用于治疗癌症的包含细胞周期蛋白依赖性激酶4或细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK4/6)抑制剂和mTOR抑制剂的组合

摘要

用于治疗癌症的CDK4/6抑制剂和mTOR抑制剂的组合。

权利要求

1.一种包含第一试剂和第二试剂的组合产品，所述第一试剂是7-环戊基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺或其药学上可接受的盐，所述第二试剂是依维莫司。

2.根据权利要求1的组合产品，其中第一试剂和第二试剂为组合的剂型。

3.根据权利要求1的组合产品，其中第一试剂和第二试剂为分离的剂型。

4.如权利要求1-3中任一项权利要求所述的组合在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗癌症。

5.如权利要求4所述的用途，其中所述癌症依赖于CDK4、CDK6或mTOR通路。

6.如权利要求5所述的用途，其中所述癌症是实体瘤癌症。

7.如权利要求4所述的用途，其中所述癌症是胰腺癌、乳腺癌、套细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌、黑色素瘤、结肠癌、食道癌、脂肪肉瘤、多发性骨髓瘤、T-细胞白血病、肾细胞癌、胃癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤、肝细胞癌、胃癌、肺癌或结肠癌。

8.如权利要求7所述的用途，其中所述癌症是胰腺癌、乳腺癌或套细胞淋巴瘤。

9.如权利要求4所述的用途，其中所述癌症是淋巴瘤。

说明书

用于治疗癌症的包含细胞周期蛋白依赖性激酶4或细胞周

期蛋白依赖性激酶6(CDK4/6)抑制剂和mTOR抑制剂的组合

发明领域

[0001] 用于治疗实体瘤和血液恶性肿瘤的雷帕霉素哺乳动物靶点(mTOR)抑制剂和细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)抑制剂的组合。本发明也涉及该组合在控制过度增殖疾病如癌症中的用途。

[0002] 相关背景技术

[0003] 肿瘤的发展与CDK及其调节物的遗传改变和失调紧密相关，暗示CDK抑制剂可用于抗癌治疗。事实上，早期的结果暗示转化细胞和正常细胞的区别在于其对于如细胞周期蛋白D/CDK4/6的要求，因此有可能开发出新的抗肿瘤试剂，其没有常规细胞毒性和细胞增殖抑制药物所观察到的一般宿主毒性。

[0004] CDK的功能是磷酸化某些蛋白质从而将其激活或者使其失活，所述蛋白包括如视网膜母细胞瘤蛋白质、核纤层蛋白、组蛋白H1和有丝分裂纺锤体的组分。CDK介导的催化步骤涉及从ATP到大分子酶底物的磷酸转移反应。已发现多组化合物通过CDK特异性ATP拮抗作用而具有抗增殖特性(参见综述Fischer,P.M.Curr.Opin.Drug Discovery Dev.2001,4,623-634)。

[0005] 在分子水平介导CDK/细胞周期蛋白复合物的活性需要一系列的刺激性和抑制性磷酸化或去磷酸化事件。CDK磷酸化由一组CDK活化激酶(CAK)和/或激酶如wee1、Myt1和Mik1进行。去磷酸化则由磷酸酶如cdc25(a和c)、pp2a或KAP进行。

[0006] CDK/细胞周期蛋白复合物活性还可由两个内源性细胞蛋白质抑制剂家族调节：ink4
Kip/Cip家族或INK家族。INK蛋白质特异性与CDK4和CDK6结合。p16 (也称为MTS1)
是一种潜在的肿瘤抑制基因，其在大量的原发性癌症中突变或删除。Kip/Cip家族包含蛋Cip1,Waf1 Kip1 kip2
白质如p21 、p27 和p57 ，其中p21由p53诱导，并且能够使CDK2/细胞周期蛋白
(E/A)复合物失活。在乳腺癌、结肠癌和前列腺癌中观察到p27的异常低水平表达。相反，已经显示，在实体瘤中，细胞周期蛋白E的过量表达与病人预后差相关。细胞周期蛋白D1的过量表达与食道癌、乳腺癌、鳞癌和非小细胞肺癌相关。

[0007] 上文概述了CDK及其相关蛋白质在增殖细胞中协调和驱动细胞周期的关键作用。还描述了CDK在其中发挥重要作用的一些生化通路。因此十分希望开发使用靶向CDK类群或靶向特定CDK的治疗方法治疗增殖性紊乱如癌症的单一疗法。因此，持续需要发现治疗人疾病的新的治疗试剂。

[0008] mTOR是主要发现于细胞的胞质中的激酶蛋白。它作为细胞增殖、血管新生和细胞代谢相关的许多生物过程的中心调节物。mTOR主要通过打开和关闭细胞翻译机器发挥作用，翻译机器包括核糖体并负责蛋白质合成。mTOR是多个细胞信号转导途径的关键胞内汇合点。mTOR通过对于细胞中位于其上游的通路所传递的激活或抑制信号产生反应，从而发挥其调节功能。多种生长因子(包括血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1))、激素(雌激素、孕酮)、和营养(葡萄糖、氨基酸)或氧气的存在或缺少都会激活这些不同的信号转导途径。在患有多种不同类型癌症的病人中，这些信号转导途径的一种或多种被异常活化，导致细胞增殖失调、肿瘤血管新生和细胞代谢异常。

发明内容

[0009] 本发明提供包含抑制CDK4/6通路的第一试剂和抑制mTOR即mTOR激酶活性及其下游效应物的第二试剂的组合。在另一方面，本发明提供组合，其包括含有治疗有效量的抑制CDK4/6的第一试剂、抑制mTOR激酶活性的第二试剂和药学上可接受的载体的药物组合物。

[0010] 此外，本发明提供了治疗有效量的组合在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述组合包含抑制CDK4/6通路的第一试剂和抑制mTOR激酶活性和下游效应物的第二试剂，或其药学上可接受的盐或药物组合物。

[0011] 本发明具有治疗癌症，特别是视网膜母细胞瘤蛋白质(视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白质或pRb)阳性的癌症的治疗用途。此类癌症类型包括套细胞淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、结肠癌、食道癌和脂肪肉瘤。

[0012] 可将上述组合和组合物施用于包含细胞或组织的系统，以及人类患者或动物个体。

[0013] 附图简要说明

[0014] 图1显示CDK4/6和mTOR抑制剂的组合引起的生长抑制增强。使用Jeko-1套细胞淋巴瘤细胞评价对于细胞生长的影响。显示了与对照(100%)相比的%生长。化合物A1是CDK4/6抑制剂，化合物B1是mTOR抑制剂。当同时用A1和B1化合物共同处理Jeko-1
细胞时，观察到A1+B1组合抑制生长。图中所示为使用的实际浓度。

[0015] 图2是在Jeko-1套细胞淋巴瘤细胞系中对CDK4/6和mTOR抑制剂组合的等效图分析。化合物A1和B1分别是CDK4/6和mTOR抑制剂。使用造成50%生长抑制的浓度构建
所示图。点线1代表当A1和B1的效果组合时，预测简单加成的生长抑制。线2是观察到
的生长抑制，表明A1/B1组合引起强烈的协同生长抑制。

[0016] 图3在MDA-MB453乳腺癌细胞系中CDK4/6和mTOR抑制剂组合的等效图分析。化合物A1和B1分别是CDK4/6和mTOR抑制剂。与上述图2相似，使用造成50%生长抑制的
浓度构建所示图，点线1代表预测的简单加成的生长抑制。线2是观察到的生长抑制，表明A1/B1组合引起强烈的协同生长抑制。

[0017] 图4显示在Jeko-1套细胞淋巴瘤异种移植物模型中，化合物A1与化合物B1组合增强了肿瘤生长延滞。治疗开始35天后停止给药(移植后56天)，允许肿瘤再次生长。联合给药组显著增强了肿瘤生长延滞(20天)。

[0018] 图5显示在PANC-1胰腺癌异种移植物模型中，化合物A1与化合物B1的组合增强了肿瘤生长延滞和肿瘤生长抑制，肿瘤体积(图5A)和存活百分比(图5B)。治疗开始22天后停止给药，允许肿瘤再次生长。联合给药组显著增强了肿瘤生长延滞(18天)。

[0019] 图6显示，当使用CDK4/6抑制剂化合物A1和mTOR抑制剂化合物B1的组合处理Jeko-1细胞时，使用CHALICE软件处理所得抑制值以产生抑制和ADD超量抑制矩阵，以及等效线图。

[0020] 图7显示，当使用CDK4/6抑制剂化合物A1和mTOR抑制剂化合物B2的组合处理Jeko-1细胞时，使用CHALICE软件处理所得抑制值以产生抑制和ADD超量抑制矩阵，以及等效线图。

[0021] 图8显示，当使用CDK4/6抑制剂化合物A4和mTOR抑制剂化合物B1的组合处理Jeko-1细胞时，使用CHALICE软件处理所得抑制值以产生抑制和ADD超量抑制矩阵，以及等效线图。

[0022] 图9显示，当使用CDK4/6抑制剂化合物A2和mTOR抑制剂化合物B1的组合处理Jeko-1细胞时，使用CHALICE软件处理所得抑制值以产生抑制和ADD超量抑制矩阵，以及等效线图。

[0023] 图10显示，当使用CDK4/6抑制剂化合物A3和mTOR抑制剂化合物B1的组合处理Jeko-1细胞时，使用CHALICE软件处理所得抑制值以产生抑制和ADD超量抑制矩阵，以及等效线图。

