一株无毒ST28猪链球菌及其应用转让专利
申请号 : CN201210413985.1
文献号 : CN102876620B
文献日 : 2014-01-08
发明人 : 吕立新 , 周俊明 , 张雪寒 , 茅爱华 , 何孔旺 , 倪艳秀 , 虞凤 , 祝昊丹 , 俞正玉 , 温立斌 , 李彬 , 郭容利 , 王小敏 , 汪伟 , 周萍 , 沈江萍
申请人 : 江苏省农业科学院
摘要 :
本发明涉及一株无毒ST28猪链球菌及其应用，属生物技术领域。采集健康屠宰猪的扁桃体样品，增菌处理后提取细菌的DNA，应用聚合酶链式反应鉴定cps2j基因，随后经过细菌平板分离获得纯培养细菌，对纯培养细菌进行革兰氏染色、血清凝集和聚合酶链式反应、多位点序列分型，确定分离到猪链球菌2型菌株及其序列型；经过Balb/c小鼠、新西兰兔、长白仔猪的动物实验，证实该菌HA0609为无毒菌株。该菌1次肌肉注射新西兰兔、2次腹腔注射CD1小鼠后，能够提供受免动物一定的免疫能力，对HA0609免疫保护性抗原的分析，能用于猪链球菌病亚单位疫苗的研制。
权利要求 :
1.一株无毒ST28猪链球菌，该菌株HA0609分类命名：猪链球菌（Streptococcus suis），2012年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉 武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2012394。
2. 权利要求1所述的无毒ST28猪链球菌在猪链球菌病亚单位疫苗研制中的应用。
3.用权利要求1所述的无毒ST28猪链球菌制备的猪链球菌病亚单位疫苗。
说明书 :
一株无毒ST28猪链球菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及到一株无毒ST28猪链球菌及其应用，具体说是一株无毒ST28猪链球菌（Streptococcus suis）的分离、鉴定方法，以及该菌在猪链球菌病疫苗研制中的应用，属生物技术领域。
背景技术
[0002] 猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2，S. suis 2）是一种重要的人畜共患病病原体，可以引起猪发生脑膜炎、败血症、关节炎等症状，病死率高达40%，如与猪呼吸与繁殖综合征并发，死亡率更高，即使病后能够存活的猪，其生长缓慢，料肉比增加，给养猪业带来极大的经济损失，故该菌对全球的养猪生产是一个潜在的威胁。S. suis 2可以通过伤口、消化道感染人，1998年和2005年分别在我国江苏和四川发生猪链球菌病的暴发，并且均发生人感染死亡的病例，引起人们的高度关注。目前针对猪链球菌病，尚无适用人群的疫苗，所以预防猪发生猪链球菌病，不仅仅是对猪的保护，更是对人的保障。
[0003] 依据动物疫病“以防代治”的理念，免疫疫苗是猪链球菌病防控的关键，传统的疫苗包括灭活疫苗和减毒活疫苗，灭活疫苗是将细菌通过灭活处理获得的全菌体死疫苗，灭活疫苗优点是生产方便，稳定、易保存，缺点是需要多次免疫、免疫剂量大并且免疫部位出现损伤。减毒活疫苗的优点是只需接种一次，接种剂量少，且免疫保护期长，缺点是不稳定、难保存，并且有可能出现毒力返强。上述两类疫苗是菌体疫苗，抗原成份比较复杂，除了保护抗原外，可能含有更多的无效抗原，而无效抗原的存在会干扰机体对保护性抗原的应答，有时会引起严重的副作用。
发明内容
[0004] 技术问题
[0005] 针对上述传统疫苗的不足，本发明提供一株无毒ST28猪链球菌的分离、鉴定及应用，从健康屠宰猪群中分离一株无毒ST28猪链球菌，为S. suis 2毒力因子研究及猪链球菌保护性抗原筛选奠定基础。
[0006] 技术方案
[0007] 本发明经过聚合酶链式反应、革兰氏染色、血清凝集试验和多位点序列分型（MLST），证实所分离的猪链球菌为ST28猪链球菌，命名该菌为HA0609。
[0008] 通过Balb/c小鼠、新西兰兔、长白仔猪的动物实验，结果HA0609不引起上述试验动物发病，并且接种长白仔猪不引起组织病理变化，而以05年四川分离的强毒株ZY05719为对照，等量接种实验动物后，均能引发动物发病、死亡，证实HA0609菌株为无毒菌株。
