肿柄菊内酯A及其衍生物治疗代谢疾病的用途

摘要

本发明关于一种肿柄菊内酯A及其衍生物的新用途，萃取自五爪金英，而用于治疗代谢疾病的应用。本发明中，该肿柄菊内酯A及其衍生物可应用于治疗糖尿病、降血糖以及降胆固醇，并可应用于制备治疗糖尿病、降血糖以及降胆固醇的医药组合物。

权利要求

1.一种式I化合物用于制备治疗代谢疾病的药物的用途：其中，A、B分别为单键或双键；R1、R2、R3分别为氢基、氢氧基或甲氧基；

该代谢疾病为糖尿病、高胆固醇症、或糖尿病患者的肾衰竭与性功能障碍。

2.如权利要求1所述的用途，其中该式I化合物为式II化合物：

3.如权利要求1所述的用途，其中式I化合物为式III化合物：

4.如权利要求2或3所述的用途，其中该式II或式III化合物由五爪金英以水或有机溶剂萃取而得，其中该有机溶剂选自由醇类、酯类、烷类以及卤烷所组成的群组。

5.如权利要求1～3项中任一项所述的用途，其中该式I化合物作为PPARα的促效剂以达到降胆固醇的效果。

6.如权利要求1～3项中任一项所述的用途，其中该式I化合物是作为PPARγ的促效剂以达到治疗糖尿病的效果。

7.如权利要求1～3项中任一项所述的用途，其中该式I化合物作为LXRs的促效剂以达到降血糖、降胆固醇的效果。

8.如权利要求1～3项中任一项所述的用途，其中该式I化合物作为FXR的促效剂以达到治疗糖尿病、降胆固醇、改善糖尿病患者的肾衰竭与性功能障碍的效果。

9.如权利要求1所述的用途，其中当A为单键且B为双键时，或当A、B为双键时，该式I化合物可经由氢化反应后具有治疗糖尿病及高胆固醇症的用途。

说明书

肿柄菊内酯A及其衍生物治疗代谢疾病的用途

技术领域

[0001] 本发明是为一种肿柄菊内酯A及其衍生物的用途，尤其是一种肿柄菊内酯A及其衍生物用于治疗代谢疾病的用途。

背景技术

[0002] 五爪金英(Tithonia diversifolia)，为菊科王爷葵属的多年生草本植物，别名王爷葵、太阳花、小向日葵等。原生于墨西哥，现可见于亚洲、非洲、美洲与澳洲。在台湾，每年从11月开始，平地至低海拔山区的路旁或荒废地、斜坡上、高速公路斜坡，很容易看到这种硕大的金黄色菊花。另外，五爪金英有清热解毒、消肿止痛、消暑利尿的功用，其全草味道极苦，也是市售苦茶的重要组成原料之一，亦经初步证实有抗癌作用，特别是黑色素癌、皮肤癌等。

[0003] 糖尿病是一种因体内胰岛素绝对或者相对不足所导致的一系列临床综合症。糖尿病的主要临床表现为多饮、多尿、多食和体重下降（「三多一少」），以及血糖高、尿液中含有葡萄糖（正常的尿液中不应含有葡萄糖）等。如果糖尿病没有得到足够的控制，可以引起一些急性并发症，如低血糖症（hypoglycemia）、酮酸中毒（ketoacidosis,DKA）、非酮高渗性昏迷（nonketotic hyperosmolar coma）。严重的长期并发症包括：心血管疾病、慢性肾衰竭（又称糖尿病肾病，是发展中国家成年人中血液透析的主要原因）、视网膜病变（又称糖尿病眼病，可致盲，是发展中国家非老龄成年人致盲的主要疾病）、神经病变及微血管病变。其中，微血管病变可能导致勃起功能障碍（阳痿）以及伤口难以愈合。而足部难以愈合的伤口则可能导致坏疽（俗称「糖尿病足」），进而导致患者截肢。

[0004] 高胆固醇症即为血液中胆固醇含量过高，容易造成动脉粥样硬化以及引发冠状动脉性心脏病。

[0005] 高血糖与高血脂则是俗称的「三高」的其中两种，高血脂症可表现为高胆固醇症、高三酸甘油脂症或两者兼有。随着台湾地区经济的快速发展、民众生 活方式日趋静态以及西化的饮食模式与老化的人口，罹患心血管疾病的机会大幅增加，且根据卫生署的统计，国人十大死亡原因中与代谢症候群﹝指腹部肥胖、血压高、血脂高、血糖高的一种综合现象﹞相关的死亡率高达35.7％，其中「三高」则是主要的危险因子，会导致全身性血管的硬化与阻塞，造成许多的并发症，如冠状动脉疾病（严重者导致心肌梗塞）、脑血管疾病（严重者导致中风）、周边动脉疾病（严重者导致截肢）、肾脏病变（严重者导致洗肾）、眼睛病变（严重者导致失明）、以及各种一般人难以想象的问题，造成病患的失能与残障，也造成家庭及社会的沉重负担。另有调查指出，国内逾六成中老年人罹患「三高」，也就是说现在40岁以上的成年人，有半数以上饱受高血糖症、高血压及高血脂症所苦，俨然已成为现代人的健康隐忧。