[0024] 图11显示，当使用CDK4/6抑制剂化合物A6和mTOR抑制剂化合物B1的组合处理Jeko-1细胞时，使用CHALICE软件处理所得抑制值以产生抑制和ADD超量抑制矩阵，以及等效线图。

[0025] 图12显示，当使用CDK4/6抑制剂化合物A5和mTOR抑制剂化合物B1的组合处理Jeko-1细胞时，使用CHALICE软件处理所得抑制值以产生抑制和ADD超量抑制矩阵，以及等效线图。

[0026] 图13显示，当使用CDK4/6抑制剂化合物A4和mTOR抑制剂化合物B2的组合处理Jeko-1细胞时，使用CHALICE软件处理所得抑制值以产生抑制和ADD超量抑制矩阵，以及等效线图。

[0027] 图14显示，当使用CDK4/6抑制剂化合物A2和mTOR抑制剂化合物B2的组合处理Jeko-1细胞时，使用CHALICE软件处理所得抑制值以产生抑制和ADD超量抑制矩阵，以及等效线图。

[0028] 图15显示，当使用CDK4/6抑制剂化合物A3和mTOR抑制剂化合物B2的组合处理Jeko-1细胞时，使用CHALICE软件处理所得抑制值以产生抑制和ADD超量抑制矩阵，以及等效线图。

[0029] 图16显示，当使用CDK4/6抑制剂化合物A6和mTOR抑制剂化合物B2的组合处理Jeko-1细胞时，使用CHALICE软件处理所得抑制值以产生抑制和ADD超量抑制矩阵，以及等效线图。

[0030] 图17显示，当使用CDK4/6抑制剂化合物A5和mTOR抑制剂化合物B2的组合处理Jeko-1细胞时，使用CHALICE软件处理所得抑制值以产生抑制和ADD超量抑制矩阵，以及等效线图。

[0031] 发明详述

[0032] 哺乳动物细胞周期进程是严密控制的过程，其中不同时相的转换以高度有序的方式进行，并由多个校验点监控。视网膜母细胞瘤蛋白质(pRb)是G1到S期转换的校验点蛋白质，其与E2F转录因子家族结合以在没有合适的生长刺激时阻止后者的活性。一旦有丝分裂原刺激，静默的细胞新合成D-细胞周期蛋白，从而开始进入S期，D细胞周期蛋白是细胞周期蛋白依赖性激酶4和6(CDK4/6)的活化因子。一旦与细胞周期蛋白结合，CDK4/6通过磷酸化使pRb蛋白质失活，这样释放出E2F以引导S期所需基因的转录。完全使pRb失活需要同时被细胞周期蛋白D-CDK4/6和细胞周期蛋白E-CDK2磷酸化，其中已证实CDK4/6在pRb的特定位点(Ser780，Ser795)的磷酸化是细胞周期蛋白E-CDK2磷酸化的先决条件。
除了D-细胞周期蛋白，CDK4/6的活性受到INK4a基因编码的p16的调节，p16抑制其激酶活性。细胞周期蛋白E-CDK2的抑制剂CIP/KIP蛋白质也与细胞周期蛋白D-CDK4/6复合物结合，这样通过将CIP/KIP与其靶点隔离进一步激活CDK2。因此，细胞周期蛋白D-CDK4/6是调节G1到S期转换的关键酶复合物。

[0033] 癌症中，D-细胞周期蛋白-CDK4/6-INK4a-pRb通常被破坏从而有利于细胞增殖。在大多数情况下(~80%)，癌症保留了功能性的pRb，并且使用不同机制以增加CDK4/6激酶活性。最常见的一个事件是通过突变、删除或表观遗传学沉默使p16失活。事实上，在大部分非小细胞肺癌、黑色素瘤、胰腺癌和间皮瘤中，经常观察到p16的功能性缺失。加上观察到造成p16结合阻碍的CDK4基因的特定突变(CDKR24C)已经证实在家族性黑色素瘤中具
有成因作用，未经校验的CDK4/6活性所造成的生长优势似乎是肿瘤发展相关的一个重要元素。

[0034] 增强激酶活性的另一机制是D-细胞周期蛋白的丰度增加，这通过基因易位、扩增或过量表达完成。在多数套细胞淋巴瘤中，细胞周期蛋白D1基因易位到免疫球蛋白重链，这种异常导致基因的组成型表达，引起未经校验的细胞增殖。在多例多发性骨髓瘤中观察到这种易位。基因扩增的例子见于鳞状细胞食道癌，已报道约50%的病例存在细胞周期蛋白D1扩增。这暗示大部分的食道癌生长高度依赖于活化的激酶。在乳腺癌中也经常检测到细胞周期蛋白D1扩增。除了细胞周期蛋白D1基因直接相关的遗传学缺陷外，该基因的转录也被作为该基因上游调节物的活化的癌基因显著升高。已显示活化的Ras或Neu癌基因主要通过上调细胞周期蛋白D1促进小鼠乳腺癌。在起始和维持期抑制细胞周期蛋白D1水平或抑制激酶活性也能够阻止肿瘤生长，这表明未经较验的CDK4/6是癌症发生中的关键元素。其它有丝分裂原通路的异常激活，如MAPK中的V600E B-Raf，以及PI3K中的PTEN缺失也增加了D-细胞周期蛋白，从而使增殖加速，这暗示CDK4/6对于携带的癌症至关重要。最后，在人肿瘤的子群中也发现CDK4和6编码基因的扩增。CDK4基因在100%脂肪肉瘤中与MDM2基因一起扩增，而CDK6扩增常见于T-LBL/ALL。总之，CDK4/6对具有功能性pRb的多种人癌症的增殖而言是关键的蛋白质，包括套细胞淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、结肠癌、食道癌和脂肪肉瘤。

[0035] 本发明的第一通用实施方式：

[0036] 包含细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)抑制剂的第一试剂以及mTOR抑制剂的第二试剂的组合，其中所述第一试剂是式I的化合物：

[0037]

[0038] 或其药学上可接受的盐，其中：

[0039] X是CR9、或N；

[0040] R1是C1-8烷基、CN、C(O)OR4或CONR5R6、5-14元杂芳基、或3-14元环杂烷基；

[0041] R2是C1-8烷基、C3-14环烷基、或5-14元杂芳基，且其中R2可被一个或多个C1-8烷基、或OH取代；

[0042] L是键、C1-8亚烷基、C(O)、或C(O)NR10，且其中L可被取代或不被取代；

[0043] Y是H、R11、NR12R13、OH，或Y是下述基团的一部分：

[0044] 其中Y是CR9或N；

[0045] 其中可出现0-3个R8，且R8是C1-8烷基、氧代、卤素，或者两个或更多个R8可形成桥接烷基；

[0046] W是CR9、或N；

[0047] R3是H、C1-8烷基、C1-8烷基R14、C3-14环烷基、C(O)C1-8烷基、C1-8卤代烷基、C1-8烷基OH、C(O)NR14R15、C1-8氰基烷基、C(O)R14、C0-8烷基C(O)C0-8烷基NR14R15、C0-8烷基C(O)OR14、NR14R15、SO2C1-8烷基、C1-8烷基C3-14环烷基、C(O)C1-8烷基C3-14环烷基、C1-8烷氧基或OH，当R3不是H时可以是被取代或未被取代的。

[0048] R9是H或卤素；

[0049] R4、R5、R6、R7、R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地选自H、C1-8烷基、C3-14环烷基、3-14元环杂烷基、C6-14芳基、5-14元杂芳基、烷氧基、C(O)H、C(N)OH、C(N)OCH3、C(O)C1-3烷基、C1-8烷基NH2、C1-6烷基OH，且其中当R4、R5、R6、R7、R10、R11、R12、R13、R14和R15不是H时，可以是被取代或未被取代的；

[0050] m和n独立地是0-2；且

[0051] 其中L、R3、R4、R5、R6、R7、R10、R11、R12、和R13、R14、和R15可被一个或多个C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-14环烷基、5-14元杂芳基、C6-14芳基、3-14元环杂烷基、OH、(O)、CN、烷氧基、卤素或NH2取代。

[0052] 在第一通用实施方式中的一个实施方式中，所述组合包括式I的CDK4/6抑制剂，其中R3是H、C1-8烷基、C3-14环烷基、C(O)C1-8烷基、C1-8烷基OH、C1-8氰基烷基、C0-8烷基C(O)C0-8烷基NR14R15、C0-8烷基C(O)OR14、NR14R15、C1-8烷基C3-14环烷基、C(O)C1-8烷基C3-14环烷基、C0-8烷氧基、C1-8烷基R14、C1-8卤代烷基，或C(O)R14，其可被一个或多个OH、CN、F或NH2取代，14 15
并且其中R 和R 彼此独立选自H、C1-8烷基、C3-14环烷基、烷氧基、C(O)C1-3烷基、C1-8烷基NH2或C1-6烷基OH。

[0053] 在第一通用实施方式中的另一实施方式中，所述组合包含式I的CDK4/6抑制剂，3
其中R是H、C1-8烷基或C1-8烷基OH。在又一实施方式中，本发明的组合包括式I的CDK4/6抑制剂，其中Y是H、OH，或者Y是下列基团的部分
9 8 8

[0054] 其中Y是N且W是CR或N；且其中可出现0-2个R ，且R是C1-8烷8
基、氧代，或者两个或更多个R可形成桥接烷基。

[0055] 在第一通用实施方式的另一实施方式中，本发明包括式I的CDK4/6抑制剂，其中L是键、C1-8亚烷基或C(O)NH或C(O)。在另一优选实施方式中，所述组合物包括式I的CDK4/62 2
抑制剂，其中R是C3-14环烷基。在另一实施方式中，R 是环戊烷。

