与CD40L蛋白特异性结合的配体多肽及药物输送系统转让专利
申请号 : CN201210332549.1
文献号 : CN102875647B
文献日 : 2014-11-19
发明人 : 徐宇虹 , 丁茜 , 刘丹
申请人 : 上海交通大学
摘要 :
本发明公开了一种与CD40L蛋白特异性结合的配体多肽及药物输送系统。本发明涉及的与CD40L蛋白特异性结合的配体多肽包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本发明的药物输送系统包括所述配体多肽、载药系统、至少一种活性物质。所述载药系统具体为脂质体；所述至少一种活性物质为任何需要被输送到体内特定位置的物质。本发明的配体多肽具有很好的CD40L靶向作用，针对一些CD40L高表达的自身免疫性疾病可以开发为早期诊断试剂盒以及特异性的治疗药物，同时该多肽与脂质体结合还可以作为靶向药物载体，发展为针对自身免疫性疾病的靶向药物输送系统。
权利要求 :
1.一种与CD40L蛋白特异性结合的配体多肽，其特征在于，所述配体多肽的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种与CD40L蛋白特异性结合的配体多肽，其特征在于，所述配体多肽包括SEQ ID NO.1所示序列，以及在其C末端和/或N末端添加连接基团或连接用氨基酸序列，所述配体多肽的序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种如权利要求1所述的配体多肽在制备药物输送系统中的用途。
4.一种如权利要求2所述的配体多肽在制备药物输送系统中的用途。
5.一种药物输送系统，其特征在于，该系统包括：与CD40L蛋白特异性结合的配体多肽、载药系统、至少一种活性物质；
所述配体多肽被连接于以下任一结构表面：纳米粒子、聚合物、脂质体、囊泡、固体脂质微粒、胶束、碳纳米管、细胞器、脂蛋白；
所述配体多肽的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；
所述活性物质为抗肿瘤药物，抗代谢药物，纺锤体毒性生物碱，拓扑异构酶抑制剂，光敏剂，激酶抑制剂，抗生素，免疫抑制剂，抗寄生虫的化合物，用于超声造影、放射造影的诊断试剂，目的基因，或含有目的基因的真核表达载体DNA。
6.如权利要求5所述的药物输送系统，其特征在于，所述抗生素为细胞毒性抗生素；
或所述抗肿瘤药物为抗肿瘤抗生素；
或所述目的基因为反义癌基因、细胞因子基因、或前述基因的组合。
说明书 :
与CD40L蛋白特异性结合的配体多肽及药物输送系统
技术领域
[0001] 本发明涉及蛋白质多肽技术领域，尤其涉及一种与CD40L蛋白特异性结合的配体多肽及药物输送系统。
背景技术
[0002] CD40L为肿瘤坏死因子（TNF）超家族成员，为II型膜蛋白，主要表达在CD4+T细胞表面，包括Th0、Th1及Th2细胞亚群。CD40L也表达在其他淋巴细胞表面，如活化的CD8+T细胞或B细胞表面。研究表明，功能性的CD40L也表达在造血系中非淋巴细胞，如活化的血小板细胞的表面。活化的T细胞可在活化后十几分钟内瞬时表达CD40L，在6小时达到顶峰，随后表达量开始下降。
[0003] CD40/CD40L为特异性免疫反应系统中一对重要的共刺激分子，参与机体的体液免疫和细胞免疫反应。该信号通路可以上调活化T细胞表面共刺激分子B7（CD80/CD86）家族成员的表达；增加其他细胞表面CD23，CD54，CD95以及LT2β的表达；诱导免疫球蛋白IgG、IgA及IgE的同种型转换；避免B细胞因为Fas（CD95）或抗原诱导的IgM交联引起的凋亡；诱导B细胞的阴性筛选等。
[0004] CD40/CD40L信号通路与很多自身免疫性疾病相关，其异常可导致机体产生免疫病理反应。类风湿性关节炎（RA）患者关节液中的淋巴细胞CD40L表达量较正常人水平增加。在多发性硬化病（MS）中，同样检测到CD40L高表达的情况。相较于正常人，MS病人血液中淋巴细胞CD40L阳性T细胞率明显的增加，而且原表达CD40L的T细胞的表达水平也有所增加。由于CD40/CD40L信号传到通路与免疫系统疾病相关，大量研究针对阻断这一信号通路来完成对疾病的治疗。在与RA对应的CIA动物模型研究中，抗CD40L单克隆抗体可阻断CIA发生，包括抑制抗原递呈细胞产生IL-12，抑制IgG分泌和关节局部巨噬细胞产生NO，减少关节部位炎症细胞浸润。另外在对应MS的EAE小鼠模型研究中，抗CD40L的单克隆抗体不仅能在发病早期阻止EAE发生，包括抑制IL-12的分泌，阻止CD4+Th1细胞的活化，下调ICAM黏附分子的表达，减少单核细胞产生NO等。在后续相关的动物实验和临床实验中发现抗CD40L抗体发挥作用的机理除了阻断CD40/CD40L信号通路之外，外还包括抗体Fc段介导清除活化的CD40L+T细胞。