[0006] 核受体(nuclear receptor)是细胞内转录因子的一类。核受体超家族（superfamily）的成员在细胞生长、发育、分化与新陈代谢均有重要的作用。由于核受体皆位于细胞内部，因此它们的激素(Hormone)均为脂溶性，这样激素才能穿越由脂肪构成的细胞膜进入细胞。对核受体的研究始于20世纪70年代，70年代末期第一批核受体被萃取、分离出来。核受体与激素结合后被活化，活化后的核受体复合物负责引导靶基因启动子的转录。

[0007] 以下所述核受体家族（nuclear receptor family）成员都是可被小分子受质或促效剂(agonists)活化的转录因子，当促效剂与核受体结合，将改变目标基因的转录的能力，而此改变包含调控部份目标基因的上游因子（如核受体反应调控子nuclear receptor response element），此机制称为「转录活化」，可产生调节糖尿病、降血糖及降胆固醇的效果。

[0008] 过氧化小体增殖活化受体（PPAR）是核受体超家族的成员，有三种亚型，分别是α、β/δ和γ，分别由不同的基因编码，并于人类中确认。最初，PPARs在调控脂质代谢和血糖的动态平衡被证明发挥重要作用。目前，PPARα促效剂如fibrates是治疗动脉粥样硬化，因其可降低胆固醇的性质。PPARγ促效剂如噻唑烷二酮类(thiazolidinediones)，用于抗糖尿病治疗，因其药理作用可改善糖尿病患者的胰岛素抗性情况。临床上PPARγ促效剂常用者为曲格列酮(troglitazone,商品名：rezulin)、罗格列酮(rosiglitazone,商品名：avandia)、皮利酮(pioglitazone,商品名：actos)等；不过，值得注意的是曲格列酮(troglitazone) 曾引起致命的肝毒性，因此，在英国上市(1997年10月)后二个月就被禁止使用。此外，噻唑烷二酮类衍生物也遭美国下令全面回收及禁用。由于PPARγ促效剂的不良心血管副作用，制药公司开始于治疗糖尿病的临床试验发展PPARαγ双重促效剂。

[0009] 肝脏X受体(LXR)也为核受体超家族(superfamily)的一成员，该超家族作为配体活性化转录因子并具有与PPARs相似的分子机制。直至现在，LXR有两种亚型分别为LXRα与LXRβ，在肝脏、肠、肾上腺、中枢神经系统及肾脏的表现中鉴定出来。LXR已知作用为胆固醇(cholesterol)与葡萄糖的感测器，所以LXR的功用主要是调控胆固醇与葡萄糖的代谢，在降血糖作用方面因LXRs调节葡萄糖代谢中许多基因如磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)以及葡萄醣激酶，显示LXRs亦参与葡萄糖代谢调节。除了糖质新生途径中的作用外，LXRs亦显示在糖尿病小鼠中引起脂肪组织中GLUT4(Glucose transporter type 4)的表现，可促进葡萄糖分配使用并改善胰岛素阻抗。LXRs可经由向下调节PEPCK、G-6-Pase以及GLUT4以降低葡萄糖浓度，亦可经由向上调节ABCA1、PLTP与LDLR基因使胆固醇降低。

[0010] 胆酸接受器(FXR,NR1H4)于1995年确认为核受体超家族的一成员。胆酸包括鹅去氧胆酸(chenodeoxychoilc acid,CDCA)、CA(cholic acid)以及DCA(deoxycholic acid)于先前文献中证实为FXR内源性配体，其中CDCA为人体内自己所合成的胆酸分子及FXR的天然活化剂。FXR于人体中有多种功能，且该些功能主要经由与视黄醇X接受器(retinoid x receptor,RXR)异二聚体以调节许多必要基因的转录参与于胆酸机制包括微异二聚体伙伴蛋白质(small heterodimer partner,SHP)、CYP7A1(Cholesterol 7alpha-hydroxylase)以及胆盐输出帮浦(BSEP)中。因这些基因经由FXR调节，故参与胆酸相关疾病作用，FXR调节因子被视为具有胆酸及高胆固醇症的治疗潜力，该些疾病包括心血管以及脂质代谢疾病。另外，因FXR可向下调节PEPCK与G-6-Pase，因而降低血糖浓度。此外FXR调节因子对于改善糖尿病病人的肾衰竭与性功能障碍也有相当地助益。

[0011] 如前所述，五爪金英为常见的植物，且PPAR、LXR与FXR为对调节体 内葡萄糖及胆固醇有效的核受体，故若能自五爪金英中找到化合物能作为该三个核受体的促效剂，对于糖尿病及高血糖症、高胆固醇症的患者实为一大福音。