[0056] 在第一通用实施方式的另一实施方式中，本发明包括式I的CDK4/6抑制剂，其中1 4 5 6 1 5 6 5 6
R是CN、C(O)OR 、CONRR或5-14元杂芳基。在又一实施方式中，R 是CONR R，其R和R
是C1-8烷基。

[0057] 在又一实施方式中，本发明包括式I的CDK4/6抑制剂，其中X是CR9。在另一实施9
方式中，一个X是N，另一个X是CR。在另一实施方式中，所述组合包括式I的CDK4/6抑
9
制剂，其中X是CR，且Y是

[0058] 其中m和n是1，且Y和W是N。

[0059] 在第一通用实施方式的另一实施方式中，本发明包括式I的CDK4/6抑制剂，其中9
一个X是N，另一X是CR。在实施方式中，本发明包括式(I)的化合物，如：

[0060]

[0061] 在第一通用实施方式的另一实施方式中，本发明包括式I的化合物，其中X是CR9且Y是

[0062] 其中m和n是1，且Y和W是N。

[0063] 在式I的另一实施方式中，R3是H、C1-8烷基、C3-14环烷基、C(O)C1-8烷基、C1-8烷基14 15 14 14 15
OH、C1-8氰基烷基、C0-8烷基C(O)C0-8烷基NR R 、C0-8烷基C(O)OR 、NR R 、C1-8烷基C3-14环
14 14
烷基、C(O)C1-8烷基C3-14环烷基、C0-8烷氧基、C1-8烷基R 、C1-8卤代烷基、或C(O)R ，其可被
14 15
一个或多个OH、CN、F或NH2取代，并且其中R 和R 彼此独立地选自H、C1-8烷基、C3-14环烷基、烷氧基、C(O)C1-3烷基、C1-8烷基NH2或C1-6烷基OH。

[0064] 在式I的另一实施方式中，Y是H、OH，或者Y是下述基团的部分9

[0065] 其中Y是N，且W是CR或N；

[0066] 其中可出现0-2个R8，且R8是C1-8烷基、氧代，或者两个或更多个R8可形成桥接烷基。

[0067] 在式I的另一实施方式中，

[0068] L是键、C1-8亚烷基、或C(O)NH、或C(O)。

[0069] R2是任何一个C3-7环烷基。

[0070] R1是CN、C(O)OR4、CONR5R6或5-14元杂芳基。

[0071] 在式I的另一实施方式中，X是CR9或X是N且另一X是CR9或X是CR9且Y是

[0072] 其中m和n是1，Y和W是N。

[0073] 式I的优选化合物包括：

[0074] 7-环戊基-2-[5-(3-甲基-哌嗪-1-基)-吡啶-2-基氨基]-7H-吡咯并[2,3d]嘧啶-6-腈；

[0075] 7-环戊基-2-{5-[4-(2-氟-乙基)-哌嗪-1-基]-吡啶-2-基氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0076] 7-环戊基-2-(4-二甲基氨基-3,4,5,6-四氢-2H-[1,3']联吡啶基-6'-基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0077] 2-[5-(4-氨甲酰基甲基-哌嗪-1-基)-吡啶-2-基氨基]-7-环戊基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0078] 2-{5-[4-(2-氨基-乙酰基)-哌嗪-1-基]-吡啶-2-基氨基}-7-环戊基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0079] 2-[5-(3-氨基-吡咯烷-1-基)-吡啶-2-基氨基]-7-环戊基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0080] 7-环戊基-2-{5-[4-(2-甲氧基-乙基)-哌嗪-1-基]-吡啶-2-基氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0081] 7-环戊基-2-[4-(2-羟乙基)-3,4,5,6-四氢-2H-[1,2']联吡嗪基-5'-基氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0082] 7-环戊基-2-[5-((R)-3-甲基-哌嗪-1-基)-吡啶-2-基氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0083] 7-环戊基-2-[5-((S)-3-甲基哌嗪-1-基)-吡啶-2-基氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0084] 7-环戊基-2-[5-(3-甲基哌嗪-1-基)-吡啶-2-基氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0085] 7-环戊基-2-{5-[4-(3-羟丙基)-哌嗪-1-基]-吡啶-2-基氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0086] 7-环戊基-2-{5-[4-(吡咯烷-1-羰基)-哌嗪-1-基]-吡啶-2-基氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0087] 7-环戊基-2-{5-[4-(2-羟基-乙基)-哌嗪-1-基]-吡啶-2-基氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0088] 7-环戊基-2-{5-[4-((S)-2,3-二羟丙基)-哌嗪-1-基]-吡啶-2-基氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0089] 7-环戊基-2-(5-{4-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基]-哌嗪-1-基}-吡啶-2-基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0090] 7-环戊基-2-{5-[4-(2-羟基-1-甲基乙基)-哌嗪-1-基]-吡啶-2-基氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0091] 7-环戊基-2-{6-[4-(2-羟乙基)-哌嗪-1-基]-哒嗪-3-基氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0092] 7-环戊基-2-{5-[4-(2,3-二羟丙基)-哌嗪-1-基]-吡啶-2-基氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0093] 7-环戊基-2-{5-[4-((R)-2,3-二羟丙基)-哌嗪-1-基]-吡啶-2-基氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0094] 7-环戊基-2-(4-二甲基氨基-3,4,5,6-四氢-2H-[1,3']联吡啶基-6'-基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-腈；

[0095] 7-环戊基-2-(3,4,5,6-四氢-2H-[1,2']联吡嗪基-5'-基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0096] 7-环戊基-2-[5-(哌嗪-1-羰基)-吡啶-2-基氨基]-7H-吡咯并[2,3d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0097] 7-环戊基-2-[5-(4-二甲基氨基哌啶-1-羰基)-吡啶-2-基氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0098] 7-环戊基-2-(1',2',3',4',5',6'-六氢-[3,4']联吡啶基-6-基氨基)-7H-吡咯并[2,3d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0099] 7-环戊基-2-[5-((S)-3-甲基哌嗪-1-基甲基)-吡啶-2-基氨基]-7H吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0100] 7-环戊基-2-{5-[4-((S)-2-羟丙基)-哌嗪-1-基]-吡啶-2-基氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0101] 7-环戊基-2-{5-[4-((R)-2-羟丙基)-哌嗪-1-基]-吡啶-2-基氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0102] 7-环戊基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸甲基酰胺；

[0103] 7-环戊基-2-[5-(4-异丙基-哌嗪-1-基)-吡啶-2-基氨基]-7H-吡咯并[2,3d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0104] 7-环戊基-2-[5-(4-异丙基-哌嗪-1-羰基)-吡啶-2-基氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0105] 7-环戊基-2-{5-[4-(4-甲基-戊基)-哌嗪-1-基]-吡啶-2-基氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0106] 7-环戊基-2-[6-(4-异丙基-哌嗪-1-基)-哒嗪-3-基氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0107] 7-环戊基-2-{5-[4-(2-羟基-2甲基丙基)-哌嗪-1-基]-吡啶-2-基氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0108] 7-环戊基-2-[5-(3,3-二甲基-哌嗪-1-基)-吡啶-2-基氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0109] 7-环戊基-2-[5-(3,8-二氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基甲基)-吡啶-2-基氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0110] 7-环戊基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0111] 7-环戊基-2-[5-(4-乙基-哌嗪-1-基)-吡啶-2-基氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0112] 7-环戊基-2-[5-(4-环戊基-哌嗪-1-基)-吡啶-2-基氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0113] 7-环戊基-2-(1'-异丙基-1',2',3',4',5',6'-六氢-[3,4']联吡啶基-6-基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0114] 7-环戊基-2-{5-[(R)-4-(2-羟乙基)-3-甲基-哌嗪-1-基]-吡啶-2-基氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0115] 7-环戊基-2-{5-[(S)-4-(2-羟乙基)-3-甲基-哌嗪-1-基]-吡啶-2-基氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0116] 7-环戊基-2-{5-[4-(2-羟乙基)-哌嗪-1-基甲基]-吡啶-2-基氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0117] 7-环戊基-2-{5-[4-(2-二甲基氨基乙酰基)-哌嗪-1-基]-吡啶-2-基氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0118] 7-环戊基-2-{5-[4-(2-乙基-丁基)哌嗪-1-基]-吡啶-2-基氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0119] 2-{5-[4-(2-环己基-乙酰基)哌嗪-1-基]-吡啶-2-基氨基}-7-环戊基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0120] 7-环戊基-2-{5-[4-(3-环戊基-丙酰)-哌嗪-1-基]-吡啶-2-基氨基}7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0121] 7-环戊基-2-[5-(4-异丁基哌嗪-1-基)-吡啶-2-基氨基]-7H-吡咯并[2,3d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0122] {4-[6-(7-环戊基-6-二甲基氨甲酰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基氨基)吡啶-3-基]-哌嗪-1-基}-乙酸甲酯；

[0123] 7-环戊基-2-{5-[4-(2-异丙氧基乙基)-哌嗪-1-基]-吡啶-2-基氨基}-7H吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0124] {4-[6-(7-环戊基-6-二甲基氨甲酰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基氨基)吡啶-3-基]-哌嗪-1-基}-乙酸乙酯；

[0125] 4-(6-{7-环戊基-6-[(2-羟基-乙基)甲基-氨甲酰基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基氨基}-吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯；