[0005] 进入临床实验的几个抗体，都因出现了血栓的情况而暂停了临床试验。这一血栓的形成可能是因为抗CD40L抗体上的Fc段与血液中血小板上的FcRIIA受体结合，造成血小板之间的交联，导致血液凝集出现栓塞。后续在此基础上对抗体进行的改进，去除可以引起血栓的Fc段，只保留抗体上的Fab段，依然可以发挥其阻断CD40/CD40L信号通路的作用。但同时因为Fc段的去除，就无法达到CD40L+T细胞清除的效果。
[0006] 针对阻断CD40/CD40L信号通路的抗体药物的缺陷和局限性，可以对其研究思路进一步的改造：1.筛选针对CD40L的配体多肽，将此多肽作为抗体的Fab段使用，达到阻断CD40/CD40L信号通路的效果。2.结合CD40L的靶向配体多肽与脂质体载药技术，通过多肽靶向高表达CD40L的细胞，针对性的释细胞毒药物，达到抑制CD40L+T细胞增殖的效果。目前已有针对CD40的三聚多肽出现，并在细胞水平上有效的抑制了CD40/CD40L信号通路，但并未有进一步的体内实验报道，另外也并未有针对CD40L的配体多肽来实现阻断CD40/CD40L信号同路的报道。
[0007] 脂质体是和生物膜双层磷脂分子结构类似的的人工膜结构，内部形成封闭的囊泡结构，可以包裹水溶性的的药物，同时在脂质双分子层中也可以载入脂溶性药物。除了可以载药之外，脂质体还具有良好的生物相容性，经过DSPE-PEG2000等高亲水双性分子的修饰，延长其在血液中的循环时间，增加药物释放也作用时间。同时将靶向分子，如多肽，单抗等连接到脂质体上，制成具有主动靶向性的脂质体系统，能够识别靶细胞并且与细胞膜表面的受体分子结合，有利于脂质体内化，以促进药物在细胞内释放，从而提高药效。
[0008] 由此，将CD40L靶向多肽与脂质体载药结合，实现CD40/CD40L信号通路的阻断和杀伤高表达CD40L+T细胞的效果。这样可以达到与CD40L抗体同样的治疗效果，但又可以避免抗体带来的凝血副作用。
发明内容
[0009] 本发明的目的在于提供一种能够与CD40L蛋白特异性结合的配体多肽及药物输送系统。将该配体多肽与二硬脂酰甘油磷脂乙醇胺聚乙二醇马来酰亚胺连接，制成靶向合成材料，然后使用靶向合成材料进一步制备靶向脂质体，测定靶向合成材料和靶向脂质体对体内外细胞和CD40L高表达疾病模型的影响。
[0010] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0011] 第一方面，本发明涉及一种与CD40L蛋白特异性结合的配体多肽，包含SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列。
[0012] 优选地，所述配体多肽含有大于或等于两个如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
[0013] 优选地，所述配体多肽包括SEQ ID NO.1所示序列，以及在其C末端和/或N末端添加连接基团或连接用氨基酸序列。
[0014] 第二方面，本发明涉及一种前述的与CD40L蛋白特异性结合的配体多肽形成的游离型多肽、融合型多肽、嵌合类多肽、或以配体多肽为单体的聚合物。
[0015] 第三方面，本发明涉及一种药物输送系统，该系统包括：前述的与CD40L蛋白特异性结合的配体多肽、载药系统、至少一种活性物质。
[0016] 优选地，所述配体多肽能被连接于以下任一结构表面：纳米粒子、聚合物、脂质体、囊泡、固体脂质微粒、胶束、碳纳米管、细胞器、脂蛋白。
[0017] 优选地，所述载药系统具体为脂质体，其组成成分包括：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、心磷脂、鞘磷脂、脑苷脂，神经节苷脂、麦角固醇、胆固醇、阳离子脂质、溶血磷脂、聚乙二醇修饰的脂质、配体多肽修饰的脂质。
[0018] 优选地，所述至少一种活性物质为：抗肿瘤药物，抗代谢药物，纺锤体毒性生物碱，细胞毒性/抗肿瘤抗生素，拓扑异构酶抑制剂，光敏剂，激酶抑制剂，抗生素，抗菌素，抗炎药物，免疫抑制剂，抗感染药物，抗病毒药物，驱虫药，抗寄生虫的化合物，用于超声造影、放射造影、核医学造影剂的诊断试剂，目的基因、反义癌基因、自杀基因、细胞凋亡基因、细胞因子基因、或上述基因的组合，或含有上述基因的真核表达载体DNA。
[0019] 本发明具有如下有益效果：
[0020] （1）本发明的与CD40L蛋白特异性结合的配体多肽修饰过四氨基酸连接头后与二硬脂酰甘油磷脂乙醇胺聚乙二醇马来酰亚胺连接为合成材料，制备成的荧光脂质体在体外与CD40L高表达的细胞表现出很好的结合效果；经过荧光物质标记，该多肽在体内的分布基本与富含T细胞的淋巴结吻合。