发明内容

[0012] 鉴于上述原因，本发明提供一种肿柄菊内酯A用于制备治疗代谢疾病的药物的用途，其中该肿柄菊内酯A为式I化合物，该代谢疾病为糖尿病、高血糖症或高胆固醇症：

[0013]

[0014] 其中，A、B分别为单键或双键；R1、R2、R3分别为氢基(H)、氢氧基(OH)或甲氧基(OCH3)。

[0015] 本发明中的式I化合物由五爪金英以有机溶剂萃取或水萃取，有机溶剂可包括醇类，例如甲醇、乙醇或丙醇、酯类，例如乙酸乙酯、烷类例如己烷、或卤烷例如氯甲烷、氯乙烷，但并不以此为限，其中较佳者为醇类，更佳者为乙醇，且式I化合物作为PPARα、PPARγ、LXRs与FXR的促效剂，达到调节糖尿病、降血糖以及降胆固醇的效果。

[0016] 借由前述化合物，本发明将其应用于调节糖尿病、降血糖以及降胆固醇上，使能进一步用于治疗糖尿病、降血糖以及降胆固醇的医药组成份中，增益治疗效果。

[0017] 另一方面，本发明亦可将式I化合物利用于治疗糖尿病、高血糖症、高胆固醇症等医药组成物的成分中，藉以调整血中葡萄糖及胆固醇。前述医药组成物除包括有效剂量的式I化合物外，尚可包括药学上可接受的载体。载体可为赋形剂（如水）、填充剂（如蔗糖或淀粉）、黏合剂（如纤维素衍生物）、稀释 剂、崩解剂、吸收促进剂或甜味剂，但并未仅限于此。本发明医药组成物可依一般习知药学的制备方法生产制造，将式I化合物有效成分剂量与一种以上的载体相混合，制备出所需的剂型，此剂型可包括锭剂、粉剂、粒剂、胶囊或其他液体制剂，但未以此为限。

[0018] 以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求所界定者为准。

附图说明

[0019] 图1为1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A于PPAR α依赖性SULT2A1基因启动子转录活化活性的检测结果(以T代表1-去羟基肿柄菊内酯A，TA代表肿柄菊内酯A)。

[0020] 图2为1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A于转录活化PPARγ依赖性PPRE启动子上的的活性检测结果(以T代表1-去羟基肿柄菊内酯A，TA代表肿柄菊内酯A)。

[0021] 图3为1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A于转录活化PPARγ依赖性ABCA1基因启动子活性上的检测结果(以T代表1-去羟基肿柄菊内酯A，TA代表肿柄菊内酯A)。

[0022] 图4为1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A于转录活化LXRα依赖性ABCA1基因启动子活性上的检测结果(以T代表1-去羟基肿柄菊内酯A，TA代表肿柄菊内酯A)。

[0023] 图5为1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A于转录活化LXRβ依赖性ABCA1基因启动子活性上的检测结果(以T代表1-去羟基肿柄菊内酯A，TA代表肿柄菊内酯A)。

[0024] 图6为1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A在转录活化PPARγ依赖性SHP基因启动子活性上的检测结果(以T代表1-去羟基肿柄菊内酯A，TA代表肿柄菊内酯A)。

[0025] 图7为1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A在转录活化FXR依赖性SHP基因启动子活性上的检测结果(以T代表1-去羟基肿柄菊内酯A，TA代表 肿柄菊内酯A)。

[0026] 图8为1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A于转录活化LXRα依赖性大鼠CYP7A1基因启动子活性的检测结果(以T代表1-去羟基肿柄菊内酯A，TA代表肿柄菊内酯A)。

[0027] 图9为1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A于转录活化LXRα依赖性大鼠PEPCK基因启动子活性的检测结果(以T代表1-去羟基肿柄菊内酯A，TA代表肿柄菊内酯A)。

具体实施方式

[0028] 定义：

[0029] 本发明说明书中所使用的「降胆固醇」一词，如未特别注明则指降低低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)或提升高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL)。

[0030] 以下将分为实施例1~7说明，实施例1为自五爪金英分离出1-去羟基肿柄菊内酯A(1-dehydroxytagitinin A；tirotundin)和肿柄菊内酯A(tagitinin A)的方法，为验证自实施例1分离出的二化合物是否对调节糖尿病、降血糖及降胆固醇为有效，于实施例2说明细胞培养、短暂转染报告子与细胞活力测定的方法，并于实施例3-7以多种启动子验证二化合物的转录活性，证实肿柄菊内酯A与1-去羟基肿柄菊内酯A有调节糖尿病、降血糖及降胆固醇的功效。

