从紫叶李树叶中提取山奈苷的方法转让专利
申请号 : CN201210382447.0
文献号 : CN102875619B
文献日 : 2014-11-12
发明人 : 吴波
申请人 : 武汉工业学院
摘要 :
本发明公开了一种从紫叶李树叶中提取山奈苷的方法，经用乙醇水溶液浸提紫叶李树叶和减压浓缩后，浓缩液于2~5℃下静置12~24h，离心分离去掉沉淀物质；将离心液用蒸馏水稀释后上大孔树脂柱,进行初步分离，先用蒸馏水洗脱大部分色素,再用体积比浓度为20~33%的乙醇水溶液进行洗脱,收集柱后有效馏分液；所述大孔树脂为比表面积在500～800m2／g之间，中等极性的树脂；将有效馏分液于-6~5℃温度条件下放置6~8天进行结晶，结晶后过滤，得结晶粗产物和母液；结晶粗产物经水洗、室温真空干燥后即得山奈苷产品。本发明通过大剂量上柱进行初步分离和结晶进一步纯化，不仅可以得到产率较大、纯度较高的山奈苷晶体，且单批次处理量大，提取成本较低。
权利要求 :
1.一种从紫叶李树叶中提取山奈苷的方法，包括乙醇水溶液浸提和浓缩步骤，其特征在于：还包括如下步骤：
1)浓缩步骤所得浓缩液于2～5℃下静置12～24h，离心分离去掉沉淀物质，剩下离心液用蒸馏水稀释；
2)上大孔树脂柱色谱进行初步分离，先用蒸馏水冲洗，再用体积比浓度为20～33％的2
乙醇水溶液进行洗脱,收集柱后有效馏分液；所述大孔树脂为比表面积在500～800m/g之间，中等极性的树脂；
3)将有效馏分液于-4～3℃温度条件下放置6～8天进行结晶，结晶后过滤，得结晶粗产物和母液；
4)结晶粗产物经水洗、室温真空干燥后得产品；
所述乙醇水溶液的体积百分比浓度为70％，浸提步骤在室温下进行。
2.根据权利要求1所述的从紫叶李树叶中提取山奈苷的方法，其特征在于：所述步骤
3)所得母液经减压旋转浓缩、蒸馏水稀释后回步骤2)，循环进行分离、结晶步骤。
3.根据权利要求1或2所述的从紫叶李树叶中提取山奈苷的方法，其特征在于：所述步骤2)中，柱后馏分液的流速为3～5ml/min。
4.根据权利要求1或2所述的从紫叶李树叶中提取山奈苷的方法，其特征在于：所述步骤2)中，乙醇水溶液体积比浓度为28～31％。
5.根据权利要求3所述的从紫叶李树叶中提取山奈苷的方法，其特征在于：所述步骤
2)中，乙醇水溶液体积比浓度为28～31％。
6.根据权利要求1或2所述的从紫叶李树叶中提取山奈苷的方法，其特征在于：所述步骤3)中，结晶温度为-1～3℃。
7.根据权利要求3所述的从紫叶李树叶中提取山奈苷的方法，其特征在于：所述步骤
3)中，结晶温度为-1～3℃。
8.根据权利要求7所述的从紫叶李树叶中提取山奈苷的方法，其特征在于：所述步骤
3)中，结晶温度为0～2℃。
说明书 :
从紫叶李树叶中提取山奈苷的方法
技术领域
[0001] 本发明属于天然产物化学技术领域，具体涉及一种从紫叶李树叶中提取山奈苷的方法。
背景技术
[0002] 山 奈 苷，别 名：山 奈 酚 -3,7-O-L-二 鼠 李 糖 苷，英 文 名 称 为Kaempferitrin;Kaempferol 3,7-L-dirhamnoside，分子式：C27H30O14，分子量：578.57，CAS号482-38-2，据文献报道，该物质可降血糖、抗疲劳、清热解毒和消肿止痛，其苷元具有抗癌、抑制生育、抗癫痫、抗炎、抗氧化剂等药理作用。山奈苷的提取主要以伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根为原料，经醇提取后浓缩，在色谱柱（硅胶柱、C18柱、逆流色谱等）上进行层析分离、冻干后得起相应的产品。