[0126] 7-环戊基-2-{5-[4-(2-甲基-丁基)哌嗪-1-基]-吡啶-2-基氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0127] 7-环戊基-2-[1'-(2-羟基-乙基)-1',2',3',4',5',6'-六氢-[3,4']联吡啶基-6-基氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺；

[0128] {4-[6-(7-环戊基-6-二甲基氨甲酰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基氨基)-吡啶-3-基]哌嗪-1-基}-乙酸；和

[0129] 2-{4-[6-(7-环戊基-6-二甲基氨甲酰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基氨基)-吡啶-3-基]-哌嗪-1-基}-丙酸；

[0130] 或其药学上可接受的盐。

[0131] 已公开的PCT专利申请WO2010/020675从整体上以及具体地描述了式(I)化合物，将该专利申请完整地通过参考纳入本文。

[0132] 本发明的第二通用实施方式：

[0133] 包含细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)抑制剂的第一试剂以及mTOR抑制剂的第二试剂的组合，其中所述第一试剂是式II的化合物：

[0134]

[0135] 或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中：

[0136] 虚线表示单键或双键；

[0137] A是N或CR5，其中R5是氢或C1-C3-烷基；

[0138] R2和R3各自独立地选自氢、羟基、C1-C3-烷基、C3-C8-环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、取代的C1-C3-烷基、取代的C3-C8-环烷基、取代的杂环基、取代的芳基和取代的杂芳基；

[0139] R4选自氢、C1-C8-烷基、取代的C1-C8-烷基、C3-C8-环烷基、取代的C3-C8-环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基；

[0140] 当X和Y之间的键是单键时，X是CR6R7、NR8或C=O,且Y是CR9R10或C=O；

[0141] 当X和Y之间的键是双键时，X是N或CR11,且Y是CR12；

[0142] 其中R6和R7各自独立地选自芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、氢、C1-C3-烷基、C3-C8-环烷基、杂环基、取代的烷基、取代的环烷基、和取代的杂环基；

[0143] R8是氢、C1-C3-烷基和C3-C8-环烷基；

[0144] R9和R10各自独立地是氢、C1-C3-烷基或C3-C8-环烷基；

[0145] R11和R12各自独立地选自卤素、氢、C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、CN、C=NOH、C=NOCH3、C(O)H、C(O)C1-C3-烷基、C3-C8-环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、取代的C1-C3-烷基、取代13 14 13
的C3-C8-环烷基、取代的杂环基、取代的芳基、取代的杂芳基、-BNR R 、-BOR 、-BC(O)
13 13 13 14 13
R 、-BC(O)OR 、-BC(O)NR R ；其中B是键、C1-C3-烷基或带支链的C1-C3-烷基；其中R 和
14
R 各自独立地选自氢、C1-C3-烷基、C3-C8-环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、取代的烷基、取代的环烷基、取代的杂环基、取代的芳基和取代的杂芳基。

[0146] 在第二实施方式的一个实施方式中，式II的化合物选自：

[0147]

[0148]

[0149]

[0150]

[0151]

[0152] 已公开的PCT专利申请WO2007/140222从整体上以及具体地描述了式(II)化合物，将该专利文献完整地通过参考纳入本文。

[0153] 本发明的第三通用实施方式：

[0154] 包含细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)抑制剂的第一试剂以及mTOR抑制剂的第二试剂的组合，其中所述第一试剂是式III的化合物：

[0155]

[0156] 或其药学上可接受的盐，其中：

[0157] R1是C1-6-烷基、C3-14-环烷基、3-14元环杂烷基、C6-14芳基、C1-6-烷氧基、C1-6烷基C6-14芳基、C1-6烷基C3-14环烷基、C1-6烷基-3-14元环杂烷基、C1-6烷基-5-14元杂芳基、C1-6烷基OR7、C1-6烷基NR5R6、C1-6烷氧基C6-14芳基、C1-6烷基CN或C1-6烷基C(O)OR7，其可以是未被取代的或被一个或多个C1-6-烷基、C6-14-芳基、羟基、C1-6-烷基卤素、C1-6烷氧基卤素、卤素、C1-6-烷氧基、C1-6烷基C6-14芳基、C(O)OR8、CN、氧代或NR9R10取代；

[0158] R2是H、C1-6-烷基、C2-6-烯基、C2-6-炔基、羟基或卤素；

[0159] R3和R4独立地是H、C1-6-烷基、C3-14-环烷基或卤素，其可以是未被取代的或被取代的。

[0160] R5、R6、R7、R8、R9和R10独立地是氢、C1-6-烷基、C2-6-烯基、C2-6-炔基、C3-14-环烷基、5-14元杂芳基、C6-14-芳基、C(O)OR11或C(O)R11，其可以是未被取代的或被取代的。

[0161] X是N或CR12，其中R11和R12独立地是H、卤素或C1-6-烷基。

[0162] 在第三通用实施方式的一个实施方式中，式III化合物其中的R1是C1-6-烷基、C3-14-环烷基、C6-14芳基、3-14元环杂烷基、C1-6烷基C6-14芳基、C1-6烷基C3-14环烷基、C1-6烷基-3-14元环杂烷基或C1-6烷基-5-14元杂芳基，其可以是未被取代的或被一个或多个C1-6-烷基、C6-14-芳基、羟基、C1-6-烷基卤素、卤素、C1-6-烷氧基、C1-6烷基C6-14芳基取代。

[0163] 式III的化合物例子包括：

[0164]

[0165] ([4-(5-异 丙 基-1H- 吡 唑 -4-基)- 嘧 啶 -2-基]-(5- 哌 嗪-1- 基- 吡啶-2-基)-胺)和

[0166]

[0167] (N*6′*-[4-(5-异丙基-3-三氟甲基-1H-吡唑-4-基)-嘧啶-2-基]-N*4*,N*4*-二甲基-3,4,5,6-四氢-2H-[1,3']联吡啶基-4,6'-胺)。

[0168] 已公开的PCT专利申请WO2009/071701从整体上以及具体地描述了式III化合物，将该专利申请完整地通过参考纳入本文。

[0169] 本发明的第四通用实施方式：

[0170] 包含细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)抑制剂的第一试剂以及mTOR抑制剂的第二试剂的组合，其中所述第一试剂是式IV的化合物：

[0171]

[0172]

[0173] 其中：

[0174] R1是C3-7烷基；被选自C1-6烷基和OH的一个取代基任选取代的C4-7环烷基；被选自C1-6烷基、C(CH3)2CN和OH的一个取代基任选取代的苯基；用一个环丙基或C1-6烷基任选取代的哌啶基；用一个环丙基或C1-6烷基任选取代的四氢吡喃基；或二环[2.2.1]庚基；

[0175] A是CH或N；

[0176] R11是氢或C1-4烷基；

[0177] L是键、C(O)或S(O)2；2Y

[0178] R 是

[0179] V是NH或CH2；

[0180] X是O或CH2；

[0181] W是O或NH；

[0182] m和n相互独立地是1、2或3，前提是m和n不同时为3；2Y

[0183] 每个R 可被一至四个取代基任选取代，所述取代基彼此独立地选自以下基团：C1-3烷基，其被一或两个取代基任选取代，所述取代基彼此独立地选自羟基、NH2和-S-C1-3烷基；CD3；卤素；氧代；C1-3卤代烷基；羟基；NH2；二甲基氨基；苄基；-C(O)-C1-3烷基，其被一或两个取代基任选取代，所述取代基彼此独立地选自NH2、-SCH3和NHC(O)CH3；-S(O)2-C1-4烷基；吡咯烷基-C(O)-；和-C(O)2-C13烷基；

[0184] R4是氢、氘或C(R5)(R6)(R7)；并且

[0185] R5、R6、R7、R8、R9和R10相互独立地是H或氘；或其药学上可接受的盐。

[0186] 在第四通用实施方式的一个实施方式中，细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)抑制剂是式IV-B所描述的化合物：

[0187]

[0188]

[0189] 其中：

[0190] L是键或C(O)；

[0191] R2Y是

[0192] V是NH或CH2；

[0193] X是O或CH2；

[0194] W是O或NH；

[0195] m和n相互独立地是1、2或3，前提是m和n不同时为3；以及5

[0196] 每个R可被一至四个取代基任选取代，所述取代基彼此独立地选自以下基团：C1-3烷基，其被一或两个取代基任选取代，所述取代基彼此独立地选自羟基、NH2和-S-C1-3烷基；CD3；C1-3卤代烷基；羟基；NH2；二甲基氨基；苄基；-C(O)-C1-3烷基，其被一或两个取代基任选取代，所述取代基彼此独立地选自NH2、-SCH3和NHC(O)CH3；-S(O)2-C1-4烷基；吡咯烷基-C(O)-；和-C(O)2-C13烷基；或其药学上可接受的盐。

[0197] 待审的PCT申请PCT/EP2011/052353从整体上及具体地描述了式IV化合物，将该专利申请完整地通过参考纳入本文。

[0198] 本发明的第五通用实施方式：

[0199] 包含细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)抑制剂的第一试剂以及mTOR抑制剂的第二试剂的组合，其中所述第一试剂是式V的化合物：

[0200]

[0201] 其中：

[0202] 虚线代表任选的键，

[0203] 每个X1、X2和X3相互独立地选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C8烷氧5 5 6 5 5 5 5 6 5 6 5 6
基、C1-C8烷氧基烷基、CN、NO2、OR、NRR、CO2R、COR、S(O)NR、CONRR、NRCOR、NRSO2R、
5 6 5 6 1 2 3
SO2NRR和P(O)(OR )(OR)；前提是X、X和X 的至少一个必须是氢；