[0031] 实施例1：

[0032] 自五爪金英分离出1-去羟基肿柄菊内酯A与肿柄菊内酯A

[0033] 取五爪金英干燥粉末10公斤，以水萃取或有机溶剂萃取，有机溶剂可包括醇类(例如甲醇、乙醇或丙醇)、酯类(例如乙酸乙酯)、烷类(例如己烷)或卤烷(例如氯甲烷、氯乙烷)，但并不以此为限，其中较佳者为醇类，更佳者为乙醇。萃取物以真空浓缩得到粗萃取油(12公克)并进而以氧化硅管柱(70-230目)层析，利用正己烷-乙酸乙酯梯度作为洗提液，根据极性分离出10个次分液。第4次分层(正己烷-乙酸乙酯为3:2)再以氧化硅管柱(230-400目)层析，接着以薄层层析得到10毫克的无色结晶，以NMR光谱资料与先前文献的数值验证比对，所得为1-去羟基肿柄菊内酯A(1-dehydroxytagitinin A；tirotundin)，分子式为 C19H28O6，分子量为352，结构式如式II所示。

[0034] 式II

[0035] 式II化合物的NMR碳谱(NMR C13 spectrum)如下所示，式中黑色数值为实验值，括弧内数值为参考值；参考值取自Herz W.,Sharma R.P.J.Org.Chem.,1975,40,3118。

[0036]

[0037] 式II化合物的NMR氢谱(NMR proton spectrum)如下所示，式中黑色数值为实验值，括弧内数值为参考值；参考值取自Herz W.,Sharma R.P.J.Org.Chem.,1975,40,3118。

[0038]

[0039] 自上述的根据极性分离出的10个次分液中，第7次分液(正己烷-乙酸乙酯为3:7)以氧化硅管柱(70-230目)利用正己烷-乙酸乙酯梯度作为洗提液层析， 得到12毫克的白色固体，以NMR光谱资料与先前文献的数值验证比对，所得为肿柄菊内酯A(TagitininA)，分子式为C19H28O7，分子量为368，结构式如式III所示。

[0040]

[0041] 式III化合物的NMR碳谱(NMR C13spectrum)如下所示，式中黑色数值为实验值，括弧内数值为参考值；参考值取自Barua N.C.,Sharma R.P.,Madhusudanan K.P.,Thyagaraian G.,Herz W.,Murari R.J.Org.Chem.,1979,44,1831。

[0042]

[0043] 式III化合物的NMR氢谱(NMR proton spectrum)如下所示，式中黑色数值为实验值，括弧内数值为参考值；参考值取自Barua N.C.,Sharma R.P.,Madhusudanan K.P.,Thyagaraian G.,Herz W.,Murari R.J.Org.Chem.,1979,44,1831。

[0044]

[0045] 实施例2：

[0046] 细胞培养、短暂转染报告子(transient transfection reporter)与细胞活性测定分析

[0047] 人类肝癌细胞株HepG2，购自ATCC（维吉尼亚州）。这些细胞依常规培养成单层细胞于Dulbecco调整的最小基本培养基含10％胎牛血清（Hyclone公司），盘尼西林（100单位/毫升）/链霉素（100微克/毫升）（购自GIBCO/BRL公司），并于5%CO2/空气饱和湿度中以37℃培养。为进行短暂转染报告分析，HepG2细胞接种于一式三份在48孔盘，细胞密度为1x105细胞/孔于无酚红的DMEM含10％活性炭处理胎牛血清，盘尼西林（100单位/毫升）/链霉素（100微克/毫升）。24小时后，使用Superfect转染试剂盒转染三个质体至HepG2细胞（Qiagen公司）。以下为检测待测化合物对于PPARα、PPARγ、LXRs与FXR活性的促效性，分成三种的表现质体转染至细胞：

[0048] 检测本发明的式II与式III化合物对PPARα活性的促效性，细胞被转染2微克的野生型PPARα的表达质体（pCMVPPARα，Panomics公司），以及6微克的萤光酶报告质体包含PPARα的反应组成，pSULT2A1-luc，及1微克normalization control，β-半乳糖苷酶报告质体（pCMV-β，Clontech公司）。SULT2A1-luc质体构筑方法依照 Fang H.L.,Strom S.C.,Cai H.,Falany C.N.,Kocarek T.A.,Runge-Morris M.Mol.Pharmacol.,2005,67,1257。

[0049] 检测本发明的式II与式III化合物对PPARγ活性的促效性，以验证式II与式III化合物是否有治疗糖尿病的功效。细胞被转染2微克的野生型PPARγ的表现质体（pCMV-PPARγ，Panomics公司），以及6微克的萤光酶报告质体包含PPARγ的反应调控子(response element)，该PPARγ的反应调控子包括 pPPRE-luc(Panomics公司),pABCA1-luc或pSHP-luc、1微克正规化控制(normalization control)、β-半乳糖苷酶报告质体（pCMV-β，Clontech公司）。PPRE序列对于PPAR-RXR异二聚体具有专一性，故若PPAR-RXR异二聚体与PPRE序列结合，将启动转录作用。ABCA1-luc质体构筑方法依照PullingerC.R.,Hakamata H.,Duchateau P.N.,Eng C.,Aouizerat B.E.,Cho M.H.,FieldingC.J.,Kane J.P.Biochem.Biophys.Res.Commun.,2000,271,451；SHP-luc质体构筑方法依照Lin H.R.,Abraham D.J.Bioorg.Med.Chem.Lett.2006,16,4178。

