HouttuynoidD在抗幽门螺杆菌药物中的应用

摘要

体外活性实验表明Houttuynoid D具有很强的抗幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，Hp)活性。Houttuynoid D可用于急、慢性胃炎、胃、十二脂肠溃疡等疾病的治疗及在制备治疗急、慢性胃炎、胃、十二脂肠溃疡药物中得到应用。本发明涉及的HouttuynoidD在制备治疗抗幽门螺杆菌药物中的用途属于首次公开，由于骨架类型属于全新的骨架类型，而且其对于幽门螺杆菌抑制活性强得意想不到，不存在由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于幽门螺杆菌感染的防治显然具有显著的进步。

权利要求

1.Houttuynoid D在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用，所述化合物Houttuynoid D结构如式(I)所示:

说明书

Houttuynoid D在抗幽门螺杆菌药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物制药技术领域,尤其涉及Houttuynoid D在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用。

背景技术

[0002] 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是一种革兰氏阴性螺旋状细菌。研究显示，幽门螺杆菌是急、慢性胃炎以及胃、十二指肠溃疡的主要致病原因，并可能与胃癌和胃粘膜相关性淋巴样组织(MALT)恶性淋巴瘤发病有关。最近，世界卫生组织将Hp归为I类致癌物，它在胃癌发展中起主导作用。目前流行的治疗Hp感染的方案是同时服用质子泵抑制剂(PPI)加两种抗生素(克拉霉素，阿莫西林、四环素、甲硝唑等选二种)的三联疗法。影响三联疗法的最主要因素被认为是Hp对抗菌剂的耐药性；另一严重问题是质子泵抑制剂会诱发消化不良，大量抗菌剂则导致消化道内菌群的严重毁灭。因此，寻找高效、安全的抗Hp活性一类新药物成为一个重要和迫切的任务。

[0003] 本发明涉及的化合物Houttuynoid D是一个2012年发表(Chen, S.D.et al.,2012.Houttuynoid D—E， Ant1-Herpes Simplex Virus Active Flavonoids with NovelSkeletons from Houttuynia cordata.0rganic Letters 14 (7)，1772 - 1775.)的新骨架化合物，该化合物拥有全新的骨架类型，目前的用途仅仅涉及抗单纯疱疹病毒活性(Chen, S.D.et al.，2012.Houttuynoid D—E，Ant1-Herpes Simplex Virus ActiveFlavonoids with Novel Skeletons from Houttuynia cordata.0rganic Letters 14(7)，1772 - 1775.)，对于本发明涉及的Houttuynoid D在制备治疗抗幽门螺杆菌药物中的用途属于首次公开，由于骨架类型属于全新的骨架类型，而且其对于幽门螺杆菌抑制活性强得意想不到，不存在由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于幽门螺杆菌感染的防治显然具有显著的进步。

发明内容

[0004] 本发明的目的是研究Houttuynoid D在抗幽门螺杆菌药物中的应用。

[0005] 所述化合物Houttuynoid D结构如式(I )所示:

[0006]

[0007] Houttuynoid D的体外实验表明，Houttuynoid D具有很强的抗幽门螺旋杆菌活性，纸片法显示其抑菌圈直径为16 mm (ATCC43504)。用琼脂稀释法显示它能完全抑制5个随机的临床菌株(HpOOl、Hp003、Hp004、HpO 18和Hp036)和I个标准菌株(ATCC43504)的生长，最小抑菌浓度(MIC)均为0.25 yg/ml。用氨苄西林作阳性对照，其对6株测试菌完全抑制的最小浓度(MIC)为2.0 μ g/mlo

[0008] 本研究结果显示，Houttuynoid D的抑制幽门螺旋杆菌活性的能力比氨节西林强，说明对于与幽门螺旋杆菌密切相关的急、慢性胃炎、胃、十二脂肠溃疡等疾病来讲，Houttuynoid D是一个极具开发潜力的化合物。它可直接用于相应疾病的治疗以及相关药物的制备。

[0009] 本发明涉及的Houttuynoid D在制备治疗抗幽门螺杆菌药物中的用途属于首次公开，由于骨架类型属于全新的骨架类型，而且其对于幽门螺杆菌抑制活性强得意想不到，不存在由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于幽门螺杆菌感染的防治显然具有显著的进步。

具体实施方式

[0010] 本发明所涉及化合物Houttuynoid D的制备方法参见文献(Chen, S.D.et al.,2012.Houttuynoid D—E， Ant1-Herpes Simplex Virus Active Flavonoids with NovelSkeletons from Houttuynia cordata.0rganic Letters 14 (7)，1772 - 1775.)。

[0011] 以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。

[0012] 实施例1:本发明所涉及化合物Houttuynoid D片剂的制备:

[0013] 取20克化合物Houttuynoid D，加入制备片剂的常规辅料180克，混匀，常规压片机制成1000片。[0014] 实施例2:本发明所涉及化合物Houttuynoid D胶囊剂的制备:

[0015] 取20克化合物Houttuynoid D，加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉180克，混匀，装胶囊制成1000片。