[0204] n=0-2；

[0205] 每个R1独立地是氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6羟基烷基或C3-C7环烷基；

[0206] R2和R4独立地选自氢、卤素、C1-C8烷基、C3-C7环烷基、C1-C8烷氧基、C1-C8烷氧5 5 5 6
基烷基、C1-C8卤代烷基、C1-C8羟基烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、腈、硝基、OR 、SR、NRR、
5 6 5 6 5 6 7 8 5 4 5 7 5 6 5 6
N(O)RR、P(O)(OR)(OR)、(CRR)mNRR、COR、(CRR)mC(O)R、CO2R、CONRR、C(O)NRSO2R、
5 6 5 6 5 5 6 5 6 5 6 7 8 5 6
NRSO2R、C(O)NROR、S(O)nR、SO2NRR、P(O)(OR)(OR)、(CRR)mP(O)(OR)(OR)-、(CRR)
5 6 5 5 5 5 5 6
m-芳基、(CRR)m-杂芳基、T(CH2)mQR、-C(O)T(CH2)mQR、NRC(O)T(CH2)mQR和-CR =CRC(O)
7
R；或

[0207] R1和R2可形成含有3-7个环原子，优选5-6个环原子的碳环基团，其中至多4个环原子能够任选被独立地选自氧、硫和氮的杂原子替换，且其中碳环基团是未被取代的或被1、2或3个独立选自下列的基团取代：卤素、羟基、羟基烷基、腈、低级C1-C8烷基、低级C1-C8烷氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、烷基羰基氨基、氨基烷基、三氟甲基、N-羟基乙酰胺、三氟甲
5 6 5
基烷基、氨基、和单或二烷基氨基、(CH2)mC(O)NRR、和O(CH2)mC(O)OR，但前提是碳环中至少有一个碳原子且如果有两个或更多个环氧原子时，环氧原子彼此互不相邻；

[0208] T是O、S、NR7、N(O)R7、NR7R8W或CR7R8；

[0209] Q是O、S、NR7、N(O)R7、NR7R8W、CO2、O(CH2)m-杂芳基、O(CH2)mS(O)nR8、(CH2)-杂芳基，或含有3-7个环原子的碳环基团，所述环原子中至多4个能够任选被独立地选自氧、硫和氮的杂原子替换，但前提是碳环中至少有一个碳原子且如果有两个或更多个环氧原子时，环氧原子彼此互不相邻，其中碳环是未被取代的或被1、2或3个独立选自下列的基团取代：卤素、羟基、羟基烷基、低级烷基、低级烷氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、烷基羰基氨基、氨基烷基、三氟甲基、N-羟基乙酰胺、三氟甲基烷基、氨基和单或二烷基氨基；

[0210] W是选自氯、溴、三氟乙酸盐、和三乙基铵的阴离子；

[0211] m=0-6；

[0212] R4和X1、X2和X3之一可形成包含至多三个杂原子的芳环，所述杂原子独立选自氧、硫和氮，并任选地被至多4个独立选自下列的基团取代：卤素、羟基、羟基烷基、低级烷基、低级烷氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、烷基羰基氨基、氨基烷基、氨基烷基羰基、三氟甲基、三氟甲基烷基、三氟甲基烷基氨基烷基、氨基、单或二烷基氨基、N-羟基乙酰胺基、芳基、杂7 8 7 8 7 8 7 7 8 7
芳基、羧基烷基、腈、NRSO2R、C(O)NRR、NRC(O)R、C(O)nR、C(O)NRSO2R、(CH2)mS(O)-nR、
7 8 7 7 8 7
(CH2)m杂芳基、O(CH2)m-杂芳基、(CH2)mC(O)NRR、O(CH2)mC(O)OR、(CH2)mSO2NRR和C(O)R ；

[0213] R3是氢、芳基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、C3-C7环烷基或C3-C7-杂环基；

[0214] R5和R6独立地为氢、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、芳基烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基或杂芳基烷基；或

[0215] 当R5和R6与相同氮原子连接时，与其所连接的氮一起形成包含3-8个环原子的杂环，其中多至4个环原子可任选被独立选自氧、硫、S(O)、S(O)2和氮的杂原子替换，但前提是杂环包含至少一个碳原子且如果有两个或更多个环氧原子，环氧原子彼此互不相邻，其中杂环基团是未被取代的或被1、2或3个独立选自下列的基团取代的：卤素、羟基、羟基烷基、低级烷基、低级烷氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、烷基羰基氨基、氨基烷基、氨基烷基羰基、三氟甲基、三氟甲基烷基、三氟甲基烷基氨基烷基、氨基、腈、单或二烷基氨基、N-羟基7 8 7 8 7 8 7 7 8
乙酰胺基、芳基、杂芳基、羧基烷基、NRSO2R、C(O)NRR、NRC(O)R、C(O)OR、C(O)NRSO2R、
7 7 8 7
(CH2)mS(O)nR、(CH2)m-杂芳基、O(CH2)m-杂芳基、(CH2)mC(O)NRR、O(CH2)mC(O)OR和(CH2)
7 8
SO2NRR；

[0216] R7和R8独立地为氢、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、芳基烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基或杂芳基烷基；或

[0217] 当R7和R8与相同氮原子连接时，其与所连接的氮一起形成包含3-8个环原子的杂环，其中多至4个环原子可任选被独立选自氧、硫、S(O)、S(O)2和氮的杂原子替换，但前提是杂环包含至少一个碳原子且如果有两个或更多个环氧原子，环氧原子彼此互不相邻，其中杂环基团是未被取代的或被1、2或3个独立选自下列的基团取代的：卤素、羟基、羟基烷基、低级烷基、低级烷氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、烷基羰基氨基、氨基烷基、氨基烷基羰基、三氟甲基、三氟甲基烷基、三氟甲基烷基氨基烷基、氨基、腈、单或二烷基氨基、N-羟基乙酰胺基、芳基、杂芳基、羧基烷基；和其药学上可接受的盐、酯、酰胺和前药。

[0218] 已公开的PCT专利申请WO2003/062236从整体上及具体地描述了式V化合物，将该专利申请完整地通过参考纳入本文。

[0219] 除了第一至五通用实施方式外，本发明也涉及包含细胞周期蛋白依赖性4/6(CDK4/6)抑制剂的第一试剂和mTOR抑制剂的第二试剂的组合，其中所述第一试剂是在公开的PCT专利申请WO2010/125402中从整体上以及具体地描述的化合物(将该专利申请通过参考纳入本文)或公开的PCT专利申请WO2008/00712中从整体上及具体地描述的化
合物(将该专利申请通过参考纳入本文)。

[0220] 具体示例性的细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)抑制剂包括但不限于：

[0221] 化合物A1:7-环戊基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺，其具有如下化学结构：

[0222]

[0223] 化合物A2:7-环戊基-2-[5-(3,8-二氮杂-双环[3.2.1]辛烷-3-羰基)-吡啶-2-基氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺，其具有如下化学结构：

[0224]

[0225] 化合物A3:7-环戊基-2-[5-((1R,6S)-9-甲基-4-氧代-3,9-二氮杂-双环[4.2.1]壬-3-基)-吡啶-2-基氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺，其
具有如下化学结构：

[0226]

[0227] 化合物A4:6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮，其具有如下化学结构：

[0228]

[0229] 化合物A5:N*6′*-[4-(5-异丙基-3-三氟甲基-1H-吡 唑-4-基)-嘧啶-2-基]-N*4*,N*4*-二甲基-3,4,5,6-四氢-2H-[1,3']联吡啶基-4,6'-二胺，其具有
如下化学结构：

[0230]

[0231] 化合物A6:[4-(5-异丙基-1H-吡唑-4-基)-嘧啶-2-基]-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基)-胺，其具有如下化学结构：

[0232]

[0233] 可用于实现本发明的示例性mTOR抑制剂包括西罗莫司(雷帕霉素，AY-22989，惠氏(Wyeth))、依维莫司(RAD001，诺华(Novartis))、西罗莫司脂化物(CCI-779，惠氏)和迪弗莫司(Deferolimus)(AP-23573/MK-8669，亚力德/默克(Ariad/Merck&Co))、AP23841(亚力德)、AZD-8055(阿斯利康(AstraZeneca))、Ku-0063794(阿斯利康，库多思(AstraZeneca，Kudos))、OSI-027(OSI制药(OSIPharmaceuticals))、WYE-125132(惠氏)、佐他莫司(ABT-578)、SAR543、长川霉素、INK-128(英特力肯(Intellikine))、
XL765(赛力西斯(Exelisis))、NV-128(诺瓦基(Novogen))、WYE-125132(惠氏)、EM101/LY303511(艾米力(Emiliem))、{5-[2,4-双((S)-3-甲基-吗啉-4-基)-吡啶并[2,3-d]
嘧啶-7-基]-2-甲氧基-苯基}-甲醇)、

[0234] 化合物OSI-027(OSI)

[0235]

[0236] HTS-1(英国莱斯特大学(University of Leicester))

[0237]

[0238] 以及PP242(英特力肯)

[0239]

[0240] 上述mTOR抑制剂的每种都能够与上述细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)抑制剂的任何通用和/或具体实施方式组合使用。

[0241] 化合物B1依维莫司，化学名为((1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-羟基乙氧基)-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基}-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧杂-4-氮杂-三环[30.3.1.04,9]三十六烷-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-戊酮)。
在美国专利5,665,772的第1列第39行到第3列第11行描述了依维莫司及其同系物。依
维莫司化学结构如下：

[0242]