[0050] 检测本发明的式II与式III化合物对LXRs活性的促效性，以验证式II与式III化合物是否有降低血糖浓度的功效，细胞被转染2微克野生型LXRα或β表现质体(pCMV-LXRα或pCMV-LXRβ，GeneCopoeia公司)，以及6微克包含LXR反应调控子(response element)的萤光酶报告质体，该LXR反应元包括prCYP7A1-luc、pPEPCK-luc或pABCA1-luc与1微克正规化控制(normalization control)、β-半乳糖苷酶报告质体(pCMV-β，Clontech公司)。rCYP7A1-luc质体构筑方法依照Chen W.,Owsley E.,Yang Y.,Stroup D.,ChiangJ.Y.J.Lipid Res.,2001,42,1402；PEPCK-luc 质 体 构筑方 法 依照 Wang X.L.,Herzog B.,Waltner-Law M.,Hall R.K.,Shiota M.,Granner D.K.J.Biol.Chem.,2004,279,34191；ABCA1-luc 质 体 构 筑 方 法 依 照 Pullinger C.R.,HakamataH.,Duchateau P.N.,Eng C.,Aouizerat B.E.,Cho M.H.,Fielding C.J.,Kane J.P.Biochem.Biophys.Res.Commun.,2000,271,451。

[0051] 检测本发明的式II与式III化合物对FXR活性的促效性，以验证式II与式III化合物是否有降低胆固醇的功效，将细胞以2微克野生型FXR表现质体(pCMV-FXR，GeneCopoeia公司)，以及6微克包含FXR反应元(response element)、pSHP-luc及1微克正规化控制、β-半乳糖苷酶报告质体(pCMV-β，Clontech公司)的萤光酶报告质体。SHP-luc质体构筑方法依照Lin H.R.,Abraham D.J.Bioorg.Med.Chem.Lett.2006,16,4178。

[0052] 转染后，HepG2细胞分别用不同浓度的式II与式III化合物和一个阳性对照组载体（二甲基亚飒DMSO）的无酚红培养基处理。进一步培养24小时后，细胞用PBS洗涤后用裂解液溶解而产生细胞溶解液。该细胞溶解液进一步被用于确定PPARs、LXRs或FXR的转录活性和β-半乳糖苷酶的转染率的正规 化。对于萤光酶活性测定，20微升的细胞溶解液和100微升的萤光酶检测缓冲液（Promega公司）加入96孔盘的一个孔洞内。用发光酶标仪(Synergy 2)检测萤光。对β-半乳糖苷酶活性测定，20微升的裂解液和180微升的β-半乳糖苷酶分析缓冲液（Clontech公司）加入96孔盘的一个孔洞内。利用Synergy2测定β-半乳糖苷酶活性的发光强度。借由公式计算正规化萤光酶的活性，正规化萤光酶的活性=萤光酶活性/β-半乳糖苷酶活性。对于式II与式III化合物的促效效果，借由使用载体（DMSO）为标准值作为1，正规化的萤光酶活性值进一步转化为相对的正规化萤光酶活性。每个化合物的实验至少经双重复或三重复试验。

[0053] 实施例3：

[0054] 1-去羟基肿柄菊内酯A(T:tirotundin)和肿柄菊内酯A(TA:tagitinin A)于PPARα依赖性SULT2A1基因启动子转录活化活性的效果

[0055] 人类羟基类固醇硫酸基转移酶（SULT2A1）在肝胆固醇平衡中扮演一重要的作用，借由催化前致癌物外生性物质、羟基类固醇及胆酸的磺化。SULT2A1酶主要表现在肝脏，但也表现在其他代谢活性的组织，例如肠和肾上腺。经由一PPRE区域（aggtg AAAGgtaa）位于人类SULT2A1基因的5侧翼区远端部分（-5949至-5929），PPARα已显示活化人类SULT2A1基因的转录。为评估1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A对于PPARα的促效活性，便使用HepG2细胞进行短暂转染报告分析。结果如图1所表示，对于PPARα依赖性SULT2A1基因启动子，1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A表现相似转录活化活性，且于10μM时，此两个化合物具有2.3倍的载体活性。在100nM，这两个化合物仍然有1.3倍载体活性。

[0056] 实施例4：

[0057] 1-去羟基肿柄菊内酯A(T:tirotundin)和肿柄菊内酯A(TA:tagitinin A)于(transactivation)PPARγ依赖性PPRE启动子上的转录活化活性