[0021] （2）该配体多肽修饰过四氨基酸连接头后与二硬脂酰甘油磷脂乙醇胺聚乙二醇马来酰亚胺连接为合成材料，制备成的甲氨蝶呤脂质体在体外对CD40L阳性的细胞表现出更强的杀伤作用，在EAE动物模型中表现出了更好的治疗效果；该配体多肽修饰的聚乙二胺对CD40L高表达的细胞表现出更好的转染效果。
[0022] （3）本发明的与CD40L蛋白特异性结合的配体多肽不但具有传统抗体分子的优点，而且分子量小，组织穿透力强，具有很好的CD40L靶向作用，针对一些CD40L高表达的自身免疫性疾病可以开发为早期诊断试剂盒以及特异性的治疗药物，同时该多肽与脂质体结合还可以作为靶向药物载体，发展为针对自身免疫性疾病的靶向药物输送系统，实现更强的治疗效果。
附图说明
[0023] 图1为CD40L靶向多肽的制备流程图；
[0024] 图2为Cy5.5标记的CD40L靶向多肽及其对照肽随时间变化的体内分布图；
[0025] 图3为含2%多肽脂质的荧光脂质体结合Jurkat细胞株在CD40L表达上调前后的荧光强度示意图；
[0026] 图4为含2%多肽脂质的荧光脂质体与类风湿性关节炎病人关节积液中淋巴细胞结合的荧光强度示意图；
[0027] 图5为含2%多肽脂质的荧光脂质体与小鼠脾脏淋巴细胞在CD40L表达上调前后的荧光强度示意图；
[0028] 图6为含不同比例多肽脂质的荧光脂质体与EAE小鼠脾脏淋巴细胞结合的荧光强度示意图；
[0029] 图7为CD40L分子靶向多肽修饰甲氨蝶呤脂质体的对Jurkat细胞株的细胞毒性考察情况示意图；
[0030] 图8为EAE小鼠使用CD40L分子靶向多肽修饰甲氨蝶呤脂质体治疗临床评分变化情况示意图；
[0031] 图9为EAE小鼠使用CD40L分子靶向多肽修饰甲氨蝶呤脂质体治疗后外周血中CD40L阳性T细胞组成变化情况示意图。
具体实施方式
[0032] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0033] 本发明涉及一种与CD40L蛋白特异性结合的配体多肽，申请人同时考察了该多肽修饰的脂质体与CD40L高表达细胞的结合能力进行体外鉴定，制备荧光标记的多肽对其进行体内分布的考察，确证该多肽与CD40L高表达细胞特异性结合的能力。本发明涉及的CD40L分子特异性靶向多肽（即与CD40L蛋白特异性结合的配体多肽）得到的过程如图1所示：
[0034] 一、计算机辅助筛选CD40L靶向配体候选多肽
[0035] 使用上海计算机中心曙光A4000计算机组运算，基于CD40/CD40LX射线衍射晶体结构构建蛋白结合模型，构建与CD40L有结合倾向的多肽库，筛选靶向CD40L的多肽配体分子。
[0036] 1）使用SPDBV3.7，手动产生CD40L二聚体结构，用于结合筛选
[0037] 2）PSCAN2.2.2扫描二聚体结构表面，产生适合结合的口袋
[0038] 3）将CD40上对应结合口袋位置的多肽片段进行初步筛选，使用Autodock3.0.5利用拉马克遗传算法计算结合能量和对接能量并将其排序
[0039] 4）分析候选多肽各氨基酸对结合的氢键贡献，对候选多肽进行点突变，生成与CD40L二聚体有较强结合能力的偏向性多肽库，仍使用Autodock3.0.5利用拉马克遗传算法计算库中所有多肽结合能量和对接能量并将其排序，获得CD40L靶向多肽候选肽。
[0040] 二、CD40L候选多肽配体的SPR筛选
[0041] 使用GE healthcare的BIAcore X100，CM5芯片，使用竞争结合法，通过表面等离子共振技术产生的信号衰减程度，蛋白层面上来筛选靶向CD40L的多肽配体分子。
[0042] 1）按照芯片使用说明，将hCD40固定在CM5芯片上
[0043] 2）流动相中加入hCD40L，考察信号响应以反映CD40L和CD40的结合程度[0044] 3）流动相中同时加入hCD40L和一定比例的候选多肽，考察信号响应[0045] 4）根据结合响应信号强度，计算各个候选肽对CD40L的竞争百分比并排序，获得CD40L靶向多肽。
[0046] 三、多肽序列的合成
[0047] 候选多肽以及CD40L靶向性多肽ESEEED（简称JD6，如SEQ ID NO.1所示），具有相同电荷数的对照肽DSDDDE（简称JD6c）以及为了后续实验方便化学连接而设计的含有半胱氨酸末端的ESEEEDGGGC（如SEQ ID NO.2所示）以及DSDDDEGGGC多肽均由成都凯捷生物医药发展有限公司合成，均经过HPLC纯化和质谱鉴定，纯度大于95%，分子量与理论值相符。
[0048] 实施例1、CD40L靶向性多肽的衍生多肽及其制备方法
[0049] 本实施例涉及所述CD40L靶向性多肽的衍生多肽，其制备方法包括如下步骤：
[0050] 1）取1mg Cy5.5-NHS溶解于400μl DMSO（二甲亚砜），0.8mg多肽溶解于400μl DMSO；
[0051] 2）等体积混匀Cy5.5-NHS和多肽后在体系中加入15μl三乙胺，置于恒温震荡反应器中，室温，避光反应过夜；