[0243] 化合物B2雷帕霉素，化学名为(3S,6R,7E,9R,10R,12R,14S,15E,17E,19E,21S,23S,26R,27R,34aS)-9,10,12,13,14,21,22,23,24,25,26,27,32,33,34,34a- 十 六氢-9,27-二羟基-3-[(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙
基]-10,21-二甲氧基-6,8,12,14,20,26-六甲基-23,27-环氧-3H-吡啶并[2,1-c]
[1,4]-氧杂氮杂环三十一烯-1,5,11,28,29(4H,6H,31H)-戊酮。结构如下：

[0244]

[0245] 用于本发明的其它mTOR抑制剂包括美国专利申请公开号2008/0194546和2008/0081809所 公 开 的 化 合 物,WO 06/090167；WO 06/090169；WO07/080382；WO
07/060404；WO07/061737和WO07/087395以及WO08/02316的实施例中所描述的化合物，J.Med.Chem..2009，52，5013-5016所描述的化合物。

[0246] 在另一实施方式中，本发明包括组合，其中所述第二试剂选自雷帕霉素(AY-22989)、依维莫司、CCI-779、AP-23573、MK-8669、AZD-8055、Ku-0063794、OSI-027、WYE-125132。在优选的实施方式中，第二试剂是依维莫司。

[0247] 在本发明的另一实施方式中，所述mTOR抑制剂选自雷帕霉素衍生物，如：

[0248] a．取代的雷帕霉素，如40-O-取代的雷帕霉素，如美国专利号5,258,389，WO 94/09010，WO 92/05179，美国专利号5,118,677，美国专利号5,118,678，美国专利号
5,100,883，美国专利号5,151,413，美国专利号5,120,842，WO 93/11130，WO 94/02136，WO
94/02485和WO 95/14023所述化合物；

[0249] b．16-O-取代的雷帕霉素，如WO 94/02136，WO 95/16691和WO96/41807所公开的例子；

[0250] c．32-氢化雷帕霉素，如WO 96/41807和美国专利号5256790所公开的例子；

[0251] d．WO 94/09010，WO 95/16691或WO 96/41807所公开的衍生物，更合适地，32-去氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧-32-去氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧-32(S)-二氢-雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧-32(S)-二氢-40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素，以及更优选地，WO
94/09010实施例8所公开的40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素，优选40-O-(2-羟乙基)-雷帕
霉素、40-[3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基丙酸]-雷帕霉素(也称为CCI-779)、40-表-(四
唑基)-雷帕霉素(也称作ABT578)、32-去氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧-32(S)-二氢雷
帕霉素或TAFA-93；和

[0252] e．WO 98/02441和WO 01/14387所公开的衍生物，如AP23573、AP23464或AP23841。

[0253] 在另一实施方式中，本发明包括组合，其中所述第二试剂选自AY-22989、依维莫司、CCI-779、AP-23573、MK-8669、AZD-8055、Ku-0063794、OSI-027、WYE-125132。在优选的实施方式中，第二试剂是依维莫司。

[0254] 在另一实施方式中，本发明包括治疗依赖于CDK4/6或mTOR的过度增殖疾病(优选癌症)的方法，所述方法包括向有此需要的病人施用本发明的组合。CDK4/6依赖性癌症通常特征是超磷酸化的(视网膜母细胞瘤)Rb蛋白质。如果抑制或阻断某通路会减缓或破坏癌症的生长，则该癌症依赖于所述通路。CDK4或CDK6通路依赖性癌症的例子包括乳腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、结肠癌、食道癌、脂肪肉瘤、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、T-细胞白血病、肾细胞癌、胃癌和胰腺癌。mTOR通路依赖性癌症的例子包括乳腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、套细胞淋巴瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌、胃癌、肺癌和结肠癌。本领域已建立了癌症和CDK4/6通路或mTOR癌症之间的关联性。例如，参见Shapiro,Journal
of Clinical Oncology,24卷,11期(2006)第1770-1783页，或Fasolo,Expert Opin.
Investig.Drugs 17卷，11期(2008)第1717-1734页。

[0255] 因此，在本发明的实施方式中，使用CDK4/6抑制剂和mTOR抑制剂的组合制造药物治疗癌症(其可以以组合或分离的剂型售卖)，或通过向有此需要的病人施用该组合来治疗癌症的方法。所述癌症可以是实体瘤癌症或淋巴瘤。优选癌症包括胰腺癌、乳腺癌、套细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌、黑色素瘤、结肠癌、食道癌、脂肪肉瘤、多发性骨髓瘤、T-细胞白血病、肾细胞癌、胃癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤、肝细胞癌、胃癌、肺癌或结肠癌。

[0256] 短语“药学上可接受的”指当被施用于人时，生理学可耐受的且通常不产生过敏或类似不良反应如肠胃不适、头晕等的分子实体或组合物。优选地，本文使用的术语“药学上可接受的”指被联邦或州政府管理机构批准，或美国药典或其它通常接受的药典所列的用于动物，更具体是用于人的。

[0257] 术语“载体”表示与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂和/或运载体。这类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括来自石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。优选采用水或水溶液、盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液作为载体，特别是对于注射溶液而言。合适的药用载体在E.W．Martin的《雷明登药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)中描述。

[0258] 本文所用短语“治疗有效量”指足以减轻至少约15％、优选至少50％、更优选至少90％，且最优选地防止宿主的活性、功能和应答的临床显著缺陷的量。或者，治疗有效量足以引起宿主临床显著病症/症状的改善。

[0259] “试剂”指可用于制备药物组合物和诊断性组合物的所有材料，或者所有根据本发明可被独立用于此类目的的化合物、核酸、多肽、片段、异构体、变体或其它材料。

[0260] 本文所用“类似物”指与具有本发明的所需活性和疗效(如抑制肿瘤生长)的化合物、核苷酸、蛋白质或者多肽或化合物具有相似或相同活性或功能、但无需包含与优选实施方式中的序列或结构相似或相同的序列或结构的小有机化合物、核苷酸、蛋白质或者多肽。

[0261] “衍生物”指包含母体蛋白质或多肽的氨基酸序列的化合物、蛋白质或多肽，所述序列通过引入氨基酸残基替换、删除或加入进行改变，或者通过引入核苷酸替换或删除、加入或突变修饰的核酸或核苷酸。衍生的核酸、核苷酸、蛋白质或多肽拥有与母体多肽类似或相同的功能。

[0262] 本文所用的“卤代”或“卤素”指氟、氯、溴和碘。

[0263] 本文所用的“烷基”指直链或支链饱和烃基。在一些实施方式中，所述烷基可具有1-10个碳原子(如，1-8个碳原子)。烷基的例子包括甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(如，正丙基和异丙基)、丁基(如，正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)、戊基(如，正戊基、异戊基、新戊基)、己基(如，正己基及其异构体)等。通常低级烷基至多含有4个碳原子。低级烷基的例子包括甲基、乙基、丙基(如正丙基和异丙基)和丁基(如，正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)。在一个实施方式中，一个烷基，或者两个或更多烷基可形成桥接的烷基。此时烷基横跨另一基团形成链接（尤其在环状基团中出现），形成由烷基链桥接的环，即形成桥接的稠
8
环。该情形表现为但并不限于两个或更多个R基团组成跨越Y环基团的桥接烷基从而形
成由烷基链桥接的环。

[0264] 本文所用的“烯基”指具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链烷基。在一些实施方式中，所述烯基可具有2-10个碳原子(如，2-8个碳原子)。烯基的例子包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基等。一个或多个碳-碳双键可以是内部的(如2-丁烯中的)或在末端的(如1-丁烯中的)。

[0265] 本文所用的“炔基”指具有一个或多个碳-碳三键的直链或支链烷基。在一些实施方式中，所述炔基可具有2-10个碳原子(如，2-8个碳原子)。炔基的例子包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基等。一个或多个碳-碳三键可以是内部的(如2-丁炔中的)或在末端的(如1-丁炔中的)。

[0266] 本文所用的“烷氧基”指-O-烷基。烷氧基的例子包括甲氧基、乙氧基、丙氧基(如正丙氧基和异丙氧基)、叔丁氧基等。

[0267] 本文所用的“烷硫基”指-S-烷基。烷硫基的例子包括甲硫基、乙硫基、丙硫基（例如，正丙硫基和异丙硫基）、叔丁硫基等。

[0268] 术语“烷氧羰基”指烷氧羰基，其通过羰基(C(O))与主链连接。例子包括但不限于甲氧基羰基、乙氧基羰基等。

[0269] 本文所用的“氧代”指双键氧(即=O)。还应当理解的是，术语C(O)指–C=O基团，无论它是酮、醛或酸或酸衍生物。同样，S(O)指–S=O基团。

[0270] 本文所用的“卤代烷基”指具有一个或多个卤素取代基的烷基。在一些实施方式中，所述卤代烷基可具有1-10个碳原子(如，1-8个碳原子)。卤代烷基的例子包括CF3、C2F5、CHF2、CH2F、CCl3、CHCl2、CH2Cl、C2Cl5等。全卤代烷基，即所有氢原子被卤素原子取代的烷基(如，CF3和C2F5)，包含于“卤代烷基”的定义中。例如，C1-10卤代烷基可具有式–CiH2i+1-jXj，其中X是F、Cl、Br或I，i是1-10之间的整数，且j是0-21间的整数，只要j小于或等于2i+1。