[0058] 首先，为确认1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A对PPARγ的作用，我们在短暂转染报告分析中采用一报告质体，其包含在萤光酶报告基因的前面 有一重复PPARγ反应调控子(response element)。其结果如图2所示，在浓度10μM时，1-去羟基肿柄菊内酯A促进PPARγ依赖性PPRE启动子的转录活化至2倍载体活性，且肿柄菊内酯A显示比1-去羟基肿柄菊内酯A略低的活性。

[0059] 实施例5：

[0060] 1-去羟基肿柄菊内酯A(T:tirotundin)和肿柄菊内酯A(TA:tagitinin A)于PPARγ、LXRα与β依赖性ABCA1基因启动子活性上转录活化的效果

[0061] ATP结合转运蛋白A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）作用在于调节磷脂质和胆固醇细胞性流出为含脂蛋白的apoA-I，且反转胆固醇运输而发挥重要的抗动脉粥样硬化作用。除反转胆固醇运输，ABCA1也参与形成新生高密度脂蛋白粒子。ABCA1基因的转录受数个核受体如肝脏X受体（LXR）和PPAR的高度调控。PPARγ促效剂WY14643和罗格列酮已被报导可增加ABCA1基因的转录活化，且此活动是经由LXR途径。

[0062] 为评估1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A的PPARγ促效剂活性，利用ABCA1启动子报告质体做短暂转染报告分析，评估PPAR γ表现。结果如图3所示，浓度皆为10μM的1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A，各显示其转录活化ABCA1基因启动子以剂量依赖方式具3倍载体活性。即使浓度为1μM，此二种化合物各有1.8至2倍载体活性。而在100nM，1-去羟基肿柄菊内酯A仍有1.4倍载体活性，但肿柄菊内酯A完全失去促效活性。

[0063] 为评估1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A的LXRα与LXRβ促效剂活性，利用ABCA1启动子报告质体做短暂转染报告分析，分别评估LXRα与LXRβ表现。结果如图4所示，1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A以剂量依赖方式促进ABCA1基因启动子的LXRα依赖性转录活化。浓度于10μM时，显示ABCA1基因启动子的LXRα依赖性转录活化活性为载体活性的2倍，肿柄菊内酯A亦比1-去羟基肿柄菊内酯A的活性稍高。

[0064] 此外，对于LXRβ的促效性如图5所示，1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A亦以剂量依赖方式促进ABCA1基因启动子LXRβ依赖性转录活化。但浓度在10μM时，1-去羟基肿柄菊内酯A其载体活性的2.2倍比肿柄菊内酯A 其载体活性的1.5倍有稍高的转录活化活性。此结果支持本发明式II与式III化合物可作为LXRα/β双促效剂。

[0065] 实施例6：

[0066] 1-去羟基肿柄菊内酯A(T:tirotundin)和肿柄菊内酯A(TA:tagitinin A)于PPARγ、FXR依赖性SHP基因启动子活性上的转录活化效果

[0067] SHP为微异二聚体伙伴(small heterodimer partner)蛋白质，是核受体超家族的一个特殊的成员。SHP因缺乏确定的天然配体而被视为是一个孤儿核受体。通常SHP作为数个核受体与其他转录因子的转录因子辅调节因子(coregulator)，其他转录因子如雌激素受体、雄激素受体以及NF-kB。经由与其他转录因子交互作用，SHP可调节肝脏胆酸合成、脂质代谢、肝脏纤维化、葡萄糖代谢以及胰岛素分泌。SHP基因表现于先前研究中显示可被数个核受器调节，包括FXR与PPARγ。FXR直接键结至SHP基因启动子-294至-276位置，PPARγ结合至SHP启动子的-100至-57位置以活化SHP基因表现。为进一步确认是否1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A可作为PPARγ与FXR的促效剂，我们利用人类SHP基因启动子做短暂转染报告分析，以确认其于PPARγ与FXR过度表现中SHP的转录活化促效效果。为比较结果，借由使用药物载体（二甲基亚砜DMSO）为标准值作为1。

[0068] 在图6的结果显示，1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A两者于10μM对于SHP基因启动子的剂量依赖性转录活化活性为载体活性的3.5倍。然而，1μM的1-去羟基肿柄菊内酯A转录活化活性下降到1.8倍的载体活性，而肿柄菊内酯A在同样浓度1μM仍可增进SHP启动子的转录活化至2.8倍载体活性，显示1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A有PPARγ促效剂的效果。

[0069] 另一方面，确认本发明化合物是否为FXR促效剂结果如图7所示，显示浓度于10μM，1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A转录活化SHP基因启动子的活性为载体活性的2倍，且重要的是，此活性些微大于CDCA其载体活性的1.8倍。二化合物于浓度1μM时转录活化活性为载体活性的1.5倍。此结果显示本发明式II与式III化合物有FXR促效剂的效果。