[0052] 3）反应体系置于截留分子量为1000的透析袋中，使用PBS室温下避光透析，换三次水，除去DMSO，三乙胺和游离的Cy5.5-NHS；
[0053] 4）纯化后的CY5.5-多肽避光保存于-80摄氏度。
[0054] 效果验证，检测多肽JD6及其对照多肽JD6c在体内的分布情况。效果过程如下：将前述制备的多肽-Cy5.5溶液通过尾静脉注射入小鼠体内，每只小鼠注射Cy5.5标记的量为10ug，注射后按照不同的时间点，利用小动物活体荧光成像系统扫描多肽在小鼠体内的分布情况，扫描结果利用系统自带的分析软件进行处理及分析，如图2所示，由图2可知：多肽经过Cy5.5荧光标记之后，荧光的体内分布即代表多肽在体内的分布情况。图中使用伪彩表示荧光强度，红色荧光强度最高，紫色最低，以此提高图片的可读性。另外使用分析软件eXplore Optix OptiView 1.0.0.0，将各个时间点的扫描结果进行归一化，方便考察不同时间点小鼠各个部位的多肽分布和聚集程度。图2中可以看到多肽JD6在体内随时间的延长逐渐富集到上肢颈部胸部处的淋巴结，并且在这些淋巴器官保中持6个小时以上。作为对照多肽，JD6c在30分钟时，对照肽也跟JD6一样出现在一些淋巴结中，但明显在后续的时间点中，这些聚集的荧光消失了，说明对照多肽很快被身体清除了，并没有停留在淋巴结，这说明多肽JD6在小鼠的体内分布是具有淋巴系统特异性的。该结果跟淋巴系统中富含JD6靶向的T细胞的情况是完全吻合的。
[0055] 实施例2、具有CD40L靶向性的合成材料
[0056] 本实施例涉及一种具有CD40L靶向性的合成材料，该合成材料由CD40L分子特异性靶向多肽的衍生多肽与Mal-PEG2000-DSPE连接而得。所述CD40L分子特异性靶向多肽的序列为ESEEED，合成时在C端加上GGGC，进而得到衍生多肽，其序列为ESEEEDGGGC；该衍生多肽的半胱氨酸上游离的巯基就与马来酰亚胺基团反应而连接在DSPE-2000-Maleimide（二硬脂酰甘油磷脂乙醇胺聚乙二醇2000马来酰亚胺，其中的聚乙二醇也可选择PEG5000）上，得到具有CD40L靶向性的合成材料；进一步地，所述CD40L分子特异性靶向多肽也可直接与DSPE-2000Maleimide连接；得到另一种具有CD40L靶向性的合成材料。
[0057] 所述具有CD40L靶向性的合成材料（其中多肽为CD40L分子特异性靶向多肽）的制备包括如下步骤：
[0058] 1、称量DSPE-PEG2000-Maleimide脂质，加入氯仿至10mg/ml，于茄形瓶中溶解，氮气吹干，形成脂质薄膜；
[0059] 2、将1.5倍（摩尔比例）于脂质的多肽粉末在氮气保护下溶解于HEPES（羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲盐溶液）中，加入有脂质薄膜的茄形瓶中；
[0060] 3、恒温反应器中，氮气保护下10摄氏度反应过夜；
[0061] 4、反应体系转移到WMCO1000的透析袋中，使用去离子水透析过夜三次，得到具有CD40L靶向性的合成材料，即多肽-PEG-DSPE。
[0062] 实施例3、CD40L分子靶向多肽修饰荧光脂质体
[0063] 本实施例涉及一种荧光脂质体，该荧光脂质体为CD40L分子靶向多肽修饰荧光脂质体，其制备方法包括如下步骤：
[0064] 1）按照摩尔比例EPC（卵磷脂）:CHOL（胆固醇）:fluorescein DHPE（荧光素标记的1,2-棕榈酰磷脂酰乙醇胺）=60:40:1、70:30:1或80:20:1称取，充分溶解于叔丁醇中；
[0065] 2）在脂质叔丁醇溶液中，逐滴加入多肽-PEG-DSPE水溶液（实施例2制备），保持系统澄清至多肽脂质与fluorescein DHPE的摩尔比例分别为0.1:1，0.5:1，1:1，2:1，3:1，4:1,5:1；
[0066] 3）混匀多肽脂质和其他脂质成分，在液氮中迅速冻结，置于冻干机中-70摄氏度冻干；
[0067] 4）使用PBS迅速水合脂质组分，避光水浴超声30秒，制备脂质体；
[0068] 5）避光使用挤出仪将脂质体过200nm聚碳酸脂膜11次；
[0069] 6）使用激光粒度仪动态光散射法检测脂质体粒径和分布。
[0070] 效果验证：
[0071] （一）细胞培养实验
[0072] Jurkat，在含10%FBS（肽牛血清），青霉素(100units/ml)，链霉素(100mg/ml)，的Jurkat细胞1640培养基中培养，37度，5%CO2。
[0073] Jurkat使用12-o-十四烷酰佛波醋酸酯-13和离子霉素刺激，上调其CD40L的表达。使用6ng/ml的TPA以及1μg/ml的Ionomycine刺激Jurkat，在含20%FBS的RPIM1640培养基中37摄氏度5%CO2继续培养6小时，检测其CD40L的表达水平并进行后续实验。