[0271] 本文所用的“环烷基”是指非芳族碳环基团，包括环化的烷基、烯基和炔基。环烷基可以是单环(如环己基)或多环(如包含稠环、桥环和/或螺环系统)，其中碳原子位于环系统的内部或外部。环烷基作为整体可包含3-14个环原子(如，对于单环环烷基有3-8个碳原子，多环环烷基有7-14个碳原子)。环烷基的任何合适的环位点可与确定的化学结构共价连接。环烷基的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环戊烯基、环己烯基、环己二烯基、环庚三烯基、降冰片基、降蒎烷基、降蒈烷基、降金刚烷基、和螺[4.5]癸基，以及它们的同系物、异构体等。

[0272] 本文所用的“杂原子”指除碳、氢之外的任何元素的原子，例如氮、氧、硫、磷和硒。

[0273] 本文所用的“环杂烷基”指非芳香族环烷基，其包含至少一个(如1、2、3、4或5)选自O、N和S的环杂原子，且任选包含一个或多个(如1、2或3)双键或三键。环杂烷基作为整体可包含3-14环原子并包含1-5个环杂原子(如，对于单环环杂烷基有3-6个环原子，多环环杂烷基有7-14个环原子)。环杂烷基可与确定的化学结构在任何杂原子或碳原子共价连接得到稳定的结构。环杂烷基环中的一个或多个N或S原子可被氧化(如，吗啉N-氧化物、硫代吗啉S-氧化物、硫代吗啉S,S-二氧化物)。环杂烷基的基团还可以包含一个或多个氧代基团，如邻苯二甲酰亚胺基、哌啶酮基、 唑烷酮基，2,4(1H，3H)-二氧代嘧啶基，吡啶-2(1H)-酮基等。环杂烷基的例子包括吗啉基、硫代吗啉基、吡喃基、咪唑烷基、咪唑啉基、 唑烷基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡咯烷基、吡咯啉基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、哌啶基、哌嗪基、氮杂环丁烷等。

[0274] 本文所用的“芳基”是指芳族的单环烃环系统或者多环环体系，所述环体系中的至少一个环是芳族的烃环，并且环体系中的任何其它芳族环只包括烃。在一些实施方式中，单环芳基可具有6-14个碳原子，多环芳基可具有8-14个碳原子。芳基可与确定的化学结构在任何碳原子共价连接得到稳定的结构。在一些实施方式中，所述芳基仅包含芳香碳环，如苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基、菲基团等。在其它实施方式中，所述芳基是多环系统，其中至少一个芳香碳环与一个或多个环烷基或环杂烷基环稠合(即共有一个键)。这样的芳基的例子包括环戊烷苯并衍生物（例如，茚满基，它是5,6-双环环烷基/芳环体系）、环己烷（即四氢萘基，其是6,6-双环环烷基/芳族环系）、咪唑啉（即苯并咪唑啉基，其是5,6-双环的环杂烷基/芳族环系）、和吡喃（即色烯基，其是6,6-双环的环杂烷基/芳族环系）。芳基的其它例子包括苯并二 烷基、苯并二 茂基、色满基、二氢吲哚基等。

[0275] 本文所用的“杂芳基”是指含有至少一个选自O、N和S的环杂原子的芳香单环环体系，或者多环环系，该多环环系中的至少一个环是芳族的且至少含有一个环杂原子。杂芳基作为整体可包含5-14个环原子，并且包含1-5个环杂原子。在一些实施方式中，所述杂芳基包括与一个或多个芳香碳环、非芳香碳环或非芳香环杂烷基环稠合的单环杂芳环。杂芳基基可与确定的化学结构在任何杂原子或碳原子处共价连接得到稳定的结构。杂芳环一般不包含O-O、S-S、或S-O键。然而，杂芳基中的一个或多个N或S原子可被氧化(如，吡啶N-氧化物、噻吩S-氧化物、噻吩S,S-二氧化物)。此类杂芳环的例子包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、异噻唑基、噻唑基、噻二唑基、异 唑基、 唑基、 二唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、2-甲基喹啉基、异喹啉基、喹喔啉、喹唑啉、苯并三唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并异 唑基、苯并 二唑基、苯并 唑基、噌啉基、1H-吲唑基、2H-吲唑基、中氮茚基、异苯酰基、萘啶基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、恶唑吡啶基、噻唑吡啶基、咪唑并吡啶基、呋喃吡啶基、噻吩并吡啶基、吡啶并嘧啶基、吡啶并吡嗪基、吡啶并哒嗪基、噻吩并噻唑基、噻吩 唑基、噻吩并咪唑基等。杂芳基另外的例子包括4,5,6,7-四氢吲哚基、四氢喹啉基、苯并噻吩并吡啶基、苯并呋喃吡啶基等。

[0276] 本发明包括所有药学上可接受的同位素标记的本发明的化合物，即式（Ⅰ）的化合物，其中一个或多个原子被具有相同原子序数但与通常在自然界中发现的原子质量或质量数不同的原子质量或质量数的原子所取代。

[0277] 适合于包含在本发明的化合物中的同位素的例子包括氢的同位素(如2H和3H)、碳11 13 14 36 18
的同位素(如 C、C和 C)、氯的同位素(如 Cl)、氟的同位素(如 F)、碘的同位素(如
123 125 13 15 15 17 18 32
I和 I)、氮的同位素(如 N和 N)、氧的同位素(如 O、O和 O)、磷的同位素(如 P)
35
和硫的同位素(如 S)。

[0278] 式(I)的某些同位素标记的化合物，例如掺入放射性同位素的化合物，可用于药3 14
物和/或底物的组织分布研究。放射性同位素氚，即 H和碳-14，即 C，由于其易于掺入且探测手段完备对该目的尤其有用。

[0279] 用较重的同位素如氘即2H进行取代，由于具有更好的代谢稳定性，可具有某些治疗优势，例如延长了体内半衰期，或降低了所需剂量，因此在某些情形中是优选的。

[0280] 用正电子发射同位素进行取代，如11C、18F、15O和13N，可用于正电子发射断层成像(Positron Emission Topography)(PET)研究用于检测底物受体占有。

[0281] 通常可通过本领域技术人员所知常规技术，或者通过与随后的实施例和制备部分所述的工艺所类似的工艺，使用合适的同位素标记试剂替代之前所用的非标记试剂来制备式(I)的同位素标记的化合物。实施例

[0282] 实施例1-3显示可用于制备7-环戊基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺(化合物A1)的一般步骤。制备本文所述CDK4/6抑制剂的其它方法可参见WO申请号PCT/EP09/060793，其公开号为WO2010/020675。

[0283] 实施例1

[0284]

[0285] 按照如下方法制备腈类似物。在搅拌的含5-溴-2-硝基吡啶(4.93g，24.3mmol)和哌嗪-1-羧酸叔丁酯(4.97g，26.7mmol)的CH3CN(60ml)溶液中加入DIPEA(4.65mL，26.7mmol)。回流加热混合物72小时，然后冷却至室温，过滤收集沉淀产物。将滤液浓缩，并用闪蒸柱色谱纯化，用30％EtOAc/汽油洗脱。从EtOAc/汽油中重结晶合并的产物，
得到4-(6-硝基-吡啶-3-基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯，(4.50g，80%产率)。MS(ESI)m/z
308(M+H)+

[0286] 实施例2

[0287] 将5-[4-(2,2,2-三氟-乙基)-哌嗪-1-基]-吡啶-2-基胺(158mg，0.607mmol)、2-氯-7-环戊基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺(118mg，0.405mmol)、
Pd2(dba)3(18.5mg，0.020mmol)、BINAP(25mg，0.040mmol)和叔丁醇钠(70mg，0.728mmol)在二 烷(3.5mL)中的混合物脱气，并用CEM Discover微波炉加热至100°C保持1h。将
反应混合物在二氯甲烷和饱和NaHCO3溶液之间萃取。将有机层分离，进一步用二氯甲烷抽提水层。将合并的有机相用盐水洗涤，干燥（MgSO4），过滤并浓缩。使用硅胶色谱(0-10%甲醇/氯甲烷)纯化粗产物，得到7-环戊基-2-{5-[4-(2,2,2-三氟-乙基)-哌嗪-1-基]-吡
啶-2-基氨基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺，通过乙腈(115mg，55%)研
磨将其进一步纯化。MS(ESI)m/z 517.2(M+H)+(方法A)。

[0288] 1H NMR(400MHz，Me-d3-OD)：8.72(1H，s)，8.24(1H，d)，7.98(1H，d)，7.50(1H，dd)，6.62(1H，s)，4.81-4.72(1H，m)，3.27-3.09(12H，m)，2.89(4H，t)，2.61-2.49(2H，m)，2.16-2.01(4H，m)，1.81-1.69(2H，m)。

[0289] 实施例3

[0290] 7-环戊基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺

[0291]

[0292] 遵照实施例2中的布赫瓦尔德法，然后实施例1中的一般步骤，2-氯-7-环戊基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺(300mg，1.02mmol)和5-哌嗪-1-基-吡
啶-2-基胺(314mg，1.13mmol)得到7-环戊基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-7H-吡
+
咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲基酰胺(142mg，36%)。MS(ESI)m/z435.3(M+H)