由于山奈苷目前没有较好的结晶纯化办法，在层析分离中，考虑到组分需完全分离的要求及柱容量本身的限制，其上样量要严格控制在mg级，因此产品的得率低，分离成本高，在冻干步骤中，其干燥的效率也较低。紫叶李(Prunus cerasifera) 又叫红叶李，属蔷薇科（Rosacvae）植物，是多年生落叶小乔木。原种产于亚洲西南部，现在我国广泛种植，资源丰富，其树叶中富含山奈苷，但目前尚未有经济的从紫叶李树叶中提取分离山奈苷的方法。
发明内容
[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一种简单方便、成本低廉的从紫叶李树叶中提取山奈苷的方法，该方法不仅产品得率高，而且纯度也高。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案包括如下步骤：
[0005] 1）以干燥、粉碎的紫叶李树叶为原料，以乙醇水溶液为溶剂，在室温下进行浸提，得浸提液；
[0006] 2）浸提液经减压旋转浓缩得浓缩液；
[0007] 3）浓缩液于2~5℃下静置12~24h，离心分离去掉沉淀物质后得离心液，将离心液用蒸馏水稀释；
[0008] 4）上大孔树脂柱,进行初步分离，先用蒸馏水洗脱大部分色素,再用体积比浓度为20~33%的乙醇水溶液进行洗脱,收集柱后有效馏分液；所述大孔树脂为比表面积在2
500～800m ／g之间，中等极性的树脂；
500～800m ／g之间，中等极性的树脂；
[0009] 5）将有效馏分液于-6~5℃温度条件下放置6~8天进行结晶，结晶后过滤，得结晶粗产物和母液；
[0010] 6）结晶粗产物经水洗、室温真空干燥后得产品；母液经减压旋转浓缩、蒸馏水稀释后回步骤4），循环进行分离、结晶步骤。
[0011] 进一步地，所述步骤2）中，柱后馏分液的流速为3~5ml／min。
[0012] 进一步地，所述步骤2）中，乙醇水溶液体积比浓度为28~31%。
[0013] 进一步地，所述步骤3）中，结晶温度为-1~3℃。
[0014] 进一步地，所述步骤3）中，结晶温度为0~2℃。
[0015] 本发明经对紫叶李树叶进行浸提、浓缩后，利用大孔树脂柱中填料比表面积较大的特点进行大剂量上柱，充分发挥其柱效，达到初步纯化和浓缩的目的，使山奈苷得到很好的富集，而且大孔树脂柱的色谱分离还能去除很大一部分影响山奈苷结晶的杂质，从而可在适当的结晶条件下通过结晶进一步纯化产品。因此，本发明不仅可以得到产率较大、纯度较高的山奈苷晶体，而且单批次处理量大，提取成本较低，有利于进行工业化生产。
附图说明
[0016] 图1是本发明提取的山奈苷产品的色谱图。
[0017] 图2是本发明提取的山奈苷产品的紫外吸收曲线图。
[0018] 图3是本发明提取的山奈苷产品的红外光谱图。
[0019] 图4是山奈苷柱后馏分液流出曲线图。
具体实施方式
[0020] 以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
[0021] 实施例1
[0022] 1.称取200g干燥的紫叶李树叶并粉碎，取40目筛下物于5000ml烧杯中，加入70%（V/V）的乙醇水溶液2000ml，用保鲜膜封口，室温放置12h，以600r／min的速度搅拌2h，过滤，收集滤液。