[0074] 图3为含2%多肽脂质的荧光脂质体结合Jurkat细胞株在CD40L表达上调前后的荧光强度示意图，由图3可知：Jurkat细胞与PEG荧光脂质体结合的平均荧光强度为9.6，与对照多肽荧光脂质体结合的平均荧光强度为8.8，与JD6多肽荧光脂质体结合的平均荧光强度为13.4。JD6多肽荧光脂质体与正常Jurkat细胞的结合是最强的，而带同样电荷的对照多肽荧光脂质体的结合比PEG荧光脂质体还要弱一些，是因为本身带有的负电荷阻碍了与表面同样带有负电荷的细胞的结合过程。再次验证了，即使存在电荷干扰的情况，JD6多肽荧光脂质体依然与Jurkat细胞有着较强的结合。说明在细胞水平上，JD6的荧光脂质体与表达CD40L的细胞具有更强的结合能力。上调CD40L分子在细胞表面的表达后，PEG荧光脂质体以及对照多肽荧光脂质体与细胞的结合并没有增加，反而略有下降；但JD6荧光脂质体与该刺激后CD40L表达上调的Jurkat细胞结合强度大大增加了，明显提示JD6荧光脂质体与细胞的结合强度与CD40L的表达情况呈正相关，有力的说明了JD6修饰的脂质体与Jurkat细胞的结合是依赖JD6和CD40L的相互作用进行的。综上实验，说明多肽JD6及其修饰的脂质体与表达CD40L的细胞有着结合特异性，而这一结合特异性是与CD40L相关的。
[0075] （二）人关节积液中淋巴细胞的分离和培养实验
[0076] 1）取类风湿性关节炎病人的关节积液，加入100U/ml的透明质酸酶，37度水解15分钟；2）将水解后的关节积液1体积与1体积的PBS液混匀，加入离心管，其上覆盖1体积的人淋巴细胞分离液，室温1500rmp离心15分钟，收集层间白色细胞环带；3）1640培养基300g离心10分钟洗涤收集的淋巴细胞；4）在含10%FBS，青霉素(100units/ml)，链霉素(100mg/ml)，的RPMI1640培养基中培养，37度，5%CO2。
[0077] 图4为含2%多肽脂质的荧光脂质体与类风湿性关节炎病人关节积液中淋巴细胞结合的荧光强度示意图，由图4可知：针对10例病人关节积液中淋巴细胞的结合实验中，同样存在PEG脂质体与细胞的非特异性结合，但含有JD6修饰的脂质体与这些高表达CD40L的淋巴细胞的结合更强，而且比打乱序列的对照多肽高。该图反映了10例病人关节积液中淋巴细胞与荧光脂质体结合的平均值。虽然不同病人之间的细胞表达水平有所不同，但JD6荧光脂质体还是表现出了比对照组更高的结合强度，这再次说明JD6修饰的脂质体与从人体中分离的CD40L上调的淋巴细胞具有结合特异性，而且这一结合能力是通过多肽JD6和CD40L的相互作用介导的。
[0078] （三）小鼠的脾脏淋巴细胞的分离和培养实验
[0079] 1）将小鼠脱颈处死，浸泡于75%的乙醇中5分钟；2）在超净台中取出小鼠脾脏，过TM200目筛网，加入4-5mL EZ-Sep Mouse 1×淋巴细胞分离液研磨；3）将悬有脾脏细胞的分离液立即转移到15mL离心管中，其上覆盖200μl RPMI1640培养基；4）室温800g离心30分钟，将离心机的加速和减速设为3，使其缓慢加速和减速，提高分离效果；5）离心结束后，可在1640培养基和淋巴细胞分离液界面上看见清晰致密的白色环带，即为淋巴细胞层。用无菌吸管吸出该层细胞，再加入10ml1640培养基，混匀洗涤；6）室温300g离心10分钟，弃上清，将细胞重悬在1640培养基中，细胞计数；7）在含10%FBS，青霉素(100units/ml)，链霉素(100mg/ml)，的RPMI1640培养基中培养，37度，5%CO2；8）使用TPA和Ionomycine刺激，上调其CD40L的表达。使用6ng/ml的TPA以及1μg/ml的Ionomycine刺激脾脏淋巴细胞，在含20%FBS的RPIM1640培养基中37度5%CO2继续培养6小时，检测其CD40L的表达水平并进行后续实验。
[0080] 图5为含2%多肽脂质的荧光脂质体与小鼠脾脏淋巴细胞在CD40L表达上调前后的荧光强度示意图，由图5可知：由于鼠源的CD40L与人源的CD40L有较高的相似性，所以可以使用小鼠脾脏的淋巴细胞来考察JD6荧光脂质体结合与鼠源的CD40L结合情况。在小鼠淋巴细胞处于静息状态时，CD40L阳性的细胞较少，细胞上的表达量较低。使用各种荧光脂质体与静息淋巴细胞的结合情况差不多，PEG脂质体有一定的非特异性结合，JD6以及其打乱序列的对照多肽脂质体也并没有显著性的结合提高。当使用TPA以及Inomycine刺激淋巴细胞后，CD40L的表达上调，PEG荧光脂质体和对照多肽荧光脂质体与这些淋巴细胞的结合强度并没有变化，而JD6荧光脂质体的结合显著的增加了，说明JD6修饰可以促进脂质体对高表达CD40L细胞的结合，由此可以判断，多肽JD6及其修饰的脂质体对于表达鼠源CD40L的细胞也有基于CD40L的特异性结合。
[0081] （四）CD40L靶向多肽修饰荧光脂质体与细胞结合能力考察