[0070] 实施例7：

[0071] 1-去羟基肿柄菊内酯A(T:tirotundin)和肿柄菊内酯A(TA:tagitinin A)于LXRα依赖性大鼠CYP7A1与PEPCK基因启动子活性上的转录活化效果

[0072] LXRα会上调大鼠的CYP7A1的表达，大鼠的CYP7A1为一微粒体细胞色素P450同功酶，且主要表现于肝脏内。CYP7A1在胆固醇代谢至胆酸，与催化此途径第一及决定速率步骤中扮演起始角色。在此途径中，CYP7A1修饰类固醇环包括于7α位置羟化、3-β羟基的差向异构化以及类固醇环的饱和。例如，CYP7A1可将胆固醇转换为7α–羟胆固醇，更进一步以另一p450酶修饰7α–羟胆固醇，并生成最后的胆酸。LXRα为肝脏中主要表现亚型，且LXRα的活性造成胆固醇加速转变为胆酸，接着分泌胆酸并导致胆固醇量的降低。

[0073] 为经由LXRα评估1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A促效剂对于大鼠CYP7A1转录的活性，利用HepG2细胞作短暂转染报告分析(transient transfection reporter assay)。。结果如图8所示，其中基本培养液(DMSO)促效剂活性设为1，并显示1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A可使鼠CYP7A1基因启动子转录活化(transactivated)，且该转录活化具有剂量依赖性。当二化合物浓度为10μM时，其用于转录活化(transactivation)活性约为载体活性的二倍；另外并使用由GW3965为葛兰素大药厂(Glaxo SmithKline)所开发的LXR合成促效剂，其活化LXRs的活性十分强(LXRα的EC50=190nM)，其显示于1μM时的转录活化活性为载体活性的三倍。

[0074] 在肝脏中，LXRα除调节CYP7A1的外，亦调节磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)的表现，其为一糖质新生(gluconeogenesis)的限速酵素(rate-limiting enzyme)。证据显示LXRα的活性经由向下调节包括过氧化体增殖-活化受体γ共活化剂-1α(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1α,PGC-1)、PEPCK以及葡萄糖-6-磷酸酶表现(glucose-6-phosphatase expression,G-6-Pase)的基因，而抑制糖质新生流程。合成的LXR促效剂GW3965在鼠模型经实验证实可降低PEPCK基因的mRNA量，故本发明中，我们利用短暂转染报告分析评估1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A的降低PEPCK基因活性的效果。结果如图9所示，1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A以剂量依赖方式反向抑制(transrepressed)PEPCK基因启动子活性。于10μM时，与载体 活性相比，1-去羟基肿柄菊内酯A降低PEPCK基因启动子活性42%，且肿柄菊内酯A与载体活性相比降低
57%，亦比1-去羟基肿柄菊内酯A稍低。更重要的是，剂量于1μM时，1-去羟基肿柄菊内酯A和肿柄菊内酯A皆显示与GW3965相似的反式抑制活性，即载体活性的62%活性。剂量于
100nM时，两者的抑制活性皆大幅减少。

[0075] 实施例8：

[0076] 式II~III化合物的衍生物及式IV～XIIII化合物活性验证

[0077] 由于式II化合物(tirotundin)与式III化合物(tagitinin A)的结构与活性的关系(SAR,structure-activity relationship)可知R1,R2,R3(尤其是R3)若为OH，则式II~III化合物的衍生物也具有相似活性，即具有LXRs、FXR、PPARα、γ促效剂或治疗糖尿病、降血糖及降胆固醇的功效；也就是说在C1与C2、C4与C5有双键的式II化合物的衍生物例如式VI与式VIII化合物，因为双键对R3=OH

[0078] 式VI

[0079] 式VIII

[0080] 另外，依据文献内容可得到式IV~VIIII化合物，其同样应具有LXRs、FXR、PPARα、γ促效剂或治疗糖尿病、降血糖及降胆固醇的功效。

[0081]

[0082] tagitinin D，式IV 2α-hydroxytirotundin，式V

[0083]

[0084] tagitinin F，式VI tagitinin F-3-O-methyl ether，式VII

[0085]

[0086] tagitinin B，式VIII tagitinin B-3-O-methyl ether，式IX

[0087] 上述化合物的萃取参考文献包括：

[0088] 1.Herz W.,Sharma R.P.J.Org.Chem.,1975,40,3118。

[0089] 2.Barua N.C.,Sharma R.P.,Madhusudanan K.P.,Thyagaraian G.,Herz W., Murari R.J.Org.Chem.,1979,44,1831。

[0090] 3.Garcia A.,Delgado g.J.Mex.Chem.Soc.,2006,50,180.

[0091] 4.Kuo Y.H.,Chen C.H.J Nat Prod.,1998,61,827.