[0016] 下面通过药效学实验来进一步说明其药物活性。

[0017] Houttuynoid D 的药理实验

[0018] I)供试菌株

[0019] 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)标准菌株ATCC 43504购于美国菌种保存中心(American Type Culture Collection, ATCC)。15株Hp临床菌株米自江苏省人民医院消化科、江苏省中医院检验科和南京市儿童医院胃镜室接受胃镜检查的患者；在连续胃镜检查中对消化性溃疡、十二指肠球炎或疣状胃炎的患者，先经快速尿素酶实验确定为Hp阳性者，再取胃窦黏膜1-2块,切碎后接种于含8%马血清、三甲氧节氨喃唳(trimethropin,TMP) 1.25 g/L、多粘菌素(polymyxin) B2500 U/L、万古霉素(vancomycin) 10 mg/L 的Columbia选择性琼脂培养基中，于37 ° C在微氧环境下(5% O2, 10% CO2和85% N2)培养72小时。收集细菌，经涂片革兰氏染色，氧化酶、触酶和尿素酶鉴定为阳性后，传代纯培养，所得菌株作为实验菌株。

[0020] 2)菌株培养[0021 ] 我们采用微需氧袋(购自上海医科大学)进行HP的菌株培养，它可通过化学反应产生Hp所需要的微需氧环境。

[0022] 3) 生物活性测定

[0023] 采用纸片法(Microbiological paper method)测定化合物对幽门螺杆菌的抑制作用，用琼脂稀释法来测定供试样品的最低抑菌浓度(minimal inhibitoryconcentration, MIC)。

[0024] 1.纸片法实验

[0025] (A)准备培养基将配制好的Columbia培养基经高压蒸汽灭菌后，冷却至50-60°C，加8%马血清或绵羊血，混匀倾注于已经灭菌的培养皿中，每皿7-10 ml，培养基厚度为L 5 mm (无菌操作)。

[0026] (B)转接实验菌(涂菌)用微量取样器取稀释好的108CFU/ml (IOD660=IO8 CFU/ml)Hp的菌悬液0.1 ml均匀地涂抹在适宜的培养皿表面。倒置于37°C烘干箱中15 min后取出，目的使琼脂表面干燥，备用。

[0027] (C)贴样品纸片用微量取样器取6 μ I待测样品(质量浓度2 mg/ml)注入已经灭菌的圆滤纸片上。用无菌镊子镊取含样品的纸片和对照空白纸片，按无菌操作分别纸片紧贴于含菌琼脂表面，每隔一定距离贴一张纸片。每种菌做3皿，所得结果求其平均值。

[0028] (D)培养将各平皿置于微需氧袋中，封口，打开气体发生器，再置于37°C培养箱中培养72h。

[0029] (E)测抑菌圈直径取出平板后，分别测量各纸片周围抑菌圈直径的大小。参照对照组的结果，可得出待测样品敏感实验的结果。重复三次。

[0030] I1.琼脂稀释法测定MIC

[0031] (A)药物平板的制备首先将测试的化合物用二甲基亚砜(DMSO)溶液配制成0.5mg/ml 的母液，再用无菌水稀释，最终配成 10.0，8.0，6.0，4.5，4.0，3.5，3.0，2.5，2.0，1.5，1.0,0.5和0.25 μ g/ml的浓度系列，DMSO在介质中的浓度小于1%。将I ml配制好的测试化合物溶液与保温于50° C的9 ml哥伦比亚培养基另加I ml保温于50 ° C的马血清充分混匀，浇制入培养皿中冷却即成。

[0032] (B)转接实验菌(涂菌)用微量取样器吸取稀释好的IXlO8 CFU/ml Hp的菌悬液0.1 ml均匀地涂抹在培养皿表面，倒置于37°C烘干箱中15 min后取出，目的使琼脂表面干燥，备用。

[0033] (C)确定MIC将待测培养皿在微需氧袋(含:85% N2, 10% CO2和5% O2)中，保温37°C培养72小时，观察Hp生长情况，与空白组相对照，以完全没有菌生长的样品最低浓度为最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)值。阳性对照为氨节西林(Ampicillin)。

[0034] 3、Houttuynoid D的药理实验结果

[0035] 体外实验表明，Houttuynoid D具有很强的抗幽门螺旋杆菌活性，纸片法显示其抑菌圈直径为16 mm (ATCC43504)。用琼脂稀释法显示它能完全抑制5个随机的临床菌株(HpOOl、Hp003、Hp004、Hp018和Hp036)和I个标准菌株(ATCC43504)的生长，最小抑菌浓度(MIC)均为0.25 μ g/ml。用氨节西林作阳性对照,其对6株测试菌完全抑制的最小浓度(MIC)为 2.0 μ g/ml ο

[0036] 结论:Houttuynoid D抑制幽门螺旋杆菌活性的能力比氨节西林强,说明对于与幽门螺旋杆菌密切相关的急、慢性胃炎、胃、十二脂肠溃疡等疾病来讲，Houttuynoid D是一个极具开发潜力的化合物。它 可直接用于相应疾病的治疗以及相关药物的制备。