体育选材方面首次采用了荧光标记技术、毛细管电泳技术实现对运动机能相关基因的高灵敏度特异性检测，大大节约了人力物力和时间。

附图说明

[0024] 图1是本发明的试剂盒对71-2号样本ACE基因个体DNA扩增后的分型结果图；

[0025] 图2是本发明的试剂盒对74-2号样本ACE基因个体DNA扩增后的分型结果图；

[0026] 图3是本发明的试剂盒对69-4号样本ACE基因个体DNA扩增后的分型结果图。

具体实施方式

[0027] 以下结合实施例对本发明做进一步描述。

[0028] 实施例1

[0029] 本发明的试剂盒检测40个不同个体的DNA样本。用于运动机能相关基因检测的引物采用蓝色荧光染料标记，内标采用红色荧光染料标记。

[0030] 1、待测样本40份，下文列举的是不同基因型个体3份的结果。相关样本都已经使用“DNA提取-PCR扩增-测序”的技术方法对ACE进行过测序检测。其中，71-2号、74-2号、69-4号样本的分型结果依次为：D/D、I/I、I/D。

[0031] 2、检材的基因组DNA提取

[0032] Chelex提取法：剪下1～3mm血斑置于1.5mL离心管中，加入sdH2O 1mL，振荡离心，弃上清液，重复步骤两次，弃上清液，将5%Chelex-100震荡悬浮后快速用剪掉的枪头吸取200μL加入离心管中，振荡数秒，。于56℃水浴保温30min后，振荡数秒。95℃沸水浴10min，轻微振荡数秒。2000rpm离心5min，上清中为提取的DNA。

[0033] 3、扩增和扩增产物的检测分析

[0034] 3.1PCR扩增体系：

[0035]

[0036] 3.2PCR扩增程序：

[0037]

[0038] 4、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测

[0039] 由去离子甲酰胺与分子量内标组成上样混合物〔（0.2μL分子量内标）×（进样数）＋（9.8μL去离子甲酰胺）×（进样数）〕。将10μL上样混合物与1μL扩增产物或等位基因分析标准物混合，避免产生气泡。95℃变性5min，冰浴5min，并尽快电泳。用遗传分析仪检测分析。

[0040] 5、结论

[0041] 本发明分型完整清晰，结果如图1-3所示：

[0042] 图1：71-2号样本ACE基因分型位置出现114bp峰值约2650H的单峰，检为D/D纯合，与测序结果一致。

[0043] 图2：74-2号样本ACE基因分型位置出现110bp峰值约1500H的单峰，检为I/I纯合，与测序结果一致，提示该个体耐力更强。

[0044] 图3：69-4号样本ACE基因分型位置出现110bp峰值约1200H、114bp峰值约1600H的双峰，检为I/D杂合，与测序结果一致。

[0045] 以上实施例中所用的不同pH的2.5×PCR缓冲液，用不同pH值的Tris-HCl缓冲液配制，1×PCR缓冲液中的Tris-HCl浓度为10mM，KCl浓度为50mM；本发明中所用的Taq聚合酶以及其他试剂及材料均为市售产品。