[0092] 5.Pal R.,Kuishreshta D.K.,Rastogi R.P.,J.Pharm.Sci.,1976,65,918.[0093] 上述化合物式IV~IX的结构模拟数据如下：

[0094]

[0095]

[0096] 在此是以电脑模拟方法来证实式IV~式VIIII化合物因三维立体结构相似，所以对PPARα、γ、LXRα、β与FXR有和式II与式III相似的结合能力。利用Discovery Studio(Accelry公司)的Ligandt程式把能量最适化的式IV~式VIIII化合物分别置入(dock)PPARα(protein data bank,PDB ID:3FEI)、γ(PDBID:3G9E)、LXRα(PDB ID:3IPQ)、β(PDB ID:2ACL)或FXR(PDB ID:1OT7)的ligand binding pocket X光线结晶体中并且以PLP值来做为决定化合物与蛋白质交互作用时结合能力的强弱，PLP值是计算化合物与蛋白质之间交互作用时所产生亲水性(hydrophilic interaction)与疏水性(hydrophobic interaction)作用力的总和，PLP值越高代表化合物与蛋白质之间的结合能力越强，由上面所列式IV~式VIIII化合物对PPARα、γ、LXRα、β与FXR的PLP值可知这些化合物都与肿柄菊内酯A(PLP:PPARα=72.57、PPARγ=72.48、FXR=69.39、LXRα=78.01、LXRβ=78.42)对这些核受体有相似的结合能力，因此IV~VIIII化合物具PPARs、LXRs与FXR促效剂的活性。

[0097] 实施例9：

[0098] 式VI与VIII化合物反应产生式II化合物

[0099] 经实验发现式VI与VIII化合物可经由反应方法1或反应方法2产生式II化合物：

[0100] 反应方法1:

[0101] 将式VI或VIII化合物进行氢化反应(hydrogenation)来产生式II化合物:先将50毫克(50mg)的10%Pd-C放置在圆底瓶中并加入50毫升(ml)甲醇，然后再把适量(40毫克；40mg)的式VI或VIII化合物溶在上述的圆底瓶中，接下来将氢气引入反应的圆底瓶中并在室温下进行氢化反应10至30分钟。反应结束后将圆底瓶内的溶液过滤而得到纯溶液，紧接下来把此溶液经过减压浓缩得到粗油，最后再以层析管柱方法来进行分离与纯化而得到式II产物。

[0102] 反应方法2:

[0103] 将式VI或VIII化合物进行氢化反应(hydrogenation)来产生式II化合物:先将10毫莫尔(10mmol)的polyethylene glycol(400MW)放置在圆底瓶中并加入0.05毫莫尔(0.05mmol)的PtO2，然后再把1毫莫尔(1mmol)的式VI或VIII化合物加入上述的圆底瓶中，接下来将氢气引入反应的圆底瓶中并在室温下进行氢化反应10至30分钟。反应结束后先加入50毫升(ml)乙醚或乙酸乙酯到圆底瓶来萃取产物并使产物留置有机层(即乙醚或乙酸乙酯层)，重复萃取四次后将所有萃取得到的有机层溶液合并在一起而得到产物有机溶液，紧接下来把此溶液经过水与brine溶液清洗后，然后再以Na2SO4除水后经由减压浓缩得到粗油，最后再以层析管柱方法来进行分离与纯化而得到式II产物。

[0104] 于上述实施例中可知，由五爪金英分离出的式I化合物：可借由PPARγ途径，被证明可作为五爪金英抗糖尿病作用的活性成分。重要的是，式I化合物可作为PPARα/γ双重促效剂且不会有罗格列酮的不良心血管副作用。而除PPARα/γ双重促效剂外，亦可进一步用式I化合物作为LXRs与FXR促效剂。因PPARγ及FXR的合成促效剂在抗糖尿病治疗上已有在使用或于临床评估试验，式I化合物为五爪金英的抗糖尿病、降血糖及胆固醇的活性成分。基本上，由于对糖尿病及高血糖症、高胆固醇症的病患来说，PPARα、γ、LXRs与FXR有多重医药上有益的作用，本发明式I化合物在草药抗糖尿病及高血糖症、高胆固醇症的治疗上具有疗效。

[0105] 另一方面，本发明亦可将式I化合物利用于治疗糖尿病、高血糖症、高胆固醇症等医药组成物的成分中，藉以调整血中葡萄糖及胆固醇。前述医药组成物除包括有效剂量的式I化合物外，尚可包括药学上可接受的载体。载体可为赋形剂（如水）、填充剂（如蔗糖或淀粉）、黏合剂（如纤维素衍生物）、稀释剂、崩解剂、吸收促进剂或甜味剂，但并未仅限于此。本发明医药组成物可依一般习知药学的制备方法生产制造，将式I化合物有效成分剂量与一种以上的载体相混合，制备出所需的剂型，此剂型可包括锭剂、粉剂、粒剂、胶囊或其他液体制剂，但未以此为限。