[0082] 1）取各种待测细胞，4度预冷的1640培养基300g离心10分钟洗涤一遍，并用预6
冷的1640培养基调整细胞浓度至10 个/ml；2）各种待测细胞中加入10μM各类含有相同PEG百分比的荧光脂质体（普通PEG脂质体，JD6修饰脂质体，JD6c修饰脂质体），4度避光孵育2小时；3）冰上预冷的PBS300g离心10分钟洗涤细胞，洗涤3次，使用PBS重悬细胞；4）FACS检测FL-1通道荧光强度，判断荧光脂质体与细胞结合程度。
冷的1640培养基调整细胞浓度至10 个/ml；2）各种待测细胞中加入10μM各类含有相同PEG百分比的荧光脂质体（普通PEG脂质体，JD6修饰脂质体，JD6c修饰脂质体），4度避光孵育2小时；3）冰上预冷的PBS300g离心10分钟洗涤细胞，洗涤3次，使用PBS重悬细胞；4）FACS检测FL-1通道荧光强度，判断荧光脂质体与细胞结合程度。
[0083] 图6为含不同比例多肽脂质的荧光脂质体与EAE小鼠脾脏淋巴细胞结合的荧光强度示意图，由图6可知：由于小鼠EAE模型体内的淋巴细胞是高表达CD40L的，所以提取其淋巴细胞，可以在动物疾病模型中考察JD6修饰的脂质体是否针对CD40L有结合特异性。图中可以看到，0.5%JD6修饰的脂质体表现出不同于PEG和对照多肽脂质体的高结合强度。
同样百分含量下的PEG荧光脂质体与EAE小鼠淋巴细胞的结合率为6%，JD6修饰的荧光脂质体为14%，对照多肽荧光脂质体为8%。增加JD6在脂质体中的含量到2%，可以看到脂质体与淋巴细胞的结合显著的增加到了33%，而对应的PEG荧光脂质体与淋巴细胞的结合率没有明显变化。同时对照多肽荧光脂质体与淋巴细胞的结合率低于其在0.5%含量时的结合水平，分析应该是因为多肽本身带负电荷，增加多肽脂质在脂质体中的含量使得脂质体得负电性增加，导致与同样带负电荷的细胞结合减弱了。但带同样负电荷量的JD6修饰的荧光脂质体与高表达CD40L的EAE淋巴细胞的结合并没有因为负电荷的增加而减小，反而大大的增强了。由此可见，在小鼠疾病模型的细胞实验中，仍然观察到JD6及其修饰的脂质体特异性的通过CD40L结合CD40L高表达淋巴细胞的情况。
同样百分含量下的PEG荧光脂质体与EAE小鼠淋巴细胞的结合率为6%，JD6修饰的荧光脂质体为14%，对照多肽荧光脂质体为8%。增加JD6在脂质体中的含量到2%，可以看到脂质体与淋巴细胞的结合显著的增加到了33%，而对应的PEG荧光脂质体与淋巴细胞的结合率没有明显变化。同时对照多肽荧光脂质体与淋巴细胞的结合率低于其在0.5%含量时的结合水平，分析应该是因为多肽本身带负电荷，增加多肽脂质在脂质体中的含量使得脂质体得负电性增加，导致与同样带负电荷的细胞结合减弱了。但带同样负电荷量的JD6修饰的荧光脂质体与高表达CD40L的EAE淋巴细胞的结合并没有因为负电荷的增加而减小，反而大大的增强了。由此可见，在小鼠疾病模型的细胞实验中，仍然观察到JD6及其修饰的脂质体特异性的通过CD40L结合CD40L高表达淋巴细胞的情况。
[0084] 实施例4、CD40L分子靶向多肽修饰甲氨蝶呤脂质体
[0085] 本实施例涉及一种甲氨蝶呤脂质体，该甲氨蝶呤脂质体为CD40L分子靶向多肽修饰甲氨蝶呤脂质体，其制备方法包括如下步骤：
[0086] 1）按 照 摩尔 比 例DPPC（二棕 榈 酸磷 脂 酰胆 碱）:CHOL：JD6-PEG-DSPE（DSPE-PEG2000）（JD6-二硬脂酰甘油磷脂乙醇胺聚乙二醇2000）=56:42:2、55:20:0.1、70:30:3.5或80:45:5称取各物质；
[0087] 2）DPPC和CHOL充分溶解于叔丁醇中，之后在脂质叔丁醇溶液中逐滴加入JD6-PEG-DSPE水溶液，保持系统澄清；在含DSPEPEG2000的对照脂质体的制备过程中，直接将DSPE-PEG2000与其他脂质溶解于叔丁醇中；
[0088] 3）混匀多肽脂质和其他成分，在液氮中迅速冻结，置于冻干机中-70摄氏度冻干；
[0089] 4）甲氨蝶呤溶解于PBS中，浓度为1mg/ml；使用加热至60摄氏度的甲氨蝶呤溶液迅速水合脂质组分，60摄氏度水浴超声30秒，制成脂质体；加入的甲氨蝶呤与JD6-PEG-DSPE的摩尔比分别为10：2、1:0.1、200:3.5或400:5。
[0090] 5）液氮1分钟，60摄氏度水浴3分钟反复冻融脂质体，经过5个周期，将其制成大单层脂质体，提高脂质体包封率；
[0091] 6）使用加热至60摄氏度得挤出仪将脂质体过200nm聚碳酸脂膜11次；
[0092] 7）使用激光粒度仪动态光散射法检测脂质体粒径和分布；
[0093] 8）将CL-4B琼脂糖凝胶PBS洗两遍后旋转蒸发脱气，装填20ml色谱柱，PBS作为流动相8.4ml/分钟冲洗10个柱体积；
[0094] 9）加入200μl不含甲氨蝶呤空白脂质体饱和凝胶柱，5分钟时脂质体出峰，继续冲洗10个柱体积；