[0009] 细菌特征：该菌属于球菌科、链球菌属，为革兰氏阳性菌，兼性厌氧，呈卵圆形，排列成链状或成双，5%绵羊血THB琼脂平板上37℃培养18～24小时，可长成直径1～2毫米，灰白色，表面光滑，边缘整齐的小菌落，不溶血。
[0010] 该菌1次肌肉注射新西兰兔、2次腹腔注射CD1小鼠后，能够提供受免动物一定的免疫能力，对HA0609免疫保护性抗原的分析，可用于猪链球菌病亚单位疫苗的研制。
[0011] 有益效果
[0012] 本发明的突出优点：
[0013] 1. HA0609对多种实验动物均无致病力，且对长白仔猪不造成病理损伤；
[0014] 2. HA0609分离自健康猪的扁桃体组织，能够定植于猪扁桃体组织，持续刺激机体的免疫系统，使机体应答产生抗体。
[0015] 3．该菌1次肌肉注射新西兰兔、2次腹腔注射CD1小鼠后，能够提供受免动物一定的免疫能力，对HA0609免疫保护性抗原的分析，可用于猪链球菌病亚单位疫苗的研制。
[0016] 生物保藏
[0017] 该菌株HA0609分类命名：猪链球菌（Streptococcus suis），2012年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉 武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2012394。
附图说明
[0018] 图1为免疫HA0609新西兰兔静脉注射强毒株ZY05719后存活率分析图，1为免疫PBS对照组，2为免疫HA0609组，﹡表示存在统计学显著差异；
[0019] 图2为免疫HA0609的CD1小鼠腹腔注射强毒株SS2-1后存活率分析图，1为免疫PBS对照组，2为免疫HA0609组，﹡﹡表示存在统计学极显著差异。
具体实施方式
[0020] 材料：
[0021] PCR Mix（广州东盛生物科技有限公司）
[0022] DNA胶回收试剂盒（Axygen公司）
[0023] 猪链球菌2型强毒株ZY05719（沈艳，华修国，崔 立 ，朱建国，杨志彪，猪链球菌2型两代表性分离株感染小型猪后对部分免疫指标的影响，畜牧兽医学报2008，39(12)：
1721—1730，分离自四川资阳发病猪，由南京农业大学预防兽医微生物组惠赠）[0024] BactoTM Todd Hewitt Broth（THB）培养基（BD公司）
1721—1730，分离自四川资阳发病猪，由南京农业大学预防兽医微生物组惠赠）[0024] BactoTM Todd Hewitt Broth（THB）培养基（BD公司）
[0025] THB液体培养基：称取30g THB，溶解于1000mL去离子水，121℃高压灭菌20分钟[0026] THB固体培养基：每1000mL THB加入15g琼脂粉，121℃高压灭菌20分钟，适量倾入平皿中凝固
[0027] （一）本发明从健康屠宰猪群中分离获得一株无毒ST28猪链球菌：
[0028] 1）增菌培养
[0029] 采集健康屠宰猪的扁桃体组织，切割约0.05立方厘米的扁桃体，放入5mL THBTM（Bacto Todd Hewitt Broth）液体培养基，37℃静置培养16～18小时；
[0030] 2）细菌的纯培养
[0031] 对上述培养的菌液进行离心，常规方法提取菌体的总DNA作为模板，设计荚膜多糖2J位点编码基因（cps2j）的特异性引物，对上述模板进行聚合酶链式反应（PCR）鉴定，将反应阳性的菌液经过平板划线法分离到纯培养的细菌，再次增菌培养、革兰氏染色、PCR、凝集实验，确定分离到猪链球菌2型菌株；
[0032] 3）细菌的序列型（Sequence Type，ST）鉴定
[0033] 提取上述纯培养的猪链球菌2型菌株的总DNA，聚合酶链式反应（PCR）扩增7个管家基因（aroA、cpn、dpr、gki、mutS、recA、thrA），并对扩增片段进行测序，多位点序列分型（Multi Locus Sequence Type，MLST）鉴定分离菌株为ST28，命名为HA0609；
[0034] （二）动物实验
[0035] （1）Balb/c小鼠致病力试验
[0036] 选用6周龄清洁级Balb/c小鼠16只，随机分为2组，8只/组，体外培养所述的9