[0023] 滤饼重新添加70%（V/V）的乙醇水溶液1000ml，以600r／min的速度搅拌20min后过滤，滤饼按上述方法再重复进行处理一次，合并上述三次滤液，得浸提液。
[0024] 2.将浸提液在59℃水浴中减压旋转浓缩至500ml，在2℃下放置12h，离心（4000r／min，30min）分离去掉大部分脂溶性物质后得离心液，将离心液用蒸馏水稀释至2000ml。
[0025] 3.以3ml／min流速上大孔树脂柱色谱（郑州勤实科技有限公司的HPD400A大孔2
吸附树脂，比表面积为500～550m ／g，极性为中等极性，玻璃柱型号为Φ3.0*L100cm），以同样流速，用3000ml蒸馏水冲洗柱子。
吸附树脂，比表面积为500～550m ／g，极性为中等极性，玻璃柱型号为Φ3.0*L100cm），以同样流速，用3000ml蒸馏水冲洗柱子。
[0026] 4.采用30%（V/V）的乙醇水溶液将山奈苷从柱中淋洗下来，流速为3ml／min，收集柱后550~1250ml之间的馏分液，即有效馏分液。有效馏分液的确定方法见实施例5。
[0027] 5.将收集的馏分液在-1℃温度条件下结晶7天，结晶后过滤，得结晶粗产物和母液。
[0028] 6.结晶粗产物经水洗、室温真空干燥后得山奈苷产品（经HPLC外标法定性、定量，其含量≥98%），母液经重新减压旋转浓缩并加蒸馏水稀释至2000ml后，进入步骤3，重复进行分离和结晶过程。
[0029] 平行提取紫叶李树叶十次，产品平均得率为80-85%。
[0030] 从图1可以看出，山奈苷产品在检测波长为360nm，经C18柱（4.6×150mm，3μm）分离（流动相：A相为0.2%磷酸溶液,B相为乙腈；流速为0.25mL/min, 柱温为50℃，梯度程序）后，色谱图中仅有一个色谱峰出现（15.8min），在同一色谱条件下，该峰的保留时间与山奈苷对照品的出峰的保留时间是一致的。
[0031] 图2中，在200~400nm，产品的吸收曲线轮廓与山奈苷对照品的吸收曲线轮廓也是一样的，其中λmax分别为263.4nm、342.9nm。
[0032] 图3中，产品的红外吸收图谱可以发现，在3300~2500cm-1处强而宽的吸收表明-1 -1分子中含有羟基，且形成氢键：2920cm 左右有两个吸收峰说明含有CH2，而2977cm 处是 -1 -1 -1
CH3 的吸收峰，从2920cm 和2977cm 两处吸收峰强度看，CH3应多于CH2；在1650cm 左-1 -1
右有个次强峰，表明样品结构中含有羰基，1600cm 和1500cm 处的吸收说明存在苯环；在-1 -1
1500~1300cm 处有很明显的C—H弯曲振动信息，在1059cm 处存在吸收说明含有-OH。
CH3 的吸收峰，从2920cm 和2977cm 两处吸收峰强度看，CH3应多于CH2；在1650cm 左-1 -1
右有个次强峰，表明样品结构中含有羰基，1600cm 和1500cm 处的吸收说明存在苯环；在-1 -1
1500~1300cm 处有很明显的C—H弯曲振动信息，在1059cm 处存在吸收说明含有-OH。
[0033] 综上所述，结合山奈苷的分子结构可以断定提纯的样品确为山奈苷。
[0034] 实施例2
[0035] 步骤1、2同实施例1。
[0036] 3.以4ml／min流速上大孔树脂柱色谱（郑州勤实科技有限公司的HPD400A大孔2
吸附树脂，比表面积为500～550m ／g，极性为中等极性，玻璃柱型号为Φ3.0*L100cm），以同样流速，用3000ml蒸馏水冲洗柱子。