[0095] 10）200μl待纯化脂质体加样，保持流速，收集5分钟时的脂质体峰，为纯化后的MTX脂质体；
[0096] 11）继续洗脱，直至游离甲氨蝶呤出峰，继续冲洗10个柱体积，继续上样纯化其他脂质体。
[0097] 纯化后CD40L分子靶向多肽修饰甲氨蝶呤脂质体的表征如下表1所示：
[0098] 表1
[0099]平均粒径（nm） 多分散系数 甲氨蝶呤包封率
普通甲氨蝶呤脂质体 174.4 0.025 22.38%
JD6修饰甲氨蝶呤脂质体 193.9 0.117 20.16%
普通甲氨蝶呤脂质体 174.4 0.025 22.38%
JD6修饰甲氨蝶呤脂质体 193.9 0.117 20.16%
[0100] 由表1可知：制备的甲氨蝶呤脂质体经过200nm聚碳酸脂膜挤出以及琼脂糖凝胶纯化后，普通甲氨蝶呤脂质体的粒径约为180nm，多分散系数很小。多肽JD6修饰的甲氨蝶呤脂质体的粒径比非普通甲氨蝶呤脂质体略大，约为190nm，分布较普通甲氨蝶呤脂质体略宽（多分散系数为0.117）。这是因为多肽JD6修饰的甲氨蝶呤脂质体的表面有多肽修饰，多肽片段使得脂质体的水化层比不含多肽的脂质体要大，所以使用激光散射法测到的平均粒径要大一点。说明多肽JD6修饰的甲氨蝶呤脂质体制备成功，其外表面确实修饰有JD6多肽片段。同时可以看到，JD6修饰的甲氨蝶呤脂质体对药物甲氨蝶呤的包封率比非多肽修饰低一点，但并无很大的差别，可以认为JD6修饰的甲氨蝶呤脂质体和普通甲氨蝶呤脂质体在药物包裹方面并无无显著性差异，可以将两者对照使用进行后续的研究。
[0101] 效果验证：
[0102] （一）细胞培养实验
[0103] 细胞培养条件如下：Jurkat，在含10%FBS，青霉素(100units/ml)，链霉素(100mg/ml)，的Jurkat细胞1640培养基中培养，37度，5%CO2。之后进行CD40L分子靶向多肽修饰甲氨蝶呤脂质体的细胞毒性考察，包括如下步骤：
[0104] 1）按照每孔1*104个细胞接种于96孔板中，每孔100μl对应细胞的培养基；
[0105] 2）在各孔中分别加入不同浓度的的JD6修饰的甲氨蝶呤脂质体以及具有相同PEG百分含量的普通甲氨蝶呤脂质体，每个药物浓度3个复孔；
[0106] 3）各孔补加培养基，调整每孔中的体积一致，后续37度5%CO2培养细胞68个小时；
[0107] 4）各孔中加入10μl CCK反应底物，37度5%CO2培养细胞3个小时；
[0108] 5）酶标仪检测各孔OD450值，设定570nm为参比波长；
[0109] 6）使用无药物组的对照细胞OD450作为100%，换算各孔中细胞的数量，计算细胞存活百分比，考察各组药物的细胞毒性。
[0110] 如图7所示，由图7可知：普通甲氨蝶呤脂质体以及JD6修饰的甲氨蝶呤脂质体杀伤表达CD40L细胞的程度与其加入的量成正相关，随着药物甲氨蝶呤浓度的增加，细胞的存活率逐渐降低。在药物浓度较低（6nM到30nM）的时候，多肽JD6修饰的甲氨蝶呤脂质的细胞毒性是大于普通甲氨蝶呤脂质体的，这说明多肽甲氨蝶呤脂质体由于存在JD6靶向肽，使得针对Jurkat细胞的结合变强了，在药物浓度低的时候，根据脂质体上JD6与细胞表面CD40L的相互作用，可以更有针对性的杀伤表达CD40L的靶细胞。当药物浓度增加时，多肽修饰的甲氨蝶呤脂质体和普通甲氨蝶呤脂质体在培养过程中释放出来的游离药物都足以杀伤大量细胞（细胞存活率降至30%左右），因而在药物浓度较高（60nM到120nM）的时候，两种脂质体的细胞毒性没有明显差别。但在低浓度下的杀伤特异性，说明在治疗中通过JD6靶向介导制备的脂质体载药系统，就有可能使用更少的药物达到同样的治疗效果。
[0111] （二）CD40L分子靶向多肽修饰甲氨蝶呤脂质体对EAE小鼠的治疗验证[0112] 1、EAE小鼠模型的建立，包括如下步骤：
[0113] 1）多肽髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55溶解在PBS中，浓度为2mg/ml；PT溶解在PBS中，浓度为2μg/ml；
[0114] 2）去等体积的MOG35-55溶液与CFA混匀，在三通注射器中制备成乳剂，各将100μl乳剂注射在C57/BL6小鼠左右两侧腹股沟淋巴结附近，计时为造模的第0天；
[0115] 3）注射后第1天，对免疫后小鼠进行PT尾静脉注射，每只100μl；
[0116] 4）每天观察小鼠发病情况，给小鼠按照5分法评分标准（Kono法）进行评分。分级如下：0分为不发病；1分为尾巴无力；2分为轻微后肢无力；2.5分为单侧后肢严重麻痹；3分为双侧后肢严重麻痹；；3.5分为双侧后肢严重麻痹以及单侧前肢麻痹；4分为四肢麻痹；5分为濒死或死亡；