[0293] 实施例4

[0294] Cell Titer-Glo发 光 细 胞 存 活实 验 (Cell Titer-Glo Luminscent Cell Viability Assay)(普洛麦格(Promega)#G7572)基于对ATP的定量，产生与反应中存在的具有代谢活性的活细胞数成正比的发光信号。将Cell Titer-Glo缓冲液小瓶在37℃水浴以中融化以准备Cell Titer-Glo试剂。然后将整瓶缓冲液加入试剂盒中所提供的冻干Cell Titer-Glo底物的瓶中。将冻干底物溶解，倒置混合溶液，即可使用。将Jeko-1细胞稀释为200,000个细胞/mL，并培养于T250瓶中。处理前(时间0)，取出3×100微升等份，并放置于透明底的黑色96孔板中(柯斯达(Costar)#3904)。每孔中加入50μL CTG试剂。将板
放置于水平振荡器上，避光在室温下使用设定值4孵育30分钟。然后用Envision光度计读板，输出结果。T250瓶中剩余的细胞未进行处理或者用单一试剂处理或联合处理。使用的CDK4/6抑制剂的浓度为100nM，使用的mTOR抑制剂的浓度为1、2.5和5nM。将板在37℃和5%CO2中孵育72小时。72小时后，取出3×100μL等份，并如上所示进行CTG。输出结
果，并用微软Excel分析。使用下列公式计算与对照生长相比较存活细胞的百分数：

[0295] 若A>B，则100×((A-B)/(C-B))，若否，则100×(A-B/B)

[0296] 式中：

[0297] A是处理条件下CTG读值

[0298] B是时间0时细胞的CTG读值

[0299] C是72小时未处理细胞的CTG读值

[0300] 实施例5

[0301] 为了评价CDK4/6和mTOR抑制剂的组合与单个试剂观察到的生长抑制相比是否引起更明显的生长抑制，用100nM CDK4/6抑制剂，1、2.5和5nMmTOR抑制剂及其组合处理Jeko-1套细胞淋巴瘤细胞，如图1所示。使用实施例4中的Cell Titer-Glo试剂盒测量生长抑制。获得与运载体对照相比的经处理的细胞的%生长。如图1所示，用100nM CDK4/6抑制剂处理细胞，与运载体对照相比，引起70%细胞生长，而仅用mTOR抑制剂进行的处理在所测试的所有三个浓度下均引起约30%生长。值得注意的是，CDK4/6和mTOR抑制剂的组合在所有测试的组合中均引起明显得多的细胞生长抑制。例如，100nM/5nM CDK4/6和mTOR抑制剂的组合观察到少于10%细胞生长。这表明当相对于每个化合物的单个试剂活性进行评价时，CDK4/6和mTOR抑制剂的组合引起更高数量的细胞生长抑制。

[0302] 实施例6

[0303] 为了确定CDK4/6和mTOR抑制剂的组合是否引起协同生长抑制，我们生成了等效图，我们将组合使用时的生长抑制值与基于加成所预测的25、50和75%生长抑制进行比较(Tallarida RJ，使用等效图进行药物组合分析的综述(An overview of drug combination analysis with isobolograms)，Journal of Pharmacology and ExperimentalTherapeutics，319(1):1-7)。简而言之，确定CDK4/6和mTOR抑制剂作为单个试剂时产生范围为0-100%的生长抑制值的9个滴定浓度点(包括0nM)。在96孔板中，每个试剂的9
个浓度点以矩阵形式混合，产生81种组合。将这块板用于处理Jeko-1细胞，并将得到的生长抑制值用于产生单个试剂和组合的IC50值。使用Y轴显示CDK4/6抑制剂浓度，X轴显示mTOR抑制剂浓度来作图。连接CDK4/6抑制剂和mTOR抑制剂IC50值的直线代表对于组合
而言严格加成的生长抑制。加成直线下方的点(更多生长抑制)代表协同的生长抑制，而加成直线上方的点(更少生长抑制)代表拮抗的生长抑制。

[0304] 实施例7

[0305] 为了评价CDK4/6和mTOR抑制剂的组合造成的细胞生长抑制是否协同，我们在Jeko-1细胞中测量了单个试剂和组合的活性，并根据实施例6准备的等效图分析对其进行分析。简而言之，测定CDK4/6和mTOR抑制剂的单个试剂活性以确定每一药物得到0-100%生长抑制的9个滴定浓度点。以矩阵的格式将每个抑制剂的9个浓度点的所有可能的组合共同施用至Jeko-1细胞，并记录观察到的生长抑制。计算各化合物及组合引起50%生长抑制的浓度，并用其产生如图2所示的图。X和Y轴分别代表mTOR和CDK4/6抑制剂浓度。线
1表示当考虑50%生长抑制时，基于加成预测的生长抑制。线2根据观察到的产生50%生
长抑制的组合的浓度产生的图，其明显位于加成线之下，表明生长抑制的强烈协同作用。总之，CDK4/6和mTOR抑制剂的组合以协同方式抑制Jeko-1套细胞淋巴瘤细胞的生长。

[0306] 实施例8

[0307] 使用如上述实施例7所述的等效图分析法对CDK4/6和mTOR抑制剂的组合对乳腺癌细胞系MDA-MB453的协同效应进行分析。同样根据实施例7，CDK4/6和mTOR抑制剂的组合以协同方式抑制MDA-MB453乳腺癌细胞的生长。

[0308] 实施例9

[0309] 使用Jeko-1异种抑制物模型测定使用化合物A1、化合物B1以及化合物A1和B1的组合进行35天治疗的抗肿瘤活性。观察到显著的抗肿瘤活性。当停止给药后，允许肿瘤再生长，化合物A1和B1的组合显著地使肿瘤生长延迟20天。在这个模型中，化合物A1和化合物B1都有抗肿瘤活性。然而，当治疗停止后，化合物A1和B1的组合显著延长了肿瘤生长的延滞期。参见图4。

[0310] 实施例10

[0311] 用于移植的PANC-1胰腺癌在裸小鼠中通过连续植入进行保种。在每一受试动3
物的右腋皮下植入1mm片段以开始肿瘤生长。每周监测肿瘤两次，当其平均体积接近
3
100-150mm时每天监测。肿瘤细胞植入22天后，在研究的D1，将动物分成四组，每组十只
3 3
小鼠，个体肿瘤大小在108-221mm，组平均肿瘤大小为150-153mm。如下计算肿瘤大小，以
3
mm表示：

[0312] 肿瘤体积=(w2×l)/2

[0313] 其中w= 瘤宽，l= 瘤长，以mm计。肿瘤的重量可通过假设1mm3肿瘤体积重1mg来进行估算。

[0314] 组1小鼠接受化合物A1和化合物B1的运载体，作为所有分析的对照。组2和3接受化合物A 1250mg/kg，每日一次，口服，×21天，或化合物B110mg/kg，每日一次，口服，×21天的单一疗法。组4接受化合物A1和化合物B1的联合治疗。

[0315] 当肿瘤体积达到1200mm3时将每个动物安乐死，或者在研究的最后一天(D55)安乐死。对于肿瘤到达终点体积的每只动物，按照如下公式计算到达终点的时间(TTE)：

[0316] TTE=(log10(终点体积)-b)/m

[0317] 其中TTE以天表示，终点体积以mm3表示，b是截距，m是通过对数转换肿瘤生长数据集合的线性回归得到的直线的斜率。数据集合包含超过实验终点体积的第一次观察，以及达到终点体积之前的连续三次观察。计算的TTE通常小于动物因肿瘤大小被安乐死时的天数。肿瘤未达到终点的动物的TTE被指定为最后一天。归类为TR致死或非治疗相关转移(NTRm)致死的动物的TTE被指定为死亡日。归类为NTR致死的动物不参与TTE计算。

[0318] 从肿瘤生长延迟(TGD)确定疗效，其被定义为与对照组相比，治疗组的中值TTE的增加：TGD=T-C，以天表示，或表示为对照组中值TTE的百分比：%TGD=[(T-C)/C]×100，其中：T= 治疗组的中值TTE，C= 指定对照组的中值TTE。

[0319] 这些研究表明在PANC-1异种移植物的模型中，化合物A1和化合物B1均没有显著的抗肿瘤活性。然而，化合物A1和B1的组合导致肿瘤停滞(图5A)，并且显著延迟肿瘤生长18天。

[0320] 实施例11

[0321] 使用CHALICE软件，通过由应答矩阵的观察值和Loewe模型值之间的差异计算得到的协同评分，评价CDK4/6和mTOR抑制剂的组合相对于Loewe加成模型的潜在协同相互作用。简而言之，使用9个滴定浓度，CDK4/6抑制剂从10μM进行三倍梯度稀释，mTOR抑制剂从0.1μM进行三倍梯度稀释，包括0μM。在96孔板中，将各试剂的9个浓度点以矩阵形式混合，产生81种组合。使用该板处理Jeko-1细胞，所得抑制值经由CHALICE软件处理以产生抑制和ADD超量抑制矩阵，以及等效图。该技术和计算的更详细诠释参见Lehar等，“协同药物组合提高治疗选择性”(Synergistic drug combinations improve therapeutic selectivity),Nat.Biotechnol.2009,7月;27(7),659-666,将该文献通过参考纳入本文。

[0322] 抑制矩阵显示了在化合物的各浓度通过CTG实验观察到的真实抑制。ADD超量抑制则显示了超过Loewe加成模型所预测的抑制的更多抑制。除了矩阵，可用等效图观察协同。人工选择每个等效图的抑制水平以观察最佳协同效应。用Y轴显示CDK4/6抑制剂浓度，X轴显示mTOR抑制剂浓度产生等效图。连接CDK4/6抑制剂和mTOR抑制剂产生所选抑制水平的浓度的直线代表对于组合而言的严格加成的生长抑制。加成直线下方的点(更多生长抑制)代表协同生长抑制，而加成直线上方的点(更少生长抑制)代表拮抗生长抑制。

[0323] 研究下列CDK4/6抑制剂和mTOR抑制剂的组合对之间的协同相互作用，协同评分以及对应的图示如下表所列：

[0324]