吸附树脂，比表面积为500～550m ／g，极性为中等极性，玻璃柱型号为Φ3.0*L100cm），以同样流速，用3000ml蒸馏水冲洗柱子。
[0037] 4.采用30%（V/V）的乙醇水溶液将山奈苷从柱中淋洗下来，流速为5ml／min，收集柱后550~1250ml之间的馏分液。
[0038] 5.将馏分液在3℃温度条件下结晶8天，结晶后过滤，得结晶粗产物和母液。
[0039] 6.结晶物粗产物经水洗、室温真空干燥后得山奈苷产品（经HPLC外标法定性、定量，其含量≥98%），母液经重新减压旋转浓缩并加蒸馏水稀释至2000ml后，进入步骤3，重复进行分离和结晶过程。
[0040] 平行提取紫叶李树叶十次，产品平均得率为80-85%。
[0041] 实施例3
[0042] 步骤1、2同实施例1。
[0043] 3.以5ml／min流速上大孔树脂柱色谱（郑州勤实科技有限公司的HPD400A大孔2
吸附树脂，比表面积为500～550m ／g，极性为中等极性，玻璃柱型号为Φ3.0*L100cm），以同样流速，用3000ml蒸馏水冲洗柱子。
吸附树脂，比表面积为500～550m ／g，极性为中等极性，玻璃柱型号为Φ3.0*L100cm），以同样流速，用3000ml蒸馏水冲洗柱子。
[0044] 4.采用30%（V/V）的乙醇水溶液将山奈苷从柱中淋洗下来，流速为5ml／min，收集柱后550~1250ml之间的馏分液。
[0045] 5.将馏分液在0℃温度条件下结晶7天，结晶后过滤，得结晶粗产物和母液。
[0046] 6.结晶物粗产物经水洗、室温真空干燥后得山奈苷产品（经HPLC外标法定性、定量，其含量≥98%），母液经重新减压旋转浓缩并加蒸馏水稀释至2000ml后，进入步骤3，重复进行分离和结晶过程。
[0047] 平行提取紫叶李树叶十次，产品平均得率为80-85%。
[0048] 实施例4
[0049] 步骤1、2、3同实施例1。
[0050] 4.采用30%（V/V）的乙醇水溶液将山奈苷从柱中淋洗下来，流速为5ml／min，收集柱后550~1250ml之间的馏分液。
[0051] 5.将馏分液在-4℃温度条件下结晶7天，结晶后过滤，得结晶粗产物和母液。
[0052] 6.结晶物粗产物经水洗、室温真空干燥后得山奈苷产品（经HPLC外标法定性、定量，其含量≥98%），母液经重新减压旋转浓缩并加蒸馏水稀释至2000ml后，进入步骤3，重复进行分离和结晶过程。
[0053] 平行提取紫叶李树叶十次，产品平均得率为80-85%。
[0054] 实施例5
[0055] 本实施例为有效馏分液的确定方法的实施例。
[0056] 如实施例1进行步骤1-3后，采用30%（V/V）的乙醇水溶液将山奈苷从柱中淋洗下来，流速为4ml／min，收集柱后馏分液,每次收集50ml于50ml烧杯中，连续收集28次，分别测定50ml烧杯中收集的馏分液中山奈苷的浓度，绘制山奈苷浓度与柱后馏分液体积的关系曲线，见图4，从图4中可以看出，在柱后馏分液体积为550ml时山奈苷已开始出现，其流出曲线的前部分，山奈苷组分流出较快，后半部分有一些拖尾，在柱后馏分体积为1250ml以后，基本上没有山奈苷流出，最后确定在550~1250ml之间的馏分液为有效馏分液，该部分基本收集完全了柱中的山奈苷组分。
[0057] 由于有效馏分液的范围与淋洗用的乙醇水溶液的浓度及大孔树脂柱的长度有关，因此，本发明中，当淋洗用的乙醇水溶液浓度为20~33%之间其它数值时或者大孔树脂柱柱长发生变化时，需采用上述方法重新确定有效馏分液的范围。