[0117] 5）绘制发病评分曲线，计算发病比例，考察造模情况，如图8所示，由图8可知：当小鼠出现典型的EAE造模成功的症状后，计时为治疗后的第0天，对其进行给药治疗，考察JD6多肽修饰的甲氨蝶呤脂质体的靶向治疗效果。各组EAE小鼠起始平均分都为2分，PBS组作为空白对照组可以指示无药物治疗的情况下，可以看到随着时间的延长，小鼠的发病情况逐渐严重，疾病评分曲线呈逐渐上升的趋势。在使用普通甲氨蝶呤脂质体治疗组中可以看到，EAE小鼠的发病评分都低于PBS对照组，说明使用甲氨蝶呤脂质体对小鼠进行治疗后还是有显著的疗效的。JD6多肽修饰的甲氨蝶呤脂质体和普通甲氨蝶呤脂质体的疗效比较，可以看到JD6多肽修饰的甲氨蝶呤脂质体的治疗效果都是优于普通甲氨蝶呤脂质体的。说明因为它具有CD40L靶向的作用，可以特异性的靶向并且抑制EAE小鼠中导致过度炎症的CD40L高表达T细胞。考虑到普通甲氨蝶呤脂质体上的PEG也具有一些非特异性的淋巴系统靶向效果，JD6多肽修饰的甲氨蝶呤脂质体的治疗效果仍能明显的优于普通甲氨蝶呤脂质体，也就是说在动物疾病模型的体内实验中，JD6介导的载药脂质体靶向高表达CD40L淋巴T细胞的效应强，对于CD40L高表达造成的疾病具有更好的治疗作用。
[0118] 2、CD40L分子靶向多肽修饰甲氨蝶呤脂质体对EAE小鼠的治疗效果验证方法，包括如下步骤：
[0119] 1）根据EAE小鼠发病曲线，当造模第18天时，小鼠发病评分已经趋于平缓，提示为造模成功给药时间点；
[0120] 2）按照2mg/Kg的甲氨蝶呤剂量尾静脉注射给药，在造模后第18天给药。将小鼠分为三组，每组10只小鼠，各组平均分都为2分，一组给JD6修饰的甲氨蝶呤脂质体，一组给具有相同PEG百分含量的普通甲氨蝶呤脂质体，一组给生理盐水，记为给药第1天；
[0121] 3）后续分别在第4、8、12、15、18天给药；
[0122] 4）每3天给EAE小鼠评分，观察其病情的发展变化；
[0123] 3、EAE小鼠体内淋巴细胞CD40L表达水平变化考察
[0124] 每组分别于第10天牺牲四只小鼠（每只评分均为2分），分离纯化其血液中的PBMC，对其CD3，CD40L分子进行标记，FACS检测各种细胞组分变化情况。如图9所示，由图9可知：外周血淋巴细胞中CD40L阳性T细胞的百分含量可以直接反映JD6多肽修饰的甲氨蝶呤脂质体是否针对性的杀伤高表达靶蛋白CD40L的T细胞。可以看到正常小鼠在外周血CD40L阳性细胞率约为0.01%，而EAE模型小鼠（疾病平均分2分）外周血中CD40L阳性细胞比例较高，为0.4%，比正常值高出非常多。当使用甲氨蝶呤脂质体对小鼠进行3次治疗后，到治疗中期，可以看到小鼠外周血淋巴细胞中CD40L阳性细胞的水平出现明显的变化。JD6修饰的甲氨蝶呤脂质体和普通甲氨蝶呤脂质体都降低了CD40L阳性率。而JD6修饰的甲氨蝶呤脂质体对CD40L阳性率的降低效果都比普通甲氨蝶呤脂质体要好。也就是说通过JD6靶向介导，多肽修饰后的甲氨蝶呤脂质体对CD40L高表达T细胞的杀伤效果要优于非靶向的脂质体，这一优势在治疗的中期就很明显的体现出来。该方法制备的CD40L靶向的载药脂质体可以在抑制造成疾病原因的CD40L高表达细胞，达成更好治疗疾病的效果。
[0125] 4、小鼠的脾脏以及淋巴结中淋巴细胞的分离和检测
[0126] 1）眼眶取血；
[0127] 2）将外周血置于15mL离心管下层，上层加入等体积淋巴结（身体两侧腹股沟淋巴结以及身体两侧腋下淋巴结）细胞的分离液，室温800g离心30分钟，将离心机的加速和减速设为3，使其缓慢加速和减速，提高分离效果；
[0128] 3）离心结束后，可在1640培养基和淋巴细胞分离液界面上看见清晰致密的白色环带，即为淋巴细胞层。用无菌吸管吸出该层细胞，再加入10ml1640培养基，混匀洗涤；
[0129] 4）室温300g离心10分钟，弃上清，将细胞重悬在1640培养基中，细胞计数；
[0130] 5）收集各种待测细胞，冰上预冷的FACS缓冲液重悬细胞，使用离心法洗涤两次，6
调整细胞浓度到10 个/100μl；
调整细胞浓度到10 个/100μl；
[0131] 6）小鼠来源的细胞中加入荧光标记的CD3，CD40L抗体，混匀，避光4℃孵育30分6
钟，预冷的FACS洗涤两次，1%多聚甲醛固定液重悬，调整浓度到将10 个/1ml；
钟，预冷的FACS洗涤两次，1%多聚甲醛固定液重悬，调整浓度到将10 个/1ml；
[0132] 7）FACS于FL-1/FL-2通道检测对应荧光标记的各分子的表达程度。
[0133] 综上所述，本发明的具有与表达CD40L分子的细胞特异性结合的多肽与DSPEPEG材料连接后，组装到脂质体上，该靶向多肽修饰的脂质体在体外可以很好的与表达CD40L的细胞结合。用多肽DSPE-PEG连接材料修饰包裹甲氨蝶呤的脂质体，可以在体外更有效的抑制CD40L阳性细胞的活性，同时在实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型中，表现出治疗效果。