HA0609，采用1.0×10CFU剂量对1组Balb/c小鼠进行腹腔注射，同时培养2005年四川分离的猪链球菌强毒株ZY05719，相同剂量腹腔注射另外1组Balb/c小鼠作为对照，攻毒后连续观察10天，发现HA0609注射的小鼠精神、饮食正常，而ZY05719注射组小鼠24小时内全部死亡；
HA0609，采用1.0×10CFU剂量对1组Balb/c小鼠进行腹腔注射，同时培养2005年四川分离的猪链球菌强毒株ZY05719，相同剂量腹腔注射另外1组Balb/c小鼠作为对照，攻毒后连续观察10天，发现HA0609注射的小鼠精神、饮食正常，而ZY05719注射组小鼠24小时内全部死亡；
[0037] （2）新西兰兔致病力试验
[0038] 选用10只3公斤体重清洁级新西兰兔，随机分成2组，5只/组，其中1组耳缘静9
脉注射1.0×10CFU剂量HA0609，同时给予另1组耳缘静脉注射同等剂量ZY05719，攻毒后连续观察10天，发现HA0609注射的实验兔精神、饮食正常，而ZY05719注射组实验兔24小时内全部死亡；
脉注射1.0×10CFU剂量HA0609，同时给予另1组耳缘静脉注射同等剂量ZY05719，攻毒后连续观察10天，发现HA0609注射的实验兔精神、饮食正常，而ZY05719注射组实验兔24小时内全部死亡；
[0039] （3）长白仔猪致病力试验
[0040] 选用6头长白仔猪，随机分成2组，3头/组，其中1组颈部肌肉注射1.0×109CFU剂量HA0609，同时给予另1组颈部肌肉注射同等剂量ZY05719，攻毒后连续观察10天，发现HA0609注射的仔猪精神、体温、饮食正常，剖检未见组织病理变化，而ZY05719注射的仔猪饮食废绝、直肠温度超过40.5℃、部分出现划水神经症状，3头仔猪于攻毒后24～72小时发生死亡，剖检发现部分猪发生脑膜炎，肺脏坏死、心包积液、多发性浆膜炎等现象；
[0041] 上述结果表明，分离的HA0609为无毒ST28猪链球菌。
[0042] （三）应用前景
[0043] HA0609以2×108 CFU剂量 肌 肉注 射4 只新 西 兰兔，同 时以 PBS（8mM Na2HPO4·12H2O、1.5mM KH2PO4、2.7mM KCl、136.7 mM NaCl，pH 7.4）注射作对照，免疫后40天6
静脉注射2×10 CFU剂量ZY05719，观察免疫组及对照组的存活率，并进行统计分析免疫组与对照组存活率差异，发现免疫HA0609能够显著推迟新西兰兔的死亡时间（图1）；HA0609
9
以1×10 CFU剂量腹腔注射9只CD1小鼠（吴 涛等，猪链球菌2型srtA基因缺失菌株的构建及生物学特性，中国兽医学报，2009年1O月 第29卷第1O期），进行两次注射，之间间隔14天，同时以PBS注射作对照，末次注射后10天，对免疫组小鼠和对照组小鼠腹腔注射
9
1×10 CFU剂量强毒株SS2 -1(倪艳秀等，猪链球菌2型SS2-1和SS2-H株的培养稳定性检测，中国兽医科技 第32卷 第4期 2002年)，发现免疫组小鼠存活率为87.5%，而对照组小鼠全部死亡，两组之间的存活率统计学差异极显著（图2）。
静脉注射2×10 CFU剂量ZY05719，观察免疫组及对照组的存活率，并进行统计分析免疫组与对照组存活率差异，发现免疫HA0609能够显著推迟新西兰兔的死亡时间（图1）；HA0609
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以1×10 CFU剂量腹腔注射9只CD1小鼠（吴 涛等，猪链球菌2型srtA基因缺失菌株的构建及生物学特性，中国兽医学报，2009年1O月 第29卷第1O期），进行两次注射，之间间隔14天，同时以PBS注射作对照，末次注射后10天，对免疫组小鼠和对照组小鼠腹腔注射
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1×10 CFU剂量强毒株SS2 -1(倪艳秀等，猪链球菌2型SS2-1和SS2-H株的培养稳定性检测，中国兽医科技 第32卷 第4期 2002年)，发现免疫组小鼠存活率为87.5%，而对照组小鼠全部死亡，两组之间的存活率统计学差异极显著（图2）。
[0044] 综上，该菌1次肌肉注射新西兰兔、2次腹腔注射CD1小鼠后，能够提供受免动物一定的免疫能力，对HA0609免疫保护性抗原的分析，可用于猪链球菌病亚单位疫苗的研制。